全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：2012–2020 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–05–20；修回日期：2014–07–24
基金项目：国家‘863’计划项目（2012AA100103）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-A-09）；农业部园艺作
物生物学与种质创制重点实验室项目
* 同等贡献作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：huhong@caas.cn）
番茄抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 的 SNP
标记检测
苏晓梅*，高建昌*，王孝宣，国艳梅，杜永臣，胡 鸿**
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 10081）
摘 要：针对番茄 4 个抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1，根据其序列的碱基差异设计引物，经过引
物特异性检测和 PCR 产物克隆测序比对之后，采用高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）
技术进行多态性检测，共开发了 5 个 SNP 标记。经过验证，所开发的标记均能将抗病基因型不同的番茄
材料分型，并且分型结果与已知材料的抗病性状完全一致。这些标记可以作为功能标记在番茄抗病育种
中应用。
关键词：番茄；抗病基因；功能标记；HRM
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2012-09

Detection of SNP Markers of the Important Disease Resistance Genes in
Tomato
SU Xiao-mei*，GAO Jian-chang*，WANG Xiao-xuan，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，and HU Hong**
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）
Abstract：According to the gene sequence differences，primers were designed for 4 disease resistance
genes in tomato，Tm-2，Pto，Sw-5 and Ve1. After checking of primer specificity and aligning of the clone
sequences of the PCR products， the HRM（High resolution melting） technology was used for
polymorphism detection. In this study，5 SNPs were developed，all of which could distinguish the
materials with different genotypes. What’s more，the genotype was completely consistent with the known
gene. So they can be used as functional markers in tomato disease resistance breeding.
Key words：tomato；disease resistance gene；functional marker；HRM

分子标记辅助选择技术已成为番茄抗病育种的常规手段，但连锁分子标记选择的准确性取决于
标记与抗病基因的连锁程度，即便是紧密连锁的分子标记，也会由于在分离后代中出现标记与抗病
基因的交换而导致假阳性，降低选择效率。抗病基因的功能标记（基因内部标记）是其特异性标记，
其选择准确率为 100%（Arens et al.，2010），能够克服连锁标记的缺点。

10 期 苏晓梅等：番茄抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 的 SNP 标记检测 2013

SNP（单核苷酸多态性，Single nucleotide polymorphism）是由单个碱基变异（替代、插入或缺
失）所导致的多态性，在番茄基因组上广泛分布。通常对 SNP 的检测有直接测序、TaqMan 探针、
CAPS、dCAPS 和 HRM 等方法（Gut，2001；Syvänen，2001）。但这些方法有的比较昂贵（直接测
序、TaqMan 探针）；有的很难找到合适的酶切位点且检测步骤相对复杂（如 CAPS 和 dCAPS）。高
分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）技术是近年来新发展起来的一种 SNP 检测技术
（Gundry et al.，2003；Wittwer et al.，2003），是目前仅次于 SNP 芯片的中高通量 SNP 分型技术（赵
琼一 等，2010），其原理是通过实时监测升温过程中双链 DNA 荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情
况，获得稳定 PCR 产物的特征熔解曲线，进而根据其形态改变来判断扩增 DNA 片段在长度、碱基
序列和 GC 含量等方面的差异。SNP 位点因不匹配会使双链 DNA 在升温过程中先解开，荧光染料
从局部解链的 DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在 SNP，而且不同 SNP
位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此 HRM 分析能够有效区分不同 SNP 位点与
不同基因型，该方法适合单一 SNP 的检测。
目前番茄（Solanum lycopersicum）中已有的抗病标记多为连锁标记，在抗病鉴定中易发生交换
导致结果不准确或是鉴定过程比较复杂，稳定性差。番茄抗病基因 Tm-2（Tobacco mosaic virus
resistance-2，抗烟草花叶病毒）（Motoyoshi et al.，1996）、Pto（Pseudomonas syringae pv tomato
resistance，抗细菌性斑点病）（Martin et al.，1993）、Sw-5（Spotted wilt resistance-5，抗斑萎病）
（Brommonschenkel et al.，2000；Spassova et al.，2001）和 Ve1（Verticillium resistance，抗黄萎病）
（Kawchuk et al.，2001）已被克隆，并且在番茄抗病育种中应用较为广泛，但在抗病鉴定中缺少简
便有效的标记。在 Tm-2 基因的抗病鉴定中常用的标记为 SCN13（Sobir et al.，2000），该标记在试
验过程中稳定性较差，扩增效率低。在 Pto 基因的抗病鉴定中最常用的是 Yang 和 Francis（2005）
根据基因序列开发的 CAPS 功能标记，该标记为共显性标记，需要经过酶切检测，过程比较复杂。
在 Sw-5 基因的抗病鉴定中常用的标记有 CAPS 标记 CT220（Garland et al.，2005）和 InDel 标记 Sw5-2
（Dianese et al.，2010），前者为连锁标记，后者虽为功能标记但稳定性较差，扩增效率低，容易出
现假阳性。在 Ve1 基因的抗病鉴定中最常用的是 Acciarri 等（2007）根据 Ve1 基因序列设计的等位
基因特异引物，在抗病材料中扩增出 1 001 bp 的片段，而在感病材料中扩增出 696 bp 的片段，在杂
合材料中能扩增出 1 001 bp 和 696 bp 的两个片段，虽然该标记为基因内部的功能标记，但由于需要
两对引物分别进行扩增，故操作过程繁琐且结果重复性差，不稳定。本研究以开发上述 4 个基因的
功能标记为目标，通过序列比对，寻找 SNP 位点，建立基于 HRM 技术的 SNP 检测方法，以期为抗
病育种提供检测平台，提高抗病材料的选择效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
利用 20 个已知基因型的番茄材料（表 1）对开发的功能标记进行验证。GCR 系列引自日本，
LA 系列、M82、Micro-Tom 和 Moneymaker（http：//tgrc. ucdavis. edu）引自 TGRC（Tomato Genetics
Resource Center，番茄遗传资源中心），L305 引自美国夏威夷，飞天为海泽拉公司的杂交种，V217 为
法国威玛公司的杂交种，Fla.8042（http：//tgc. ifas. ufl. edu/index. htm）和 Micro-Tom（http：//tgrc. ucdavis.
edu）引自美国弗罗里达大学，早粉 2 号和 9706 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜食番茄组提供，
Moneymaker 为感病对照。其中用于 Tm-2 和 Ve1 基因测序验证的材料为 9706 和 Moneymaker，用于
Pto 基因测序的为 Micro-Tom 和 Moneymaker，用于 Sw-5 基因测序的为 Fla.8042 和 Moneymaker。2012
年 8 月 12 日浸种，8 月 16 日于中国农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室内播种。
2014 园 艺 学 报 41 卷
表 1 番茄材料及其基因型
Table 1 Genotype of the tomato materials
品种
Variety
基因型
Genotype
品种
Variety
基因型
Genotype
GCR26 tm-2/tm-2①；ve1/ve1③ 早粉 2 号 Zaofen 2 sw-5/sw-5
GCR526 Tm-2/Tm-2② M82 sw-5/sw-5
GCR237 tm-2/tm-2① LA0409 Ve1/ Ve1
LA3028 Tm-2/Tm-2 LA2818 Ve1/Ve1
LA3310 Tm-2/Tm-2 LA2823 Ve1/Ve1
LA2934 Pto/Pto Moneymaker tm-2/tm-2，pto/pto
LA4441 pto/pto sw-5/sw-5，ve1/ve1
LA3856 pto/pto 9706 Tm-2/Tm-2，pto/pto
L305 pto/pto sw-5/sw-5，Ve1/ Ve1
飞天 Feitian Sw-5/sw-5 Micro-Tom tm-2/tm-2，Pto/Pto
V217 Sw-5/sw-5 sw-5/sw-5，Ve1/ Ve1
Fla.8042 Sw-5/Sw-5
①Strasser & Pfitzner，2007；②Stobbs & MacNeill，1980；③Fradin et al.，2009。

1.2 基因组 DNA 的提取与检测
番茄幼苗两片真叶时进行取样，采用改良 CTAB 法（Fulton et al.，1995）进行基因组 DNA 的
提取。用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳（λDNA 作为 Marker）检测 DNA 质量；分光光度计测定样品的纯
度（OD260/OD280 = 1.8 ~ 2.0）。
1.3 目标基因 SNP 标记设计及序列验证
以 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 为目标基因，通过 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov）和 SGN
（http：//solgenomics. net）网站搜索上述基因的信息。通过 SGN 网站中的 Blast 程序（http：//solgenomics.
net/tools/blast/）筛选 SNP 位点，根据 SNP 位点两翼序列利用 Primer 5.0 进行引物设计，片段大小在
80 ~ 250 bp 之间，退火温度 55 ~ 60 ℃。利用高保真酶进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳回收仅有单
一清晰条带的 PCR 产物，连接于 PMD18-T 载体，转化到大肠杆菌 DH5α 中扩繁。经 PCR 检测后每
个样品挑取 3 个阳性克隆进行测序，由上海生工生物工程有限公司完成。
1.4 SNP 标记的 HRM 分析
PCR 扩增和 HRM 分析在 LightCycler® 480Ⅱ荧光定量 PCR 仪（Roche）上进行，采用 96 孔反
应模块。反应试剂采用 LightCycler® 480 High Resolution Melting Master 试剂盒。反应体系为 20 μL，
内含 30 ng 基因组 DNA，2× Master Mix，2.0 mmol · L-1 MgCl2，引物浓度为 0.2 μmol · L-1。
PCR 扩增程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s，45 个
循环。扩增产物的熔解步骤在 PCR 循环结束后立即进行。程序为：升温至 95 ℃ 1 min，然后降温
至 40 ℃ 1 min，再升温至 65 ℃ 1 s；从 65 ℃连续升温至 95 ℃的过程中进行荧光收集（25 次/℃）；
最后降温至 40 ℃。每个样品设置 3 个重复。
HRM 分析用 LightCycler® 480 的 Gene Scanning 软件进行。
2 结果与分析
2.1 目标基因 SNP 标记的设计及序列验证
2.1.1 SNP标记的设计
通过 NCBI 和 SGN 网站查找目标基因信息，根据 SNP 位点设计的引物如表 2 所示。
10 期 苏晓梅等：番茄抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 的 SNP 标记检测 2015

表 2 SNP 标记序列及信息
Table 2 The information of SNP
标记名称
Marker ID
基因名称
Gene name
SNP
SNP 位置
SNP position
产物大小/bp
Product size
引物序列
Primer sequence
Tm-2-SNP1 Tm-2 G 1 775 110 F：5′-CATGACTTGCTTACGCTATCTG-3′
tm-2 A R：5′-GGCTACGTCGATCAATGTCTAT-3′
Tm-2-SNP2 Tm-2 C 1 871 92 F：5′-CTGCCAAATAGTATTGTCAAGC-3′
tm-2 T R：5′-GACTCCCAAACACCAGAAGG-3′
Pto-SNP Pto A 20 632 96 F：5′-CGTCACCCTGCTAATGGAA-3′
pto G R：5′-AGAACGAGGAGGATGAGAACA-3′
Sw-5-SNP Sw-5 A 22 699 124 F：5′-TCCCATACCATACAATCCCACA-3′
sw-5 G R：5′-AAGTTACAGGTTTCAACGACAA-3′
Ve1-SNP Ve1 C 2 713 155 F：5′-CTGGTTCTATCCCATATTTTCG-3′
ve1 / R：5′-AAGGCTCCCGCTGAGTAA-3′

2.1.2 SNP标记测序验证
以含有 Tm-2 抗病基因的‘9706’和感病的‘Moneymaker’为材料，用设计的 Tm-2-SNP1 和
Tm-2-SNP2 进行 PCR 扩增，其产物经克隆测序比对，发现抗/感基因间存在 G/A 转换和 C/T 转换；
以含有 Pto 抗病基因的‘Micro-Tom’和感病的‘Moneymaker’为材料，用设计的 Pto-SNP 进行 PCR
扩增，其产物经克隆测序比对，发现抗/感基因间存在 A/G 的转换；以含有 Sw-5 抗病基因的‘Fla.8042’
和感病的‘Moneymaker’为材料，用设计的 Sw-5-SNP 进行 PCR 扩增，其产物经克隆测序比对，发
现抗/感基因间存在 A/G 转换；以含有 Ve1 抗病基因的‘9706’和感病的‘Moneymaker’为材料，
用设计的 Ve1-SNP 进行 PCR 扩增，其产物经克隆测序比对，发现在感病材料中存在 C 碱基的缺失
（图 1）。上述测序结果与序列预测结果完全一致，证明所设计的引物能够用于 SNP 检测。


























图 1 用 5 个标记对抗感材料的 SNP 测序结果
箭头表示碱基缺失。
Fig. 1 SNP between disease-resistant and susceptible tomato materials by sequencing with the 5 markers developed
Arrow indicates single nucleotide deletion.
2016 园 艺 学 报 41 卷
2.2 HRM 反应体系的优化
2.2.1 番茄材料基因组 DNA质量检测及 PCR体系的确定
经多次试验发现进行 HRM 分析时，要求模板 DNA 进行琼脂糖电泳检测时条带清晰无降解（图
2），OD260/OD280 在 1.8 ~ 2.0 之间。当 PCR 反应体系（20 μL）中基因组 DNA 总量为 30 ng，Mg2+
为 2.0 mmol · L-1，引物浓度为 0.2 μmol · L-1 时扩增效果较好。


图 2 番茄基因组 DNA 电泳结果
M：λDNA；1 ~ 18：部分番茄材料的基因组 DNA。
Fig. 2 Electrophoresis result of tomato genomic DNA on 0.8% agrose gel
M：λDNA；1–18：Genomic DNA of partial tomato materials.

2.2.2 参比 DNA适宜比例的确定
为确定参比 DNA 适宜的加入量，以 Ve1 基因标记为例，以其中一种纯合样本作为参比基因型，
在 PCR 体系中分别加入模板总量 0、10%、20%和 40%的参比 DNA 进行分析，结果（图 3）表明：
不加参比 DNA（0）时，不能进行有效分型；当参比 DNA 的量为 10%时，可将杂合基因型、纯合
抗病型和纯合感病型 3 种基因型材料分型；当参比 DNA 量为 20%时，能将 3 种基因型材料清晰的
分型，效果最好；但当参比 DNA 量为 40%时，纯合基因型与杂合基因型之间的分辨率降低。据此
认为，当参比 DNA 比例在 10% ~ 20%之间时能够进行基因分型，而以 20%的比例较好。
图 3 加入不同量参比 DNA 的 Ve1-SNP 标记的 HRM 分型结果
Fig. 3 The effects of different amounts of reference DNA of Ve1-SNP marker in HRM assay
10 期 苏晓梅等：番茄抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 的 SNP 标记检测 2017

表 5 对 Sw-5-SNP 标记进行验证的番茄材料
及 HRM 分型结果
Table 5 The tomato materials for Sw-5-SNP marker
verification and the result of HRM
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
飞天 Feitian Sw-5/sw-5 9706 sw-5/sw-5
V217 Sw-5/sw-5 Moneymaker sw-5/sw-5
Fla.8042 Sw-5/Sw-5 Micro-Tom sw-5/sw-5
早粉 2 号 Zaofen 2 sw-5/sw-5 M82 sw-5/sw-5
表 6 对 Ve1-SNP 标记进行验证的番茄材料
及 HRM 分型结果
Table 6 The tomato materials forVe1-SNP marker
verification and the result of HRM
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
LA0490 Ve1/Ve1 9706 Ve1/Ve1
LA2818 Ve1/Ve1 Moneymaker ve1/ve1
GCR26 ve1/ve1 Micro-Tom Ve1/Ve1
LA2823 Ve1/Ve1 LA0490 + Moneymaker Ve1/ve1
2.3 目标基因的 HRM 分型及验证
2.3.1 Tm-2-SNP1和 Tm-2-SNP2标记的基因分型
以‘Moneymaker’为参比基因型，利用 Tm-2-SNP1 和 Tm-2-SNP2 两个标记对 11 份番茄材料
的 Tm-2 基因进行基因分型，HRM 分型结果见图 4 和表 3，该结果与表 1 中已知的基因型完全吻合，
且两个标记的分型结果也完全一致。采用上述标记中的任何一个均可完成对 Tm-2 的鉴定。

表 3 对 Tm-2-SNP1 和 Tm-2-SNP2 标记进行验证的番茄材料及 HRM 分型结果
Table 3 The tomato materials for Tm-2-SNP1 and Tm-2-SNP2 marker verification and the result of HRM
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
GCR26 tm-2/tm-2 GCR526 Tm-2/Tm-2 GCR26 + GCR526 Tm-2/tm-2
GCR237 tm-2/tm-2 LA3028 Tm-2/Tm-2 GCR237 + LA3028 Tm-2/tm-2
9706 Tm-2/Tm-2 Moneymaker tm-2/tm-2 9706 + Moneymaker Tm-2/tm-2
LA3310 Tm-2/Tm-2 Micro-Tom tm-2/tm-2
注：“+”表示两种材料 DNA 的等量混合。
Note：“+”means the mixture of two kinds of the same amount of DNA.

2.3.2 Pto-SNP标记的基因分型
以‘LA2934’为参比基因型，利用 Pto-SNP 标记对 8 份番茄材料的 Pto 基因进行 HRM 基因分
型（图 5，表 4），分型结果与材料本身性状一致（表 1）。该标记能有效鉴定 Pto 基因。

表 4 对 Pto-SNP 标记进行验证的番茄材料及 HRM 分型结果
Table 4 The tomato materials for Pto-SNP marker verification and the result of HRM
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
番茄材料
Tomato material
基因型
Genotype
LA2934 Pto/Pto 9706 pto/pto
LA4441 pto/pto Moneymaker pto/pto
LA3856 pto/pto Micro-Tom Pto/Pto
L305 pto/pto LA2934 + Moneymaker Pto/pto

2.3.3 Sw-5-SNP标记的基因分型
以‘Moneymaker’为参比基因型，以 Sw-5-SNP 标记对 8 份番茄材料的 Sw-5 基因进行 HRM 基
因分型（图 6，表 5），分型结果与材料本身性状一致（表 1）。该标记能有效鉴定 Sw-5 基因。
2.3.4 Ve1-SNP标记的基因分型
以‘LA0490’为参比基因型，以 Ve1-SNP 标记对 8 份番茄材料的 Ve1 基因进行 HRM 基因分型
（图 3，20%；表 6），分型结果与材料本身性状一致（表 1）。该标记能有效鉴定 Ve1 基因。

2018 园 艺 学 报 41 卷
图 5 8 份番茄材料的 Pto-SNP 标记的 HRM 基因分型
Fig. 5 Pto-SNP genotyping of 8 tomato materials by HRM
图 6 8 份番茄材料的 Sw-5-SNP 标记的 HRM 基因分型
Fig. 6 Sw-5-SNP genotyping of 8 tomato materials by HRM
图 4 11 份番茄材料的 Tm-2-SNP1 和 Tm-2-SNP2 标记的 HRM 基因分型
Fig. 4 Tm-2-SNP1 and Tm-2-SNP2 genotyping of 11 tomato materials by HRM


3 讨论
HRM 技术是近年来新兴的 1 种 SNP 检测技术。据已有的研究报道，存在以下 4 个方面的因素
影响 HRM 检测的效果：
（1）参比 DNA 的比例。研究（Wittwer et al.，2003；Liew et al.，2004）表明，HRM 能清晰地
区分纯合体和杂合体的基因型，但对于两种纯合基因型，分型效果不明显，这是因为不同纯合体样
品的熔解曲线形状由于熔解温度（Tm值）的差异微小而非常相似，而杂合体样品由于可以产生熔解
温度低于同源双链的异源双链，2 个同源双链和 2 个异源双链导致产生 1 条复合的熔解曲线，这种
熔解曲线在形状上与纯合体的曲线不同，所以杂合体样品与纯合体样品可以通过曲线形状更好地区
分（Liew et al.，2004；Palais et al.，2005；Hofinger et al.，2009；赵均良 等，2011）。如果在 PCR
体系中加入已知纯合基因型的 DNA，在一定比例的参比 DNA 存在下，可以放大纯合体之间的差异
进而更好地区分两种纯合体基因型。本试验中研究表明当参比 DNA 的量为 20%时，HRM 具有良好
的分型效果。
（2）DNA 质量与 PCR 体系的均一性。由于 HRM 的分辨率较高，PCR 体系中极小的差异也会
影响反应结果，因此要确保模板 DNA 中无杂质及 PCR 体系均一。
10 期 苏晓梅等：番茄抗病基因 Tm-2、Pto、Sw-5 和 Ve1 的 SNP 标记检测 2019

（3）PCR 产物长度。研究表明 PCR 产物大于 300 bp 对 HRM 的敏感性和特异性有影响，最适
宜的 PCR 产物长度为 80 ~ 200 bp（Reed & Wittwer，2004；Hofinger et al.，2009；Ye et al.，2010）。
本试验开发的标记扩增产物均在 80 ~ 200 bp 之间，使用效果较好。
（4）SNP 个数。Park 等（2009）的研究表明不同 SNP 个数对 HRM 分型结果有很大影响。其
中扩增产物中只含有 1 个 SNP 位点或是单碱基的 InDel 时，分型成功率最高。扩增产物含有 SNP
位点个数越多或者是较长的 InDel 时，分型结果越差。
HRM 对于检测单个 SNP 非常有效，而且操作比较简单，但 1 次只能检测 1 个位点，不适宜多
个位点的同时检测。该方法所需的仪器设备较为昂贵，限制了其在普通实验室的应用。
本研究中针对已克隆的 4 个抗病基因开发的 5 个 SNP 标记均为基因内部的功能标记，不存在因
交换而导致的假阳性问题，且扩增稳定，基因分型清晰，能有效鉴定抗病基因。随着番茄基因组测
序的完成，大量的基因被克隆。据统计，番茄基因组中有 36 232 个基因，有基因序列的为 1 434 个，
而有标记的仅有 132 个（http：//solgenomics. net），还不完全是功能标记。根据已知基因序列开发功
能性标记是番茄育种的重要研究内容，基于 HRM 技术的 SNP 检测是其中重要的一项内容。高效准
确的功能标记的开发及应用将大大促进中国番茄育种进程，缩短与国外先进育种公司的差距。

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