全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 12 2474 2480 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–24；修回日期：2014–10–31
基金项目：国家‘十二五’农村领域科技计划课题（2013BAD14D0502）
基于叶绿体DNA PCR-RFLP分析柿及其近缘种
亲缘关系
梁晋军，梁玉琴，傅建敏*
（国家林业局泡桐研究开发中心，中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003）
摘 要：应用 5 对叶绿体 DNA（cpDNA）特异引物对柿及其近缘的 8 个种共 32 个基因型的 cpDNA
进行 PCR 扩增。采用 7 种限制性内切酶对其扩增产物酶切位点变异分析表明，在供试柿属植物中存在丰
富的种间多态性，但供试 22 个柿种内基因型未检测到变异位点。应用 NTSYS 中 UPGMA 法聚类和主坐
标分析表明：柿与金枣柿最近缘，其次分别是油柿、云南野毛柿、浙江柿和君迁子，而与美洲柿和乌柿
相距较远。野柿（浙江）为柿的变种，聚类结果也表明野柿（浙江）与柿有一定差异。
关键词：柿；cpDNA；PCR-RFLP；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：S 665.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）12-2474-07

Genetic Relationships of Diospyros kaki and Related Diospyros Species
Using Chloroplast DNA PCR-RFLP Markers
LIANG Jin-jun，LIANG Yu-qin，and FU Jian-min*
（China Paulownia Research Center，Non-timber Forest Research and Development Center，Chinese Academy of Forestry，
Zhengzhou 450003，China）
Abstract：Five special primer pairs of chloroplast genome were used to amplified chloroplast DNA
（cpDNA）regions in 8 Diospyros species including 32 genotypes. The products were digested by seven
restriction enzymes. The results showed high interspecific cpDNA variations within the genus Diospyros.
Twenty-two D. kaki genotypes were detected no visually variation in this study. D. kaki had closely
relationship with‘Jinzaoshi’，followed by D. oleifera，D. artrotricha，D. lotus and D. glaucifolia，but
distant from D. virginiana and D. cathayensis in diagram based on the UPGMA cluster analysis by
NTSYSpc 2.10e program. Wild persimmon（Zhejiang）is a variety varietas of persimmon. The result
showed that wild persimmon（Zhejiang）is not closely similar to D. kaki.
Key words：Diospyros kaki；cpDNA；PCR-RFLP；genetic diversity；genetic relationship

柿（Diospyros kaki Thunb.）品种多数为六倍体，2n = 6x = 90，但也有少量九倍体，2n = 9x = 135
（Zhuang et al.，1990）。前人已经通过各种分子标记对柿及其近缘种亲缘关系进行研究，但结果差
异较大。Yuri 和 Shozo（1994）通过对柿及其近缘种叶绿体 DNA（cpDNA）和线粒体 DNA（mtDNA）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fjm371@163.com）
12 期 梁晋军等：基于叶绿体 DNA PCR-RFLP 分析柿及其近缘种亲缘关系 2475
的 RFLP 分析，发现老鸦柿与柿最近缘；Keizo 等（1998）对柿属植物 cpDNA PCR-RFLP 分析的结
果表明柿与美洲柿最近缘；Hu 等（2008）、Guo 和 Luo（2011）分别用 cpDNA PCR-RFLP 和 SSR 分
析表明柿与君迁子最近缘；Keizo 等（2008）用 nrDNA 的 ITS 区和 cpDNA matK 序列分析的结果表
明柿与油柿最近缘。此外，Hu 等（2008）和 Tang 等（2014）分别用 cpDNA PCR-RFLP 和 ITS，matK
序列变异分析证明金枣柿为一个新种。
由于柿倍性复杂，其核基因组结构和序列也是复杂多变，从核基因组开发分子标记有一定难度，
相较于核基因，叶绿体基因组结构和序列非常保守，所以叶绿体基因组能很好地用于种间甚至种内
系统进化和亲缘关系的研究（Randall et al.，1998）。目前，基于 cpDNA 的 PCR-RFLP 的分子标记
已广泛用于遗传多样性、系统进化和植物种类鉴定等研究（Claudia et al.，2004；Pharmawati et al.，
2004；Bao et al.，2005）。本研究中通过对 4 个柿近缘种（君迁子、浙江柿、金枣柿和油柿）cpDNA
全基因组测序结果对比分析，找出变异较大的 4 个区段（trnH-matK、rpoB-petN、trnS-trnfM 和 ndhA）
和 1 个功能基因（rbcL）片段，并设计特异引物对 32 份柿属植物的 5 个 cpDNA 区域进行 PCR-RFLP
分析，以期为柿及其近缘种亲缘关系提供有效证据。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为柿及其近缘种共 8 种，1 个变种 32 个基因型（表 1）。乌柿、美洲柿和油柿于 2014 年采
自陕西杨陵国家柿种质资源圃，其余于 2013 年采自国家林业局泡桐研究开发中心柿种质资源圃。
1.2 cpDNA区域选择与引物设计
2013 年 6 月采用 Kerstin 等（2008）改良的蔗糖密度梯度离心分离法提取 4 个柿近缘种（金枣
柿、君迁子、浙江柿和油柿）的叶绿体总 DNA；超声波随机打断 DNA，电泳回收所需大小片段，
加上接头进行文库制备；最后用 Illumina-Miseq 测序仪完成规定数据的测序。采用 Calera assembler
组装软件对测序结果进行组装。使用 DOGMA 软件对基因进行注释，最后经过人工校正，用 ClustalX
对 4 个全基因组序列进行对比，找出差异较大的 4 个区段（trnH-matK、rpoB-petN、trnS-trnfM 和
ndhA）和差异较小的 1 个功能基因（rbcL）片段。
针对所选 5 个区段上、下游，利用 Primer 5.0 软件设计特异引物（表 2），并用 Oligo7.0 软件对
引物进行评价，选出最优特异引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.3 DNA提取、PCR扩增和限制性酶切
1.3.1 DNA 提取和 PCR 扩增
2013 年 6 月采用 CTAB 法（Doyle & Doyle，1987）从柿幼嫩叶片中提取植物总 DNA，2014 年
4 月进行补充试验。
2014 年 4 月试材 DNA 在 bio-red 公司 PCR 仪上进行 PCR 扩增。反应总体积为 25 µL，内含 1×
PCR 缓冲液（含 1.5 mmol · L-1 Mg2+），250 µmol · L-1 dNTP，10 mmol · L-1 Tris-HCl，50 mmol · L-1 KCl，
0.2 µmol · L-1 primers，1.25 U Taq DNA polymerase，DNA 40 ng。PCR 程序为 94 ℃预热 3 min，1 个
循环；94 ℃变性 45 s，52.7 ~ 56 ℃退火 1 min（表 2），72 ℃延伸 1 min 15 s ~ 2 min 30 s，35 个循环；
最后 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保温。PCR 产物通过 Gelred 染色的 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。Bio-red
公司凝胶成像系统观察并记录谱带。


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表 1 试验材料
Table 1 The materials in this study
学名
Scientific name
倍性水平
Ploidy level
编号
Code
种/品种名
Specie/cultivar name
脱涩类型
Astringent type
来源
Source
Diospyros lotus 2n = 2x = 30 1 君迁子（雌）Date plum（female） – 陕西 Shaanxi
2n = 2x = 30 2 君迁子（雄）Date plum（male） – 陕西 Shaanxi
D. glaucifolia 2n = 2x = 30 3 浙江柿 Chekiang persimmon – 浙江 Zhejiang
D. kaki Thunb. var.
silvestris
2n = 6x = 90 4 野柿（浙江）Wild persimmon（Zhejiang） – 浙江 Zhejiang
D. oleifera 2n = 2x = 30 5 油柿 Oily persimmon – 浙江 Zhejiang
D. virginiana L. 2n = 6x = 90 6 美洲柿（雌）Common persimmon（female） – 美国 USA
2n = 6x = 90 7 美洲柿（雄）Common persimmon（male） – 美国 USA
D. sp. 2n = 2x = 30 8 ‘金枣柿’‘Jinzaoshi’ – 浙江 Zhejiang
D. cathayensis 2n = 6x = 90 9 乌柿 Woolly-flowered Persimmon – 陕西 Shaanxi
D. artrotricha 2n = 2x = 30 10 云南野毛柿 Yunnan Yemaoshi – 云南 Yunnan
D. kaki Thunb. 2n = 6x = 90 11 ‘富有’‘Fuyuu’ PCNA 日本 Japan
12 ‘次郎’‘Jirou’ PCNA 日本 Japan
13 ‘晚御所’‘Oku-gosho’ PCNA 日本 Japan
14 ‘阳丰’‘Youhou’ PCNA 日本 Japan
15 ‘禅寺丸’‘Zenjimaru’ PVNA 日本 Japan
16 ‘湖南鸟柿’‘Hunan Niaoshi’ PCA 湖南 Hunan
17 ‘黑柿’‘Blank Persimmon’ PCA 日本 Japan
18 斤柿 Jin Persimmon PCA 日本 Japan
19 正月 Akagaki PVNA 日本 Japan
20 ‘甜宝盖’‘Baogai Tianshi’ PCNA 湖北 Hubei
21 ‘秋焰’‘Qiuyan’ PCNA 湖北 Hubei
22 ‘罗田甜柿’‘Luotian Tianshi’ PCNA 湖北 Hubei
23 磨盘柿 Mopanshi PCA 河北 Hebei
24 长安怀抱月 Chang’an Huaibaoyue PCA 陕西 Shaanxi
25 台湾正柿 Taiwan Zhengshi PCA 台湾 Taiwan
26 牛头柿 Niutoushi PCA 福建 Fujian
27 野柿 1 号 Wild persimmon 1 – 湖南 Hunan
28 野柿 2 号 Wild persimmon 2 – 湖北 Hubei
29 野柿 3 号 Wild persimmon 3 – 湖北 Hubei
30 野柿 4 号 Wild persimmon 4 – 江苏 Jiangsu
31 野柿 5 号 Wild persimmon 5 – 湖北 Hubei
2n = 9x = 135 32 ‘平核无’‘Hiratanenashi’ PVA 日本 Japan
注：PCNA：完全甜柿；PCA：完全涩柿；PVNA：不完全甜柿；PVA：不完全涩柿；–：未知。
Note：PCNA：Pollination-constant and non-astringent；PCA：Pollination constant astringent；PVNA：Pollination variant non-astringent；
PVA：Pollination variant astringent；–：Unknown.


表 2 cpDNA 特异引物序列及扩增条件
Table 2 cpDNA the sequence and amplification conditions of cpDNA special primer pairs in this study
区域
Region
正向引物
Squence forward（5′–3′）
反向引物
Sequence reverse（5′–3′）
退火温度/℃
Annealing
temperature
片段长度/bp
Fragment length
trnH-matK ATTCTTCGTCGCCGTAGTAAA GGCGGATTTGGTATTTGGA 55 2 200
rpoB-petN AAAGTTCTTCCGTCAAGC TCCCCATACTACGAGTGAAA 52.7 2 000
trnS-trnfM GCTATCAACCACTCAGCCATCT GAGGTCACGGGTTCAAATC 56 1 000
ndhA ATTCAGTTTGATAACCTGCTAC TTTGGCTATCGTCTTGTTCTA 53 1 500
rbcL GGAGGGATTTATGTCACCAC TTGTATTCGGCTCAATCCTT 55 1 500


12 期 梁晋军等：基于叶绿体 DNA PCR-RFLP 分析柿及其近缘种亲缘关系 2477
1.3.2 酶切反应
应用 ApoⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ、MseⅠ、MboⅠ、AvaⅠ和 DraⅠ 7 种限制性内切酶（购自 NEB
公司）对扩增出的 cpDNA 片段进行酶切。酶切反应体积为 15 µL，内含 6 µL PCR 产物，2 ~ 4 U 限
制性内切酶和 1× 限制性内切酶反应缓冲液，酶切时间为 10 h，除 TaqⅠ反应温度为 65 ℃外，其余
均为 37 ℃。酶切产物通过 Gelred 染色的 2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。Bio-red 凝胶成像系统观察并记
录谱带。
根据扩增片段酶切产物的琼脂糖电泳图谱上条带的有或无标记为 1 或 0，建成原始矩阵。应用
NTSYS 2.10，依据 UPGMA（unweighted pair group method arithmetic averages）法进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 柿及其近缘种cpDNA PCR-RFLP的多态性
设计的 5 对特异引物均能在供试 32 份柿及其近缘种中扩增出一条谱带，通过 2%琼脂糖凝胶电
泳，检测出扩增产物无明显长度差异。
5 个 PCR 扩增后的产物经过 ApoⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ、MseⅠ、MboⅠ、AvaⅠ和 DraⅠ 7 种限制
性内切酶酶切，35 对特异引物/限制性内切酶组合中有 22 对（62.9%）检测到明显的种间差异，共
获得 181 个片段，其中 105 个片段（58%）呈现多态性。在 rpoB-petN、trnS-trnfM、ndhA、rbcL 区
域均未检测到 AvaⅠ的酶切位点，trnH-matK、rpoB-petN、ndhA 区域与其余 6 种限制性内切酶组合
均存在丰富的种间多态性，说明本试验所选区域种间存在较大变异；而 rbcL 区域仅有一个酶切组合
存在多态性，说明在关键功能基因片段（rbcL）处柿近缘种存在较少变异，以此反推所选近缘种均
与柿亲缘关系较近。在所有 35 对酶切组合中未检测到 22 个柿种内试材有酶切位点差异，表明柿种
内叶绿体基因组十分保守。
由图 1 可以看出，依据 trnH-matK/DraⅠ、rpoB-petN/MboⅠ两种区域/酶切组合可明确将 8 个种，
1 个变种，分为 9 组：1 和 2：君迁子；3：浙江柿；4：野柿（浙江）；5：油柿；6 和 7：美洲柿；8：
金枣柿；16：乌柿；10：云南野毛柿；11 ~ 15：柿品种。在 22 对多态性酶切组合中，仅 trnS-trnfM/ApoⅠ
组合能检测出君迁子（1 和 2）的雌雄位点变异（图 1，D）；仅 trnH-matK/DraⅠ（图 1，A）组合
能检测出柿变种野柿（浙江）与柿位点变异（图 1，A 中 4 与 11 ~ 15）。ndhA/MboⅠ（图 1，C）组
合可能有存在柿种内些微长度差异（未记录新条带），尚待进一步验证。
材料 16 ~ 32 全部为无差异位点柿种内品种，未单独列出。
2.2 柿及其近缘种间的亲缘关系
根据所得到酶切位点变异数据建成的原始矩阵，利用 NTSYS-pc version 2.10 软件计算 SM 相似
指数，UPGMA 法进行聚类（图 2），柿种内 22 个品种无差异归为柿种下；同时进行 8 个种种间主
坐标分析（图 3），雌雄（君迁子和美洲柿）归为一种，柿种内 22 个品种和 1 个变种[野柿（浙江）]
归为柿种下。在图 2 和图 3 中，六倍体柿与同为多倍体的美洲柿和乌柿相似性最差，分布位置最远，
表明柿与乌柿和美洲柿亲缘关系相对较远，尽管柿与乌柿、美洲柿倍性相同，但 cpDNA 序列变异
较大，表明两者有不同的起源祖先，这与前人研究结果（Nakasuka et al.，2002；Choi et al.，2003；
Guo & Luo，2006；Guo et al.，2006；Hu et al.，2008）一致；柿与金枣柿、油柿和云南野毛柿聚为
一类，且柿与二倍体金枣柿相似度最高，亲缘关系最近，该结果与 Hu 等（2008）和 Guo 等（2011）
关于柿与君迁子最近缘的结果不同。


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图 1 部分柿及其近缘种 cpDNA PCR 产物经限制性内切酶酶切后 2.5%琼脂糖凝胶电泳图谱
1 ~ 16 见表 1，MA 为 DL2000，MB 为 50 bp ladder。
Fig. 1 Restriction patterns of amplified and digested products of chloroplast genomic DNA from Diospyros spp.
1–16 refer to the numbers list in Table 1. MA：DL2000；MB：50 bp ladder.

图 2 PCR-RFLP 分析的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 Dendrogram of all genotypes from the UPGMA cluster analysis based on PCR-RFLP data

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图 3 柿属植物种间 PCR-RFLP 主坐标分析散点图
Fig. 3 Diagram showing the relationships among species based on principal coordinates analysis by PCR-RFLP
3 讨论
前人通过 Ty1-copia 反转录转座子 Southern 杂交（Nakasuka et al.，2002）；检测 DNA 重复位点
序列同源性（Choi et al.，2003）；SRAP、IRAP、REMAP（Guo & Luo，2006；Guo et al.，2006）；
cpDNA PCR-RFLP 多态性分析（Hu et al.，2008）均表明美洲柿与柿亲缘关系较远，本试验结果与
之一致。但 Keizo 等（1998）通过对东南亚部分柿属植物包括 24 个种的限制性内切酶酶切研究，用
邻接法分析表明柿与美洲柿、君迁子聚成一组，导致结果不完全相同的原因是所选材料和扩增区段
不同。
有研究用 cpDNA PCR-RFLP 和 SSR 分析表明柿与君迁子亲缘关系最近（Hu et al.，2008；Guo &
Luo，2011）；而本试验结果表明柿与君迁子、浙江柿亲缘关系较远，柿与金枣柿、油柿、云南野毛
柿聚为一类，亲缘关系较与君迁子和浙江柿更近（图 2，图 3），导致两种不同结果最可能的原因是
选用扩增区域和限制性内切酶的不同。Keizo 等（2008）通过用 nrDNA ITS 区和 cpDNA matK 序列
分析表明柿与油柿最近缘，这与本试验中柿与金枣柿、油柿、云南野毛柿聚为一类的结果（图 2）
相一致，就柿与油柿的叶片表观形态而言，柿也与油柿相近。本试验结果表明柿种内无酶切位点差
异与前人（Yuri & Shozo，1994；Keizo et al.，1998；Hu et al.，2008）用同一方法得到的结果一致。
金枣柿曾被学术界认定为柿的一个二倍体品种（杨勇 等，1999），后经 Hu 等（2008）和 Tang
等（2014）分别用 cpDNA PCR-RFLP 和 ITS，matK 序列变异分析证明金枣柿为一个新种。本试验
中柿与金枣柿能完全分开，支持金枣柿为一新种的结论。

References
Bao Y，Lu B R，Ge S. 2005. Identification of genomic constitutions of Oryza species with the B and C genomes by the PCR-RFLP method. Genetic
Resources and Crop Evolution，52：69–76.
Choi Y A，Tao R，Keizo Y，Sugiura A. 2003. Genomic distribution of three repetitive DNAs in cultivated hexaploid Diospyros spp.（D. kaki and D.
virginiana）and their wild relatives. Genes Genet Syst，78：301–308.
Claudia C，Muhamment T，Phillip D G. 2004. Discrimination of diploid crucifer species using PCR-RFLP of chloroplast DNA. HortScience，39 (7)：
1575–1577.
Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul，19：11–15.

2480 园 艺 学 报 41 卷
Guo D L，Luo Z R. 2006. Genetic relationships of some PCNA persimmons（Diospyros kaki Thunb.）from China and Japan revealed by SRAP
analysis. Genet Res Crop Evol，53：1597–1603.
Guo D L，Luo Z R. 2011. Genetic relationships of the Japanese persimmon Diospyros kaki（Ebenaceae）and related species revealed by SSR analysis.
Genet Mol Res，10 (2)：1060–1068.
Guo D L，Zhang H Q，Luo Z R. 2006. Genetic relationships of Diospyros kaki Thunb and related species revealed by IRAP and REMAP analysis.
Plant Sci，170：528–533.
Hu D C，Zhang Q L，Luo Z R. 2008. Phylogenetic analysis in some Diospyros spp.（Ebenaceae）and Japanese persimmon using chloroplast DNA
PCR-RFLP markers. Scientia Horticulturae，117：32–38.
Keizo Y，Chitose H，Shinya K，Hitofumi I，Ayako L，Akira K，Akira S，Dan E P. 2008. Sequence analyses of the ITS regions and the matK gene
for determining phylogenetic relationships of Diospyros kaki（persimmon）with other wild Diospyros（Ebenaceae）species. Tree Genetics &
Genomes，(4)：149–158.
Keizo Y，Shinya K，Dan E P，Naoki U，Suranant S，Akira S. 1998. Phylogenetic relationship of Diospyros kaki（persimmon）to Diospyros spp.
（Ebenaceae）of Thailand and four temperate zone Diospyros spp. from an analysis of RFLP variation in amplified cpDNA. Genome，41：
173–182.
Kerstin D，Trevor R H，Ecelyn F，Susanne B. 2008. An optimized chloroplast DNA extraction protocol for Grasses（Poaceae）proves suitable for
whole plastid genome sequencing and SNP detection. PLoS One，3 (7)：e2813.
Nakasuka A，Iwami N，Matusmoto S，Itamura H，Yamagishi M. 2002. Ty1-copia group retrotransposons in persimmon（Diospyros kaki Thunb）.
Genes Genet Syst，77：131–136.
Pharmawati M，Yan G，Sedgley R，Finnegan P M. 2004. Chloroplast DNA inheritance and variation in Leucadendron species（Proteaceae）as revealed
by PCR-RFLP. Theor Appl Genet，109：1694–1701.
Randall L S，Julie A R，Richard C C，Tosak S，Jonathan F W. 1998. The tortoise and the hare：Choosing between non coding plastome and nuclear
ADH sequences for phylogeny reconstruction in a recently diverged plant group. Ame J Bot，85：1301–1315.
Tang D L，Hu Y，Zhang Q L，Yang Y，Luo Z R. 2014. Discriminant analysis of“Jinzaoshi”from persimmon（Diospyros kaki Thunb.；Ebenaceae）：
A comparative study conducted based on morphological as well as ITS and matK sequence analyses. Scientia Horticulturae，168：168–174.
Yang Yong，Wang Ren-zi，Li Gao-chao，Wang Wen. 1999. Study on chromosome numbers of Diospyros and their varieties. Acta Agriculturae
Boreali-Occidentalis Sinica，8 (3)：64–67. (in Chinese)
杨 勇，王任梓，李高潮，王 雯. 1999. 柿属植物及柿品种染色体数目研究. 西北农业学报，8 (3)：64–67.
Yuri N，Shozo K. 1994. DNA restriction fragment length variability in Diospyros kaki and related Diospyros species. HortScience，29 (7)：809–811.
Zhuang D H，Kitajima A，Ishida M，Sobajima Y. 1990. Chromosome number of Diospyros kaki cultivars. J Jpn Soc Hort Sci，59：289–297.

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