全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：363–369 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–10–24；修回日期：2012–01–03
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAF07B00）；福建农林大学科技发展基金项目（2009068）；福建省教育厅基金项目（JA10108）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：pdm666@126.com）
生长发育过程中和受机械损伤后 PPO 基因的
表达
姜翠翠 1，陈桂信 1，潘东明 1,*，潘腾飞 1，赖 燕 2，郑鸿昌 1
（1 福建农林大学园艺学院产品贮存保鲜研究所，福州 350002；2 福建农林大学生命科学学院，福州 350002）
摘 要：从（Prunus salicina Lindl. var. cordata J. Y. Zhang et al.）成熟叶片均一化全长 cDNA 文库
中新分离得到了 1 个 PPO 基因，命名为 PsPPO2，基因登录号为 JF681036.1。经 NCBI-BLAST 分析，其
核苷酸序列与蔷薇科果树中的河北鸭梨和富士苹果果实的 PPO 基因具有很高的同源性，分别为 81%和
80%；与作者先前分离克隆的 PsPPO1 和 PsPPO3 基因同源性分别为 55%和 56%，说明此克隆是 PPO 基
因家族的新成员。通过 RT-PCR 分析，PsPPO1、PsPPO2 和 PsPPO 这 3 个基因在不同生长发育时期和
果实受损伤后的表达模式。在叶片发育过程中，PsPPO2 表达量都很高；PsPPO1 在嫩芽和幼叶中表达；
PsPPO3 只在嫩芽中表达；在果实发育的不同时期，PsPPO2 和 PsPPO3 在早期表达，随着果实成熟表达
量下降，PsPPO1 在褐变果中表达量较高。受机械损伤后，PsPPO1 受诱导，而 PsPPO2 和 PsPPO3 不受
诱导。
关键词：；多酚氧化酶；序列分析；基因表达；机械损伤
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0363-07

Expression of Three Polyphenol Oxidases During Vegetative and
Reproductive Development and in Response to Wounding in the Prunus
salicina
JIANG Cui-cui1，CHEN Gui-xin1，PAN Dong-ming1,*，PAN Teng-fei1，LAI Yan2，and ZHENG
Hong-chang1
（1Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products，College of Horticulture，Fujian Agriculture and
Forestry University，Fuzhou 350002，China；2College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou
350002，China）
Abstract：Polyphenol oxidase（PPO）has been regarded to be a critical enzyme in food technology. A
new clone，named PsPPO2，was separated from cDNA library prepared from mature leaf of the Prunus
salicina Lindl. var. cordata J. Y. Zhang et al. The deduced amino acid sequences shared 81% and 80%
identity with the PPO from Hebei Yali pear and Fuji apple and shared 55% and 56% identity with the PPO
gene from P. salicina leaf and fruit which previous isolated，respectively. RT-PCR showed that three PPO
gene displayed unique patterns of expression in developmental specific manner in leaf and fruit tissue. In
the process of leaf development，the PsPPO2 mRNA was detectable at all stages. In contrast，PsPPO1 and

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PsPPO3 were expressed in young tissue. PsPPO2 and PsPPO3 expression are higher at the early stages of
fruit development，then dramatically reduced as the fruit ripened. The PsPPO1 mRNA was detectable only
at the browning fruit. Upon wounding，PsPPO1 was significantly induced in mature fruit，whereas the
level of PsPPO2 and PsPPO3 were not affected by mechanical damage.
Key words：Prunus salicina；polyphenol oxidase；sequence analysis；gene expression；mechanical
damage

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称 PPO）是广泛存在于高等植物中的一种由核基因编码的
铜结合蛋白酶（Nicolas et al.，1994），催化单元酚、多元酚到联苯酚的羟基酚到醌的脱氢反应，在
细胞质中合成，定位于植物叶绿体的类囊体和其他类型的基质中而具酶活性。PPO 在植物的抗病和
光合作用中起到重要的作用，特别是在生物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起关键的作用。近
年来已经在葡萄（Dyr & Robinson，1994）、菠萝（Stewart et al.，2001）、苹果（Boss et al.，1994；
Kim et al.，2001；乜兰春 等，2004）、中国梨（Haruta et al.，1999；龚新明 等，2010）、桃（Haruta
et al.，1999）、杏（Chevalier et al.，1999）等植物上克隆了 PPO 基因。PPO 基因属于多基因家族，
除了在葡萄中仅发现 1 个 PPO 基因外（Dyr & Robinson，1994），其他物种中少则有 2 ~ 3 个，多则
6 ~ 7；蔷薇科果树苹果中则至少有 4 个 PPO 基因（Kim et al.，2001）。目前在蔷薇科物种上陈桂
信（2005）采用 RACE 和染色体步移相结合的方法，分别从嫩芽和幼果中克隆了两个 PPO 基因全
长 cDNA。
（Prunus salicina Lindl. var. cordata J. Y. Zhang et al.）是福建省的特产佳果，形美质优，肉多，
汁多，核小，具有较高的经济价值，但生产上普遍存在果肉褐变现象。邱栋梁和刘星辉（1998）研
究证实，果实褐变的发生与 PPO 的活性密切相关。当前大多用化学药剂或植物保鲜剂来降低植物
PPO 含量或抑制其活性（李洁和王清章，2002）。也有通过转基因方法来降低 PPO 活性，获得抗褐
变产品，现已在马铃薯（Coetzer et al.，2001）、杂交杨（Wang & Constabel，2004）、苹果（Murata et
al.，2000）中获得成功。
在果实采后贮藏和运输过程中，机械损伤是诱导其褐变的重要因素。褐变过程受 PPO 活性的
调控（邱栋梁和刘星辉，1998）。本研究目的在于了解 PPO 多基因家族在生长发育不同时期和受
机械损伤的表达模式。
1 材料与方法
1.1 植物材料与试剂
嫩芽（采样日期 2011 年 3 月初）、幼叶（2011 年 3 月中旬）、成熟叶（2011 年 4 月）、幼果（2011
年 5 月初）、成熟果（2011 年 7 月中旬）和褐变果（2011 年 8 月初，自然发生褐变的果实）采自福
建宁德周宁果园。机械损伤处理：将成熟果用小刀切成条状，室温放置，分别于 0（对照）、6、
12、24、48 h 取样，将上述样品用液氮速冻，放于–80 ℃冰箱备用。每个处理 3 个重复。提取 RNA
和测定 PPO 酶活性。
SmartTM cDNA Library Construction Kit、LA Taq 购自 Clotech 公司；无 RNA 酶活性的逆转录酶、
DH10B 感受态购自 Invitrogen 公司；DSN（duplex-specific nuclease）购自 Evorgen 公司。
1.2 成熟叶片均一化全长 cDNA 文库构建
利用 SmartTM 建库技术和 DSN 均一化技术（Shagin et al.，2002）相结合的方法构建了成熟叶
2 期 姜翠翠等：生长发育过程中和受机械损伤后 PPO 基因的表达 365

表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称
Primer
序列
Sequence
PPO-5-P 5′-GGNAARYTNATIAAYGAYCCNACNTTYGC-3′
PPO-3-P 5′-CAT NCG RTC NACRTT NSW R TGRTG-3′
Nai-tubuinF 5′-TCGGATGATGATGACCTTCTCTGTG-3′
Nai-tubuinR 5′-CATACACTCGTCTGCGTTCTCCA-3′
PsPPO1F 5′-TCCAACCAGTCCGATTGAGAA-3′
PsPPO1R 5′-GACTACAACGGCACCGACGAA-3′
PsPPO2F 5′-AGCAACCAACGGTGGCAATG-3′
PsPPO2R 5′-GGTGGGTGGGCAACAGTCAA-3′
PsPPO3F 5′-CAAAGCCAACCGCACGTAAA-3′
PsPPO3R 5′-TCCTCCGCTCCCAAGTCCTC-3′
片均一化全长 cDNA 文库。该原始文库的滴度为 2.0 × 106 pfu · mL-1，重组率为 98%，插入片段大小
在 1.8 kb 左右，文库质量良好。
1.3 PPO 基因的筛选与序列分析
采用基于 PCR 技术的 96 孔板法筛选目的基因，参照 PCR 筛选多个 cDNA 池（Yim et al.，2007）。
根据蔷薇科物种 PPO 基因的氨基酸保守区序列，应用 primer 5.0 在铜结合区域设计一对上、下游简
并引物 PPO-5-P 和 PPO-3-P（表 1），对文库进行筛选，对筛选得到的阳性克隆进行测序。测序结果
用在线软件 NCBI、SingalP、NetPhos 和 protscale 进行分析。
1.4 PPO 基因在生长发育期和受机械损伤后的表达分析
分别提取不同时期的叶片（嫩芽、幼叶
和成熟叶）和果实（幼果、成熟果和采收后自
然发生褐变果实）总 RNA，以及受机械损伤处
理后各时间段的总 RNA，并逆转录为 cDNA，
用tubulin 基因作为参照对 3 个 PPO 基因进
行 RT-PCR 分析，tubulin 引物和 3 个基因的半
定量引物见表 1。
1.5 PPO 活性的测定
PPO 活性的测定参照陈学红等（2003）的
方法。每 10 mL 的反应液中包括 8 mL 的 0.2%
邻苯二酚，0.1 mol · L-1 pH 6.0 磷酸缓冲液，2
mL 粗酶液，摇匀，30 ℃水浴反应 10 min，于
420 nm 波长处比色。参比液用 2 mL 水代替酶液。以 OD 值表示 PPO 的相对活性，单位为
OD420nm · h-1 · g-1 FW。
2 结果与分析
2.1 PsPPO2 基因的分离与序列分析
以 PPO-5-P 和 PPO-3-P 作为引物对已构建好的 cDNA 文库进行筛选，逐步稀释后获得目的基因
的 1 个阳性克隆。经测序后进行核酸序列和氨基酸序列分析，该克隆长 2 124 bp，包括一个 1 752 bp
的开放阅读框，编码 584 个氨基酸，包括一个起始密码子（ATG）和一个终止密码子（TAA），PPO
蛋白大小约 64.50 kD，理论 pI 值为 6.94，该基因命名为 PsPPO2。
NCBI 蛋白 BLAST 搜索结果显示，编码的蛋白属于酪氨酸酶超基因家族蛋白，具有 PPO 蛋白
典型的特征，有两个保守的 Cu 结合区，CuA 结合区和 CuB 结合区。多重序列比对结果显示，PPO
中间序列高度保守（图 1），CuA 结合区和 CuB 结合区位于 N 端区，每个 Cu 结合区有 3 个保守的
His，CuA 结合区还有一个保守的 Cys，在二级结构中与 His 形成酯键，与富士苹果、河北鸭梨基因
编码的氨基酸相似性均在 80%以上，PsPPO2 与 PsPPO1 和 PsPPO3 的同源性分别为 55%和 56%（图
1）。
在 CBS 服务器上利用 SingalP 程序的神经网络模型（NN）和隐马尔克夫模型（HMM）进行预
测，该蛋白为非分泌蛋白；利用 NetPhos 程序预测得出该蛋白分别有 20 个丝氨酸（Ser）、7 个苏氨
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酸（Thr）和 1 个酪氨酸（Tyr），可能成为蛋白激酶磷酸化的位点，表明在 PPO 的生物合成过程中
需要翻译后加工修饰才能成为特定功能的成熟多肽；用 protscale 程序预测编码蛋白质序列的亲水/
疏水性，就多肽链整体来看，亲水性氨基酸占多肽链大部分，整体偏于负值以下，表明该 PPO 编码
蛋白是亲水性蛋白。
图 1  PPO1 ~ PPO3 推导的氨基酸序列与其它蔷薇科果树 PPO 氨基酸序列比对
下划线表示保守的 CuA 和 CuB 结合区；保守的组氨酸残基（His）和半胱氨酸残基（Cys）分别用绿色和红色表示；
“*”表示序列完全同源；“：”表示同源性较高；“.”表示同源性较低；无符号表示无同源性。
Fig. 1 Comparison of the derived amino acid sequences of the Prunus salicina PPOs proteins with other Rosaceae fruit
Regions corresponding to the conserved CuA and CuB copper-binding sites are highlighted in underline，conserved histidine residues
and the cysteine residue involved in thio-ether linkage are highlighted in green and red. “*”Complete identity；
“：”Strongly similar；“.”Weakly similar；No symbol indicates different.
2.2 不同的生长发育时期 PPO 基因的表达
为了研究 PPO 基因家族中的不同成员表达模式，应用多重复半定量 PCR 法分析了 3 个基因的
表达模式。PsPPO1 在嫩芽、幼叶和褐变果中表达很强，而在成熟叶、幼果、成熟果中表达很弱；
PsPPO2 在嫩芽、幼叶、成熟叶、幼果中表达很强，在成熟果以及褐变果中表达较弱，在褐变果中
表达最弱；PsPPO3 仅在嫩芽和幼果时期表达，在幼果时期表达最强，而在幼叶、成熟叶、幼果和
中都表达很弱，褐变果中未表达（图 2）。
2 期 姜翠翠等：生长发育过程中和受机械损伤后 PPO 基因的表达 367

图 3 PPO基因在成熟果实机械损伤后
不同时间段的表达模式
Fig. 3 Differential expression of the Prunus salicina PPO genes
in response to wounding for different time periods
图 4 成熟果实机械损伤后 PPO 酶活性的变化
Fig. 4 Changes in PPO enzyme activity in response to wounding
in Prunus salicina ripened fruit
图 2 PPO 基因在 叶片和果实不同生长发育时期的表达分析
tubulin 为内参基因。
Fig. 2 Expression of three PPO genes during leaf and fruit of different stages in Prunus salicina
tubulin gene from Prunus salicina was selected as internal control.
2.3 成熟果实受到机械损伤后 PPO 基因的表达和 PPO 酶活性的变化
已有研究证实，植物在受到机械损伤后可以诱导 PPO 基因表达（Thipyapong et al.，1995，1997）。
本试验中，PsPPO1 在机械损伤诱导 6 h 后表达量增加，24 h 表达量达到高峰，48 h 下降；PsPPO2
受机械损伤后的表达量和对照（未受机械损伤）表达量相似；PsPPO3 只在对照中有微弱的表达，
而在机械损伤后无任何表达（图 3）。
PPO 酶活性在受机械损伤 6 h 后增加，随后逐渐增加，直到 24 h 达到最高，之后开始下降（图 4）。
3 讨论
已有研究结果表明PPO基因在特定的组织、不同的生长发育时期其表达模式和表达量不同（Kim
et al.，2001；Lan et al.，2011）。本试验中研究的 3 个 PPO 基因在叶片和果实的不同发育时期都有
不同程度的表达，PPO 基因在幼嫩组织中较成熟组织表达量高，这在番茄（Thipyapong & Steffens，
1997）、马铃薯（Thygesen et al.，1995）和杏（Chevalier et al.，1999）的研究中也得到证实。
果实和蔬菜的褐变与 PPO 基因及其酶活性有关（Hunt et al.，1993；Bachem et al.，1994）。菠
萝黑心病的发生直接与 PPO 发生氧化有关（Stewart et al.，2001；Zhou et al.，2003）；马铃薯褐变中
发现 PPO 基因的表达、活性和褐变程度呈正相关（Coetzer et al.，2001）；也有研究表明，一些植物
的叶片或者果实受机械损伤后，PPO 基因呈上调表达（Constabel & Barbehenn，2008；Shetty et al.，
2011）。例如番茄叶片和果实在受到机械损伤后 PPO 活性明显增高（Constabel et al.，1995；Bhonwong
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et al.，2009）；在菠萝的叶片和果实中，PPO 基因受机械损伤的诱导（Stewart et al.，2001），在杨树
上，通过转经机械损伤诱导后的 PtdPPO1 基因后，获得的转基因植株中 PPO 的表达量比对照高 50
倍左右（Wang & Constabel，2004）。但是对香蕉果皮或者果肉，无论是割伤、震荡，还是穿孔，PPO
活性都没有明显的增加，对杏叶片进行受伤处理，也得到同样的结果（Thipyapong et al.，2007）。
本试验中研究了 3 个 PPO 基因在成熟果实 受机械损伤后的表达模式，发现仅有 PsPPO1 基因在受
机械损伤诱导 6 h 后表达量增强，且在 24 h 表达量达到最高，随后表达量减弱，PPO 活性的相对表
达量同样也在 6 h 后增加，24 h 活性最强，随后逐渐下降。PsPPO2 基因与对照相比无明显变化，
PsPPO3 基因完全没表达。番茄（Thipyapong et al.，1997）中克隆出的 7 个 PPO 基因（PPOs A、A’、
B、C、D、E、F）中仅有一个基因 PPOF 参与了受伤后的诱导，其它 6 个基因参与了番茄的不同生
长发育；富士苹果（Kim et al.，2001）中仅有 1 个基因 APO5 在叶片和果实受机械损伤后表达；茄
子中仅有 SmePPO3 在果实受机械损伤后表达（Shetty et al.，2011），杨树（Lan et al.，2011）中也
得到同样的结果，只有 PtrPPO1 受机械损伤的诱导。
综上，3 个 PPO 基因在生长发育时期和受机械损伤后的表达模式不同，表明不同的 PPO 基
因在 生物体内具有不同的生物化学功能，在不同的外界环境下，特异基因的选择性激活表明植物
不同的基因存在特异的信号转导途径，说明不同的 PPO 基因具有不同的调控元件。目前已经分离得
到这 3 个 PPO 基因的 5′调控序列，正在做进一步的元件分析和功能研究。

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