全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（4）：724–732 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–12–24；修回日期：2013–02–26
基金项目：国家现代梨产业技术体系建设专项项目（nycytx-29-14）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ywteng@zju.edu.cn）
梨两个休眠相关 MADS-box 基因特征及在其休
眠过程中的表达分析
刘国琴 1,2，郑鹏华 1，Sayed Hussain1，滕元文 1,*
（1 浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058；2 贵州大学农学院，贵阳
550025）
摘 要：PpMADS1 和 PpMADS2 是从‘酥梨’（Pyrus pyrifolia white pear group‘Suli’）休眠芽转录组
文库筛选的两个与休眠相关的 MADS-box 基因序列。为了解序列的特征，对其进行了相关生物信息学分
析，并以‘翠冠’和‘圆黄’梨为试材，用实时定量 PCR 技术分析其花芽休眠不同阶段的表达变化。结
果表明：两个基因都具有 MADS-box 家族的特征序列 MIKC-基序，PpMADS1 和 PpMADS2 分别与日本梨
（P. pyrifolia‘Kosui’）休眠相关的两个 MADS-box 基因 PpMADS13-1 和 PpMADS13-2 聚在一起，且单独
聚为一支，与李属植物休眠相关的 MADS-box 基因关系最近。在两个品种的休眠过程中，PpMADS1 和
PpMADS2 的表达呈现相似的变化趋势，都有一个表达高峰，但‘翠冠’梨 PpMADS1 和 PpMADS2 的表
达高峰均出现在 11 月 15 日，而‘圆黄’梨 PpMADS1 的表达高峰延后到 12 月 30 日，PpMADS2 的表达
高峰出现在 12 月 15 日。两个品种 PpMADS1 和 PpMADS2 的表达高峰都出现在内休眠解除之前，随内休
眠解除其表达量下调，在生态休眠阶段表达量维持在较低的水平。据此推测 PpMADS1 和 PpMADS2 的表
达对梨芽内休眠的解除具有调控作用。
关键词：梨；芽；休眠；MADS-box 基因；表达分析
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）04-0724-09

Characteristics of Two Dormancy-associated MADS-box Genes in Pear and
Their Expression Analysis During the Dormancy
LIU Guo-qin1,2，ZHENG Peng-hua1，Sayed Hussain1，and TENG Yuan-wen1,*
（1Department of Horticulture，State Agricultural Ministry Key Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development ＆
Quality Improvement，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2 College of Agriculture，Guizhou University，
Guiyang 550025，China）
Abstract：Two dormancy-associated MADS-box genes（PpMADS1 and PpMADS2）were obtained
from transcriptome library constructed Pyrus pyrifolia white pear group‘Suli’. To understand sequence
characteristics of two genes，bioinformatics analysis was carried out. Furthermore the gene expression
patterns in lateral flower buds of both pear cultivars‘Cuiguan’and‘Wonhwang’were analyzed during the
period of dormancy by quantitative real-time PCR. The results showed that PpMADS1 and PpMADS2
contained well-conserved MIKC-motifs of MADS-box. A phylogenetic analysis revealed that PpMADS1

4 期 刘国琴等：梨两个休眠相关 MADS-box 基因特征及在其休眠过程中的表达分析 725

was closely related to PpMADS13-1 of Japanese pear（P. pyrifolia‘Kosui’），whereas PpMADS2 was
similar to PpMADS13-2 of Japanese pear. The pear DAM genes formed an independent subclade and were
closely related to those of Prunus spp. The expression patterns of PpMADS1 and PpMADS2 were similar
with one peak in two cultivars during the period of dormancy. However，the timing of gene expression
peak differed between two cultivars. The PpMADS1 and PpMADS2 expression peak occured on the
November 15th in‘Cuiguan’pear，while the PpMADS1 expression peak on the December 30th，and the
PpMADS2 expression peak on the December 15th in‘Wonhwang’pear. The PpMADS1 and PpMADS2
expression peak appeared prior to the release of endodormancy，and their expression levels were gradually
down-regulated after the turn over of endodormancy and kept at a lower level during the period of
ecodormancy. These results indicated that PpMADS1 and PpMADS2 might play an important role in the
regulation of bud endodormancy-release in pear.
Key words：pear；bud；dormancy；MADS-box gene；expression analysis

芽休眠是落叶果树经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性（Faust
et al.，1997；高东升，2008；Anderson et al.，2010；Campoy et al.，2011）。Lang 等（1987）将休眠
定义为含有分生组织的植物结构可见生长的暂时停止，并将其分为类休眠（paradormancy）、内休眠
（endodormancy）和生态休眠（ecodormancy）3 种类型。落叶果树在生长—休眠—生长的周期循环
中，受许多代谢（如水分代谢、激素代谢、抗氧化代谢和细胞发育等）相关基因的表达调控（刘国
琴 等，2012）。
MADS-box 基因家族编码的是一类高度保守的转录因子，在植物上它们都具有一个共同的结构
特征，即 MIKC–基序，从 N 端到 C 端依次为 M–，I–，K–，C–结构域（Cseke & Podila，2004；
Kaufmann et al.，2005）。MADS-box 基因是一类调节植物生长发育的重要基因，涉及到植物生长发
育的许多方面，如植物花器官的发育、果实的成熟、根和叶的发育、物质和能量代谢、信号的传递
和转导等过程（Messenguy & Dubois，2003；刘月学和李天忠，2008；Jiménez et al.，2009）。Bielenberg
等（2008）在研究桃休眠时，把分离的 6 个 MADS-box 基因分别命名为 PpDAM1 ~ PpDAM6，首次
将与休眠相关的 MADS-box 基因统称为 DAM（dormancy-associated MADS-box）基因。此后，报道
了许多落叶果树 DAM 的表达对休眠地调控，如桃[Prunus persica（L.）Batsch]（Bielenberg et al.，
2008；Li et al.，2009；Leida et al.，2010，2012；Jiménez et al.，2010；Yamane et al.，2011a，2011b）、
梨（P. pyrifolia Nakai）（Ubi et al.，2010）、梅（Prunus mume Siebold Zucc.）（Yamane et al.，2008；
Sasaki et al.，2011）和猕猴桃[Actinidia deliciosa（A. Chev.）C. F. Liang et A. R. Ferguson]（Wu et al.，
2012）。DAM 基因的表达对芽休眠—生长周期，尤其是对落叶果树芽内休眠的解除方面有重要的调
控作用。除此之外，落叶果树 DAM 的功能鉴定也被受到关注。Sasaki 等（2011）对 PmDAM6 进行了
功能鉴定，过量表达 PmDAM6，能抑制杨树生长。
目前关于梨休眠研究主要集中在生理代谢，如呼吸代谢、碳水化合物、蛋白质代谢和需冷量等
方面，其休眠的分子机制研究相对较少（刘国琴 等，2012）。Ubi 等（2010）以日本梨为材料分离
了两个 DAM 基因，并对其休眠过程中的表达变化进行了分析。Liu 等（2012）以‘酥梨’为材料，
利用高通量 RNA-seq 技术对休眠芽转录组分析，获得了 69 393 条独特基因（unigene）。
本研究中以从‘酥梨’休眠芽转录组中得到的 PpMADS1 和 PpMADS2 序列（Liu et al.，2012）
为基础，利用生物信息学方法对其序列和蛋白结构进行分析，并研究其在‘翠冠’和‘圆黄’梨芽
休眠不同发育阶段的表达变化，以期揭示该基因在梨休眠中的调控作用。

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1 材料与方法
1.1 试验材料
‘酥梨’的两个基因 PpMADS1 和 PpMADS2 为本实验室前期研究中获得（Liu et al.，2012）。‘翠
冠’梨（P. pyrifolia‘Cuiguan’）和‘圆黄’梨（P. pyrifolia‘Wonhwang’）均为 10 年生成年结果树，
砧木为豆梨（P. calleryana Decne.），种植于浙江省富阳市千禧园艺场。试验期间未进行修剪和化学
药剂处理。
从 2011 年 9 月 15 日到 2012 年 3 月 15 日，每隔 7 d 或 15 d 采集树冠外围生长发育良好、芽体
饱满的 1 年生枝条 60 枝，每个枝条约 10 个芽。采集后迅速用润湿的布包裹好，防止枝条干燥脱水，
立即带回实验室。其中 12 枝用于室内进行培养，立即把剩余枝条上发育良好的腋花芽取下来，液氮
速冻后–80 ℃冰箱保存待用。
1.2 萌芽率统计
每组 4 个枝条，重复 3 次。将枝条基部剪齐，放在盛有清水的瓶中，以淹没枝条基部 2 ~ 3 cm，
立即放入智能人工气候箱（型号为 PRX-450D，宁波海曙赛福实验仪器厂）中进行培养。培养条件
为：光照 12 h，光照强度 320 mol · m-2 · s-1；温度为昼（25 ± 1.0）℃／夜（18 ± 1.0）℃；空气相对
湿度为 75%。每 2 d 换 1 次水，每次剪除基部少许（约 2 mm），露出新茬。培养 21 d 时统计萌芽率。
以花芽顶端开裂露绿为萌芽标准。萌芽率 ≥ 50%时的采样日期为解除内休眠的日期（高东升 等，
2001；Yooyongwech et al.，2008，2009；毕磊，2009；Leida et al.，2012）。
1.3 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
参照 Chang 等（1993）的 CTAB 方法提取‘翠冠’和‘圆黄’梨花芽不同时期的总 RNA。通
过电泳检测 RNA 质量，利用分光光度计（Beckman DU800，USA）进行定量分析。DNaseⅠ处理和
cDNA 第一链的合成参照 PrimeScriptTM RT reagent（TaKaRa）试剂盒使用说明书进行。
1.4 目的基因的序列分析
以 PpMADS1（KC261355）和 PpMADS2（KC261356）基因的序列为基础（Liu et al.，2012），
利用 NCBI 数据库的 tBLASTx 进行同源性比对分析；利用 DNAStar 软件进行开放阅读框的查询；
利用 Protparam 程序预测分子量和理论等电点，利用 ClustalX 2.0 软件进行多序列对齐和排序，使用
MEGA4 软件输出进化树（Tamura et al.，2007）。
1.5 实时定量 PCR 分析
以梨的 actin 基因（PpActin，JN684184）为内参基因，正向引物为：5′-CCATCCAGGCTGTT
CTCTC-3′，反向引物为：5′-GCAAGGTCCAGACGAAGG-3′。根据目的基因的序列在靠近基因的 5′
端采用 Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量 PCR 的上、下游引物，PpMADS1 的正向引物为：
5′-AGCGATCTTTCCTTTCTT-3′，反向引物为：5′-CTTCGTTGAGGGGTCTTA-3′；PpMADS2 的正向
引物为：5′-TTGCTGGCTTTTCTTTCG-3′，反向引物为：5′-TCTTGCTACCCCTTCGTT-3′。实时定量
PCR 产物进行再测序验证。
荧光定量的反应体系为：总体积 20 μL，包括 2.0 μL 稀释 cDNA，上游、下游引物（10 μmol · L-1）
各 0.4 μL，10.0 μL of SYBR® Premix Ex TaqTM（TaKaRa，中国大连）和 7.2 μL 灭菌双蒸水。反应在
LightCycler 1.5（Roche，德国）仪器上进行，程序为：95 ℃ 30 s；40 个循环的 95 ℃ 10 s 和 60 ℃
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20 s。每一轮反应均设阴性对照，设 3 次重复，采用 2-ΔΔCT 方法分析数据（Livak & Schmittgen，2001）。
1.6 数据处理
采用 Excel 软件进行数据整理和作图，用 DPS 7.05 软件进行统计分析，统计方法采用最小显著
差数法（LSD）（P < 0.05）。
2 结果与分析
2.1 PpMADS1 和 PpMADS2 的序列分析
PpMADS1 包含 684 bp（第 535 ~ 1 218 个碱基）的开放阅读框，编码 227 个氨基酸。PpMADS2
包含 705 bp（第 211 ~ 915 个碱基）的开放阅读框，编码 234 个氨基酸。经 Protparam 程序预测，
PpMADS1 的理论分子量为 25.18 kD，理论等电点为 5.13。PpMADS2 的理论分子量为 26.29 kD，理
论等电点为 7.64。将预测的 PpMADS1 和 PpMADS2 氨基酸序列与日本梨以及李属的植物甜樱桃
MADS-box 基因进行比对，发现 PpMADS1 和 PpMADS2 含有 MADS-box 基因的典型特征 MIKC–
基序。M–结构域最为保守，大约 60 个氨基酸长度，可变的 I–结构域大约 30 氨基酸，连接 M–
结构域和 K–结构域。K–结构域大约 70 个氨基酸长度，连接在长度和序列上变化最大的和重要功
能的 C–结构域，其中 LEDDCSD 基序在 C–结构域（图 1）。

图 1 ‘酥梨’MADS-box 基因预测的氨基酸序列的比对
PpMADS1 和 PpMADS2 来自‘酥梨’；PpMADS13-1（AB504716）和 PpMADS13-2（AB504717）来自日本梨；
PaMADS1（EU196363）来自甜樱桃。
Fig. 1 Alignment of predicted amino acid sequences of MADS-box genes of‘Suli’pear
PpMADS1 and PpMADS2 from P. pyrifolia white pear group were aligned with MADS-box genes PpMADS13-1（AB504716）
and PpMADS13-2（AB504717）from P. pyrifolia and PaMADS1 from Prunus avium（EU196363）.
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系统发育分析显示，梨的 DAM 基因与李属植物（桃、梅和甜樱桃）的 DAM 基因聚在一起，
并且梨的 DAM 基因单独聚成一支。PpMADS1 与 PpMADS13-1 聚在一起，而 PpMADS2 与
PpMADS13-2 聚在一起（图 2）。



图 2 梨与其它植物 MADS-box 基因氨基酸序列的进化树分析
图中数字表示自展支持率。
Fig. 2 Phylogenetic tree of MADS-box of pear and other plant species
The numbers on the tree represent bootstrap values.

2.2 ‘翠冠’和‘圆黄’梨花芽休眠进程的差异
为了研究‘翠冠’和‘圆黄’梨花芽在休眠过程中 PpMADS1 与 PpMADS2 的表达，界定其在
休眠进程中的休眠状态是非常必要的。由图 3 可知，‘翠冠’和‘圆黄’梨花芽在休眠进程上存在差
异。‘翠冠’梨花芽在 10 月 30 日到 11 月 30 日期间萌芽率维持在较低的水平，到 12 月 15 日时萌芽
率上升到 41%，12 月 22 日时萌芽率为 75%。萌芽率高于 50%表示内休眠解除，进入生态休眠阶段。
‘圆黄’梨花芽在 10 月 30 日和 11 月 15 日还维持一定水平的萌芽率，11 月 30 日和 12 月 15 日萌
芽率为 0，完全处于内休眠状态，12 月 22 日到 1 月 13 日萌芽率逐渐增加，到 1 月 30 日萌芽率高于
50%，内休眠解除，进入生态休眠阶段。
结果表明，‘翠冠’梨花芽内休眠解除的时间比‘圆黄’梨早。

4 期 刘国琴等：梨两个休眠相关 MADS-box 基因特征及在其休眠过程中的表达分析 729












图 3 梨两个品种的萌芽率
误差条表示标准误（n = 3），下同。
Fig. 3 Percentage of bud break for two pear cultivars
Bars represent the standard error（n = 3），the same below.

2.3 PpMADS1 和 PpMADS2 在‘翠冠’梨花芽中的表达
用实时定量 PCR 分析 PpMADS1 和 PpMADS2 在‘翠冠’梨花芽在休眠过程中的表达模式，结
果显示，在 9 月到第 2 年的 2 月期间，‘翠冠’梨花芽的 PpMADS1 与 PpMADS2 表达水平有相似的
变化趋势，并且两个基因的表达变化与‘翠冠’梨花芽的休眠状态的转变有关（图 4）。在 11 月 15
日之前，PpMADS1 与 PpMADS2 表达水平呈增加的趋势，11 月 15 到 12 月 15 日内休眠期间维持在
相对较高的表达水平。12 月 22 日内休眠解除后，其表达水平迅速降低，在 1 月 13 日到 2 月 15 日
生态休眠阶段，表达量一直维持在一个较低的水平。


图 4 ‘翠冠’梨腋花芽休眠过程中 PpMADS1 和 PpMADS2 的表达变化
Fig. 4 Expression change of PpMADS1 and PpMADS2 of lateral flower buds during the dormancy in‘Cuiguan’pear

2.4 PpMADS1 和 PpMADS2 在‘圆黄’梨花芽中的表达
由图 5 可看出，11 月 15 日到 12 月 15 日，‘圆黄’梨花芽的 PpMADS1 表达量维持在相对稳定
的低水平，此后表达量急剧增加，12 月 30 日到达一个高峰，此后随着其内休眠的解除表达量逐渐
降低，在竖年 2 月 15 日到 3 月 15 日生态休眠期间，其表达量处于一个相对较低的水平。‘圆黄’梨
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花芽的 PpMADS2 表达随着内休眠的解除也呈现下调的变化趋势，生态休眠阶段 1 月 30 日后表达量
很低。

图 5 ‘圆黄’梨腋花芽休眠过程中 PpMADS1 和 PpMADS2 的表达变化
Fig. 5 Expression change of PpMADS1 and PpMADS2 of lateral flower buds during the dormancy in‘Wonhwang’pear

3 讨论
PpMADS1 和 PpMADS2 序列分别含有 684 bp 和 705 bp 的完整开放阅读框。多序列比较结果显
示，PpMADS1 和 PpMADS2 氨基酸序列具有其它植物 MADS-box 转录因子的特征信号序列 MIKC–
基序（Cseke & Podila，2004；Kaufmann et al.，2005；Ubi et al.，2010）。本研究结果分析的 PpMADS1
理论分子量为 25.18 kD，理论等电点为 5.13。PpMADS2 的理论分子量为 26.29 kD，理论等电点为
7.64。通过生物信息学分析，发现 PpMADS1 和 PpMADS2 序列与其它落叶果树休眠相关的 MADS-box
（DAM）基因（Bielenberg et al.，2008；Yamane et al.，2008；Jiménez et al.，2009；Ubi et al.，2010；
Sasaki et al.，2011）有较高的同源性。这两条序列与已知的日本梨的 DAM 基因有高的相似度，比
对的 E 值都小于 10-150，核苷酸序列同源性高于 90%。从构建的系统树来看，PpMADS1 和 PpMADS2
与日本梨休眠相关的 MADS-box 基因聚为独立的一支，且与桃和梅等李属植物 DAM 基因聚在一起。
这些结果表明 PpMADS1 和 PpMADS2 是梨树休眠相关的 MADS-box 基因。
PpMADS1 和 PpMADS2 在‘翠冠’和‘圆黄’梨腋花芽中的季节性表达变化呈现相似的变化趋
势（图 4 和图 5），都有一个表达高峰，所不同的是‘翠冠’梨 PpMADS1 和 PpMADS2 的表达高峰
早于‘圆黄’梨。并且两个品种的 PpMADS1 和 PpMADS2 的表达高峰都出现在内休眠期间，而且延
续到解除之前（图 3 ~ 图 5）。内休眠解除后两基因表达量急剧降低，在生态休眠阶段表达量维持在
较低的水平。这与 PpMADS1 和 PpMADS2 在‘酥梨’（Liu et al.，2012）和 PpMADS13-1 和 PpMADS13-2
在‘Kosui’（Ubi et al.，2010）的表达呈现类似的变化趋势。由此说明，PpMADS1 和 PpMADS2 对
梨两个品种芽的内休眠解除具有调控作用。Leida 等（2010）研究发现 DAM6 在桃的两个品种上表
达模式不同，品种‘Zincal 5’DAM6 开始下调的时间比‘Springlady’大约要提前一个月。这与两
个品种芽的休眠状态不同有关，桃‘Zincal 5’芽内休眠解除的时间比‘Springlady’要早，且随着
内休眠的解除 DAM6 在这两个品种上的表达量都下调。Yamane 等（2011a，2011b）也报道了在田
间自然条件下，桃侧叶芽和侧花芽 PpDAM5 和 PpDAM6 在内休眠期间上调表达，内休眠解除后下
调。Sasaki 等（2011）也报道梅 PmDAM6 的表达与梅芽内休眠的解除呈负相关关系。从这些结果，
4 期 刘国琴等：梨两个休眠相关 MADS-box 基因特征及在其休眠过程中的表达分析 731

推测梨的 DAM 对梨树芽内休眠的解除发挥重要的调控作用。
综上所述，本研究中分析了 PpMADS1 和 PpMADS2 序列特征，并对其在‘翠冠’和‘圆黄’
梨芽休眠进程中的表达变化进行了比较，‘翠冠’和‘圆黄’梨花芽的 PpMADS1 和 PpMADS2 表达
高峰都出现在内休眠解除之前，随内休眠解除其表达量下调，在生态休眠阶段表达量维持在较低的
水平。可见，PpMADS1 和 PpMADS2 对梨芽内休眠的解除起调控作用。本研究为进一步开展梨树
DAM 的功能鉴定、DAM 的表观遗传、分子和生化方面在环境适应性方面的研究提供了重要信息。
有关梨 DAM 的家族成员及 PpMADS1 和 PpMADS2 的功能分析仍需继续研究。

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