全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（4）：739–748 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–01；修回日期：2013–01–11
基金项目：国家自然科学基金项目（31100086）；山东果树研究所所长科研基金项目（2012KY06）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangcj@sdip.cn；yaoyx@sdau.edu.cn）
苹果 NAD–苹果酸酶基因的克隆及在不同组织
和果实发育阶段的表达分析
董庆龙 1，余贤美 1，刘丹丹 2，王海荣 1，安 淼 1，姚玉新 2,*，王长君 1,*
（1 山东省果树研究所，山东泰安 271000；2山东农业大学园艺科学与工程学院，国家苹果工程技术研究中心，作物
生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：NAD-malic enzyme（NAD-ME）是植物调控苹果酸代谢中的关键酶。以富士苹果（Malus ×
domestica Borkh.）叶片为试材，通过同源比对和 RT-PCR 技术，克隆获得 2 个 NAD–苹果酸酶基因
（MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2）。其 ORF 分别为 1 785 bp 和 1 818 bp，推测其分别编码 595 和 605 个氨
基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示，含有 5 个保守的氨基酸区域（Ⅰ~Ⅴ），包含 2 个功能结构域：
malic 和 NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示，MdNAD-ME1 属于 α 组双子叶亚组，MdNAD-ME2
属于 β 组双子叶亚组。荧光实时定量结果显示，MdNAD-ME 在被检测的组织中呈组成型表达，且在多种
组织中MdNAD-ME1表达量高于MdNAD-ME2。在富士苹果果实不同发育阶段，MdNAD-ME1与MdNAD-ME2
具有不同的表达模式。以上结果表明，克隆得到的 MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2 属于植物 NAD-ME，在
苹果的生长和发育过程中 MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2 可能起到不同作用。
关键词：苹果；苹果酸酶；克隆；序列分析；表达分析
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）04-0739-10

Cloning of NAD-Malic Enzymes and Their Expression Analysis During
Tissues and Fruit Development of Apple
DONG Qing-long1，YU Xian-mei1，LIU Dan-dan2，WANG Hai-rong1，AN Miao1，YAO Yu-xin2,*，and
WANG Chang-jun1,*
（1Shandong Institute of Pomology，Tai’an，Shandong 271000，China；2College of Horticulture Science and Engineering，
Shandong Agricultural University，National Research Center for Apple Engineering and Technology，State Key Laboratory
of Crop Biology，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：NAD-malic enzyme is a key enzyme in malic acid metabolism pathway of plants. Two
apple NAD-ME genes（MdNAD-ME1 and MdNAD-ME2）were isolated from the‘Fuji’apple leaves
（Malus × domestica Borkh.）by homologous comparison and RT-PCR confirmation. MdNAD-ME1 and
MdNAD-ME2 contained 1 785 bp and 1 818 bp ORFs，which encoded 595- and 605-aa proteins，
respectively. Amino acid sequence and structure analysis indicated that MdNAD-MEs contained five
conservative amino acid areas（Ⅰ–Ⅴ）and two functional structure domains：Malic and NAD_bind_1_
malic_enz. The result of phylogenetic analysis showed that MdNAD-ME1 belonged to dicotyledon

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subgroup of α group，while MdNAD-ME2 belonged to dicotyledon subgroup of β group. qRT-PCR result
showed that MdNADP-MEs were constitutively expressed in all examined tissues，and the expression level
of MdNAD-ME1 were higher than of MdNAD-ME2 during more tissues. MdNAD-ME1 and MdNAD-ME2
had different patterns of expression during fruit development of‘Fuji’apple. Taken together，the above
results indicated that MdNAD-MEs belonged to NAD-ME family，and MdNAD-ME1 and MdNAD-ME2
might play different roles in the growth and development of apple.
Key words：apple；malic enzyme；cloning；sequence analysis；expression analysis

苹果酸酶（Malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，还参与其它多种代谢途径（Tronconi
et al.，2010）。该酶能在二价金属离子存在的条件下，与氧化型辅酶 NAD（P）结合，催化苹果酸氧
化脱羧生成丙酮酸盐和二氧化碳，伴随 NAD（P）还原（Detarsio et al.，2004；Bologna et al.，2007）。
苹果酸酶广泛存在于动植物中（Wheeler et al.，2005）。根据辅酶因子不同，植物苹果酸酶可分为 NAD
依赖苹果酸酶（NAD-ME；EC 1.1.1.39）和 NADP–苹果酸酶（NADP-ME；EC 1.1.1.40）（刘畅 等，2011）。
Long 等（1994）在 Amaranthus hypochondriacum 中克隆出了 NAD-ME α和 β两个亚基全长 cDNA
序列，随后在马铃薯（Winning et al.，1994）、杨树（Tuskan et al.，2006）、拟南芥（Tronconi et al.，
2008）、玉米（Soderlund et al.，2009）、高粱（Paterson et al.，2009）、大麦（Matsumoto et al.，2011）
和水稻（Zhou et al.，2011；周滈 等，2011）中克隆得到了两个 NAD-ME 全长 cDNA 序列。植物
NAD-ME 根据系统发育被分为 α 组和 β 组。NAD-ME1 属于 α 组，编码大约 62 kD 的蛋白，NAD-ME2
属于 β 组，编码大约 58 kD 的蛋白。它们以 1︰1 的摩尔比率组成 NAD-ME（Tronconi et al.，2008）。
在苹果果实中，苹果酸的积累受到苹果酸代谢关键酶的调控。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）
和苹果酸脱氢酶（MDH）主要催化苹果酸的合成；苹果酸酶（ME）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶
（PEPCK）催化苹果酸的降解（姚玉新 等，2010）。但是目前关于苹果 NAD-ME 在苹果酸代谢的
相关机制还不清楚。本研究中克隆得到两个苹果 NAD-ME 基因，对其序列进行了生物信息学分析，
并检测了其在苹果不同组织中的表达特性和果实不同发育阶段的表达模式，以期为进一步研究
NAD-ME 在苹果果实苹果酸降解和积累方面奠定相关分子基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为山东农业大学果树试验园 12 年生富士苹果树（Malus × domestica Borkh.）。2011 年
4 月底取新根系、一年生的枝条（茎）、新叶、花（盛花期）和果实（花后 30、60、90、120、150 d），
于液氮中速冻，–80 ℃保存备用以便提取 RNA。
工程菌 Escherichia coli DH5α 购自北京天根公司，反转录试剂盒、克隆载体 pMD18-T、凝胶回
收试剂盒和 LA Taq DNA Polymerase 高保真聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。
在山东省果树研究所中心实验室进行基因克隆和组织表达以及果实表达分析。
1.2 基因克隆与序列分析
采用热硼酸法提取总 RNA（Yao et al.，2007），用反转录试剂盒 PrimeScriptTM 1ST Strand cDNA
SynthesisKit 合成 cDNA。以拟南芥 NAD-ME1-2 的 cDNA 序列为信息，比对苹果基因组数据库，得
到 MDP000073044 和 MDP0000231868 两个预测的 cDNA 序列（http：//genomics. research. iasma.
it/gb2/gbrowse/apple/）。设计特异性引物（表 1）进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；
4 期 董庆龙等：苹果 NAD–苹果酸酶基因的克隆在不同组织和果实发育阶段的表达分析 741

94 ℃ 50 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。回收 PCR 产物，并连
接到 pMD18-T 载体上，构建重组质粒转化 E. coli DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆，送往北京六合
华大基因科技股份有限公司测序。
根据所得 cDNA 片段，利用 NCBI 网站的 BLASTp 程序进行同源序列比对；DNAman 软件分析
基因的 ORF 和氨基酸序列；MEGA4.1 和 Clustal 1.8.1 软件进行系统进化树构建。利用 Pfam 26.0
（http：//pfam. sanger. ac. uk/）和 NCBI 中 Conserved Domains（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/
cdd/wrpsb. cgi）程序进行蛋白保守域结构预测。利用在线软件 PSORT（http：//psort. hgc. jp/form. html）
和 SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1. softberry. com/berry. phtml）进行亚细胞定位预测。利用
PredictProtein 在线软件（http：//www. predictprotein. org/）进行蛋白质二级结构预测；利用 SWISS-
MODEL 在线软件（http：//swissmodel. expasy. org/）进行蛋白质三维结构预测。
1.3 苹果 NAD-ME 的组织表达
参照 Dong 等（2011）的方法，依据 MdNAD-ME 的 3′-UTR 设计荧光定量引物 RQ-MdNAD-ME
（表 1），选取 Md18S 为内参基因，采用三步法进行荧光定量 PCR。使用的仪器为 BIO-RAD IQ5
（USA），所有 PCR 反应都设 3 次重复。PCR 反应体系为：SYBR Green Master 10 μLⅠ ，上、下游
引物（5 μmol · L-1）各 1 μL，模板 1 μL，加去离子水至 20 μL。PCR 反应程序为：95 ℃预变性 3 min；
95 10 s℃ ，58 30 s℃ ，72 15 s℃ ，40 个循环；最后退火至 55 ℃，每隔 7 s 上升 0.5 ℃至 95 ℃，共
81 个循环。试验结果用 2–ΔΔCT 法对数据进行定量分析（Livak & Schmittgen，2001）。
表 1 引物用途及序列
Table 1 Application of primers and sequence
用途 Use 引物名称 Primer name 5′–3′序列 Sequence
ORF 扩增 MdNAD-ME1-F AGATCATTCACTACAACCGAGGGCCA
Complete ORF amplification MdNAD-ME1-R TTCGTTTCTGTAAACCAGTGTCGGGT
MdNAD-ME2-F ATGTGGAAGGCAGCGCGATTCGCCG
MdNAD-ME2-R TCATTTTTCGTGAACTAGAGGGCT
荧光定量 PCR RQ-MdNAD-ME1-F CCCACAGACGAGAAGTGTTG
Fluorescent quantitative PCR RQ-MdNAD-ME1-R TCTCACAAGAACCCGCTAAGA
RQ-MdNAD-ME2-F GTGGTTCCCGGTTTACAGC
RQ-MdNAD-ME2-R GCTTGACTGCAGAACTACCG
RQ-Md18S-F TGAATACAAATTATTGGTGGGAAA
RQ-Md18S-R CCTTTGGTTTTTCGCATCTC
2 结果与分析
2.1 苹果 MdNAD-ME 基因克隆
以拟南芥的苹果酸酶 1、2 基因（AtNAD-ME1：AT2G13560；AtNAD-ME2：AT4G00570）cDNA
序列为信息探针，对苹果基因组网站（http：//genomics. research. iasma. it/gb2/gbrowse/apple/）进行
BLAST 搜索，得到 2 个 cDNA 序列，分别是：MDP000073044 和 MDP0000231868。其基因组结构
示意图见图 1：MDP000073044 包含 19 个外显子和 18 个内含子，总长度 5 925 bp；MDP0000231868
包含 18 个外显子和 17 个内含子，总长度 11 754 bp。MDP000073044 和 MDP0000231868 染色组、
ORF 大小、编码氨基酸数量、蛋白分子量和等电点分别为：Chr 7、1 773 bp、591 个、65.76 kD、5.46；
Chr 7、1 893 bp、630 个、69.47 kD、7.57。以上述 2 个 cDNA 序列为模板设计特异引物（表 1），经
PCR 扩增，获得特异性条带。测序结果显示片段长度分别为：1 785 bp 和 1 818 bp，分别编码 595
个和 605 个氨基酸；其蛋白分子量分别为 66.3 kD 和 66.7 kD；等电点分别为 5.18 和 7.38。
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图 1 MDP0000073044 和 MDP0000231868 基因组序列结构示意图
Fig. 1 Schematic diagram of：MDP0000073044 and MDP0000231868 genome sequences
2.2 MdNAD-ME 序列同源性分析
将上述 cDNA 编码氨基酸序列提交 NCBI-BLASTp 在线对比结果发现：MDP000073044 与杨树
NAD-ME（XP_002302483）同源性最高，达到 91%，与蓖麻（XP_002526507）、蒺藜（XP_003626824）
和葡萄（XP_002265765）NAD-ME 同源性为 89%；MDP0000231868 与蓖麻 NAD-ME（XP_002511819）
同源性最高，达到 88%，与杨树（XP_002301340）、葡萄（XP_002266697）和蒺藜（XP_003627605）
NAD-ME 同源性分别为 87%、86%和 85%。
DNAman 软件氨基酸序列比对结果显示，MDP000073044 和 MDP0000231868 蛋白序列均具有
植物 NAD-ME 保守的 5 个氨基酸区域（图 2），这 5 个保守的氨基酸区域是植物体中 NAD-ME 蛋白




























图 2 苹果（Md）、葡萄（Vv）和拟南芥（At）NAD-ME 所编码氨基酸同源性比对
Fig. 2 Homology comparison of the deduced amino acid sequence alignment of MdNAD-MEs with AtNAD-MEs and VvNAD-MEs
MdNAD-ME1：JX971881；MdNAD-ME2：JX971882；AtNAD-ME1：AT2G13560；AtNAD-ME2：AT4G00570；
VvNAD-ME1：XP_002265765；VvNAD-ME2：XP_002266697.
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典型的特征。因此，将 MDP000073044 和 MDP0000231868 分别命名为 MdNAD-ME1（GenBank
accession No. JX971881）和 MdNAD-ME2（GenBank accession No. JX971882）。
2.3 MdNAD-ME 序列进化树分析
利用 MEGA4.1 和 Clustal 1.8.1 软件构建 MdNAD-ME 与其他植物 NAD-ME 进化树分析结果表
明，植物 NAD-ME 很明显被分为 α 亚组和 β 亚组，进一步被分为双子叶和单子叶两个小亚组。其
中 MdNAD-ME1 与葡萄 NAD-ME1（VvNAD-ME1）亲缘关系最近，同属于 α 亚组双子叶小组；
MdNAD-ME2 与大豆 NAD-ME2（GmNAD-ME2）亲缘关系最近，同属于 β 亚组双子叶小组（图 3）。


图 3 苹果 NAD-ME 系统进化分析
Bootstrap 置信度百分率（%）在节点标明。
Fig. 3 The phylogenetic relationships of MdNAD-MEs from various organisms
Bootstrap majority consensus values（%）are indicated at each branch point in percent.

2.4 MdNAD-ME 亚细胞定位预测
利用在线预测软件 PSORT 和 SoftBerry ProtComp 9.0 进行亚细胞定位（李节法 等，2010；胡宏
敏 等，2012）。结果显示，MdNAD-ME1：线粒体（7.89：确定性程度数值越高表示可信度越大），
叶绿体（1.78）；MdNAD-ME2：线粒体（9.67），质膜（0.12），高尔基体内膜（0.1）。由此判断，
MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2 应该定位于线粒体中。
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2.5 MdNAD-ME 功能结构域分析
利用 Pfam 26.0 和 NCBI 中保守结构域分析程序（conserved domains）对 MdNAD-ME 进行蛋白
质保守结构域分析，结果表明 MdNAD-ME 含有两个结构域：malic 和 NAD_bind_1_malic_enz（图 4）。
malic 是苹果酸酶和 N–末端区域（Malic enzyme，N-terminal domain）；NAD_bind_1_malic_enz 是
苹果酸酶 NAD（P）绑定区域和亚组 1[binding domain of malic enzyme（ME），subgroup 1]，它存在
于所有的物种中，在光合作用和脂类合成等多种代谢中起到重要作用。同时植物 NAD-ME 的 5 个保
守氨基酸区域（Ⅰ~Ⅴ），苹果 NAD-ME 同样存在（图 4）。将 MdNAD-ME 的保守区域（Ⅰ~Ⅴ）与
74 个 NAD-ME 基因进行同源性比较，结果表明 MdNAD-ME 与其它 NAD-ME 蛋白在结构域上保守
性非常高。
2.6 MdNAD-ME 二级和三维结构分析
利用 PredictProtein 在线软件分析 MdNAD-ME 的二级结构。结果表明，有多个氨基酸残基参与
了 α–螺旋和无规则卷曲等二级结构（表 2）。

表 2 MdNAD-ME 的二级结构预测
Table 2 Secondary structure prediction of MdNAD-ME
MdNAD-ME
氨基酸数量
Number of amino acid
α–螺旋/%
Alpha helix
无规则卷曲/%
Random coil
延伸链/%
Extended strand
MdNAD-ME1 595 40.2 48.9 10.9
MdNAD-ME2 605 38.3 51.9 9.8

同源建模是一种从蛋白质的氨基酸序列出发，建立 3D 模型的计算方法。建立一个成功的模型
需要至少一个已经通过实验测定的蛋白质 3D 结构，并且该蛋白质的氨基酸序列应与目标序列有显
著的相似性。本研究中利用 SWISS-MODEL 在线软件分析发现数据库中人线粒体 NAD-ME 晶体结
构已经探明（Yang et al.，2002），并且 MdNAD-ME 的蛋白序列与之相似性较高，因此，以人线粒
体 NAD-ME 晶体结构为模板，对 MdNAD-ME 的三维结构进行预测。MdNAD-ME 三维结构包括
malic 和 NAD_bind_1_malic_enz 两个结构域（图 5），蛋白标识序列号（PDB-code）= 1gz3C，均方
根偏差（RMSD）= 2.30 Å。MdNAD-ME1 从氨基酸残基 14 ~ 593 与模板有 39.17%序列相同；
MdNAD-ME2 从氨基酸残基 30 ~ 605 与模板有 38.93%序列相同。
以上数据可以说明，克隆得到的 MdNAD-ME 是属于植物 NAD-ME，并且结构是高度保守的。
2.7 MdNAD-ME 时空表达分析
荧光实时定量 PCR 分析表明，MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2 在富士苹果的茎、叶片、花、根和
果实中均有表达，但二者在叶片中表达量最高，而在花中表达相对较弱（图 6）。就二者之间相比，
在花和叶中表现出相似的水平，而在根、茎和果实（尤其是果实）中 MdNAD-ME1 的表达量明显高
于 MdNAD-ME2（图 7），暗示了 MdNAD-ME1 可能在果实等器官中起到更加重要的作用。
富士苹果果实不同发育阶段的荧光实时定量 PCR 分析结果显示，随着果实的成熟 MdNAD-ME1
的相对表达量逐渐上升，而 MdNAD-ME2 随着果实的成熟表现出先下降再趋于稳定的相对表达量（图
8）。因此可以得出，在富士苹果果实发育过程中 MdNAD-ME1 比 MdNAD-ME2 能够起到更加重要的
作用。


4 期 董庆龙等：苹果 NAD–苹果酸酶基因的克隆在不同组织和果实发育阶段的表达分析 745


图 4 苹果 NAD-ME 5 个保守序列标签（上）和保守区域结构（下）示意图
位点高度表明该位置的每个氨基酸的相对频率。
Fig. 4 The schematic models of five conserved sequence logos（above）and putative conserved domain structure（below）for MdNAD-MEs
The height of the bit indicates the relative frequency of each amino at that position.
















图 5 苹果 NAD-ME 三维结构模型
Fig. 5 3-D structure models of MdNAD-MEs
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图 6 富士苹果不同组织中 MdNAD-ME 相对表达分析
Fig. 6 Relative expression of MdNAD-ME in different tissues of‘Fuji’apple












3 讨论
苹果酸酶（Malic enzyme，ME）参与植物体中多个代谢过程，是生物体生命活动中重要的酶之
一。近几年，高等植物的 NADP-ME 得到较为深入地研究，已经发现对它对保持植物细胞的渗透势，
稳定细胞质的 pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起到重要作用（Martinoia & Rentsch，1994；
Drincovich et al.，2001）。尽管非光合作用 NAD-ME 被认为在通过 TCA 循环代谢中起到重要的作用，
但是对 NAD-ME 的功能和作用机制的研究非常少。Tronconi 等（2008）通过对单和双 NAD-ME 突
变体分析发现，该基因对于拟南芥自身的正常生长发育并非是必须的。代谢图谱研究结果表明，拟
南芥 NAD-ME1 酶活性对处于黑暗中其自身的代谢水平起到特殊的影响作用。在百脉根（Lotus
japonicus）中 NAD-ME 酶活性能够影响到根瘤菌的固氮酶活性 （Thapanapongworakul et al.，2010）。
过量表达水稻 NAD-ME1（OsNAD-ME1）能提高拟南芥 NAD-ME 酶活性，同时还增加其对 NaCl、
NaHCO3、甘露醇和 H2O2 多种非生物胁迫抗性（Zhou et al.，2012）。
图 7 富士苹果不同组织 MdNAD-ME1 相对于
MdNAD-ME2 的表达分析
Fig. 7 Expressionof MdNAD-ME1 transcript relative to
MdNAD-ME2 mRNA levels for each tissue of‘Fuji’apple

图 8 富士苹果果实不同发育阶段中 MdNAD-ME
相对表达分析
Fig. 8 Relative expression of MdNAD-ME during fruit
development of‘Fuji’apple

4 期 董庆龙等：苹果 NAD–苹果酸酶基因的克隆在不同组织和果实发育阶段的表达分析 747

本研究中在苹果上克隆得到 2 个 MdNAD-MEs，其中 MdNAD-ME1 含有 19 个外显子和 18 个内
含子，这与拟南芥 AtNAD-ME1 和 AtNAD-ME2 外显子和内含子数量相同（http：//gbrowse. arabidopsis.
org/cgi-bin/gbrowse/arabidopsis/），表明二者可能为对应的同系物。植物 NAD-ME 可被分为 α 组和 β
组，同一物种之间的 NAD-ME 蛋白相似性大约在 65%左右（Maier et al.，2011）。本研究中发现，
植物 NAD-ME 的 α 组和 β 组又可分别被分为双子叶亚组和单子叶亚组，这一结果尚未见前人报道。
植物 NAD-ME 均具有 5 个保守氨基酸区域，并且这 5 个保守的氨基酸区域是植物 NAD-ME 蛋白典
型的特征（Long et al.，1994），在本研究中，苹果 NAD-ME 同样含有这 5 个保守的氨基酸区域，并
且这 5 个氨基酸区域是高度保守的（图 4）。综合以上结果证明，克隆得到的 cDNA 序列是苹果
NAD-ME，同时也说明植物 NAD-ME 的进化过程是非常保守的。
Tronconi 等（2008）通过 qRT-PCR 研究表明，拟南芥 AtNAD-MEs 在被检测的组织中呈组成型
表达，在叶片和茎中表达量较高，并且 AtNAD-ME1 表达水平总是高于 AtNAD-ME2。在本研究中，
苹果 MdNAD-MEs 在根、茎、叶片、花和成熟果实中均有表达，在叶片中表达量最高；在茎、花、
根和果实中，MdNAD-ME1 的表达水平均高于 MdNAD-ME2。进一步在果实不同发育阶段的表达分
析结果可以看出，MdNAD-ME1 的相对表达是升高的；MdNAD-ME2 的相对表达是下降的，这在其
他文献中还未见相关的报道。以上数据说明，NAD-ME1 和 NAD-ME2 在植物的生长和发育过程中可
能起到不同的作用。
MdNAD-ME1 和 MdNAD-ME2 的生理生化特性、功能及其催化机制还有待于进一步研究。后
续的研究工作中，我们将对其在转基因植物中的表达情况及功能鉴定进一步研究，为深入探讨植物
体 NAD-ME 在多重代谢过程中的作用奠定基础。

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