全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 11 2291 2298 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–18；修回日期：2014–10–08
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）；江苏省自然科学基金—青年基金项目（BK20140714）；高等学校博士学
科点专项科研基金项目（20130097120013）；国家自然科学基金项目（31400584）
C茶树 sSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分
析
胡靖妍，朱旭君，王伟东，王明乐，尹 盈，黎星辉*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：为探究精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系，
以茶树品种‘迎霜’为试验材料，利用简并引物 PCR 扩增技术结合 5′/3′RACE 方法，获得与低温胁迫相
关的 CsSPMS 片段 cDNA 全长序列（GenBank 登录号为 KJ580429）。该序列全长 1 374 bp，包含 1 113 bp
的完整开放阅读框（ORF），编码 371 个氨基酸，预测分子量 41.28 kD；构建亚细胞定位载体
pJIT166-GFP/SPMS，亚细胞定位结果显示 CsSPMS 定位在细胞核上。荧光定量 PCR 分析表明 CsSPMS 在
根、茎、叶、芽、花和果中都有表达，在根、茎中表达量较高；低温胁迫处理下不同组织 CsSPMS 的表
达量，在叶片中 2 h 达到峰值，而在根中 12 h 达到高峰；在低温条件下 4 个茶树品种的耐寒性与 CsSPMS
表达量密切相关。
关键词：茶树；CsSPMS；亚细胞定位；基因克隆；基因表达
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2291-08

Cloning and Expression Analysis of CsSPMS in Tea Plant
HU Jing-yan，ZHU Xu-jun，WANG Wei-dong，WANG Ming-le，YIN Ying，and LI Xing-hui*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：In order to explore the relationship between spermine synthase（SPMS）and cold resistance
of tea plant（Camellia sinensis），the full-length cDNA sequence of SPMS gene was cloned using reverse
transcription-PCR（RT-PCR）combined with RACE techniques from tea plant cultivar‘Yingshuang’. This
gene was named CsSPMS with GenBank accession number KJ580429. It was 1 374 bp in length，
containing a 1 113 bp open reading frame（ORF）which encoded 371 amino acid residues of 41.28 kD
molecular weight. The localization assays indicated that CsSPMS protein localized in the cell nucleus，
after observing its subcellular localization by the fusion expression vector pJIT166-GFP/SPMS. CsSPMS
gene expressed in all the tissues，including root，stem，leaf，flower and fruit analyzed by quantitative
real-time PCR（qRT-PCR），the highest expression level were in root and stem. The qRT-PCR analysis also
indicated that the expression level of CsSPMS was up-regulated in roots，stems and leaves by cold
treatment. The top expression level of CsSPMS in leaves was after 2 h treatment，while after 12 h treatment


* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lxh@njau.edu.cn；Tel：025-84395182）
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in roots. Furthermore，cold resistance of four tea plant cultivars is closely related to expression levels of
CsSPMS under low temperature condition.
Key words：tea plant；Camellia sinensis；CsSPMS；subcellular localization；gene cloning；gene
expression

低温是限制农作物生长和地理分布的重要的非生物胁迫因子（Thomashow，1999）。如何提高
茶树抗寒性，一直是茶叶生产与理论研究上迫切需要解决的问题。研究与了解茶树对低温的抗逆机
制，有针对性地发掘相关抗性基因并加以利用，对茶树抗逆育种有非常重要的意义。
多胺可通过氨丙基转移酶参与植物多种生理代谢调节过程，尤其在提高植物抵抗逆境胁迫中起
到了重要作用（Wimalasekera et al.，2011；Iacomino et al.，2012；Moschou et al.，2012；Tanou et al.，
2013；Espasandin et al.，2014）。多胺作为一种与植物抗逆性有关的物质，能够缓解植物所受到的伤
害（Groppa & Beravides，2008）。近年来的研究表明（Kovács et al.，2010；Lee et al.，2012）多胺
作为抗性物质或信号传导物质参与小麦、拟南芥等抵御低温胁迫。研究发现，腐氨酸可以作为对番
茄叶片冷胁迫的响应物质（Kim et al.，2002），同时，腐氨酸合酶缺失型拟南芥抗低温胁迫的能力
明显下降（Cuevas et al.，2008）。外源亚精胺和精胺可以提高冷胁迫香蕉叶中过氧化物酶的活性，
提高香蕉的抗寒能力（周玉萍，2003）。亚精胺在抵御黄瓜低温胁迫中也起到了重要作用（Shen et al.，
2000）。
拟南芥和水稻中多胺生物合成路径已经基本探明有两条合成腐胺的途径，腐胺作为合成过程中
最初的一种多胺在特定酶的作用下不断地添加氨丙基形成亚精胺和精胺，与此同时，甲硫氨酸脱去
羧基也能形成亚精胺和精胺（Kusano et al.，2007）。从腐胺到精胺的生物合成，是经过两个合成酶
—亚精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）和精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）的催化。
SPDS 催化腐胺生成亚精胺，拟南芥中研究表明，SPDS 由两个基因编码：spd1 和 spd2（Watson et al.，
1997）。SPMS 催化亚精胺与氨丙基结合生成精胺。而在茶树中未有 SPDS 和 SPMS 基因的报道。
本研究中通过 RT-PCR 和 RACE 技术克隆茶树精胺合成酶基因 CsSPMS 的 cDNA 全长，并对其
进行生物信息学分析和亚细胞定位，采用 qRT-PCR 分析其在不同茶树品种、不同组织器官以及低温
胁迫处理下的表达模式，探究多胺合成酶基因与茶树抗逆性的关系，为茶树抗逆基因工程提供候选
基因资源和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的茶树（Camellia sinensis）材料‘迎霜’、‘龙井 43’、‘白茶 1 号’和‘中茶 108’，于 2013
年春季种植于人工气候箱。经 4 ℃低温处理 0、1、2、4、8、12 和 24 h 分别取样后（设置对照 22 ℃
处理），立即在液氮中固定，并转移至–80 ℃保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α 由南京农业大学茶学研究所实验室保存。r-Taq 酶、Ex-Taq
酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA 连接酶、荧光定量染料 SYBR GreenⅠ，购自 TaKaRa 公司。
1.2 保守片段的克隆
用 RNA Total Kit（天根公司）提取茶树叶片总 RNA。检测 RNA 质量、完整性后，用 M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit（TaKaRa 公司）将 RNA 反转录成 cDNA。根据其他物种 SPMS 序列比对结果设
11 期 胡靖妍等：茶树 CsSPMS 基因全长 cDNA 克隆和时空表达分析 2293
计一对简并引物 P01 和 P02（表 1）。
以茶树叶片 cDNA 第一链为模板进行 PCR 扩增。PCR 条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃
30 s，72 ℃ 60 s，35 个循环；72 ℃延伸 8 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接 pMD18-T
载体并转化至大肠杆菌菌株 DH5α，PCR 鉴定后提取质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3 RACE扩增基因全长
根据上述获得的片段序列设计 5′、3′RACE 引物，并结合通用引物分别扩增出该片段的 5′端和 3′
端的序列，将序列拼接获得 CsSPMS 基因全长，以 P06 和 P07 为嵌套引物扩增该基因（表 1）。扩增
产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，连接 pMD18-T 载体并转化至大肠杆菌菌株 DH5α，PCR 鉴定后提取
质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

表 1 用于基因克隆与基因分析的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in gene cloning and analysis
用途
Use
引物编号
Primer number
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
简并引物 Degenerate primer P01
P02
TGGCCWGGAGARGCNCAYTC
ACCATCTTRTCWATYTCACA
接头引物 Adaptor primer P03 GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT
5′特异扩增 Special amplification of 5′ end
3′特异扩增 Special amplification of 3′ end
P04
P05
TGGGCAGGACCAACAGG
CCTGGTGGTGTTCTTTGT
全长 PCR Full length PCR P06
P07
AGGGTTCTGTCCACTATGC
GGACGAAGAGCCTTTGCTACCG
亚细胞定位 subcellular localization P08
P09
AACAAGCTTATGGAGGACGGCGCAGGAAAA
CCCTCTAGATGAAACACAAATTTGTTGAGC
定量 PCR Real time quantitative PCR P10
P11
GCATCCTATCAATCCTATT
AATCACGAAGAAGCATAA
1.4 序列分析
利用 Lasergene 软件对所得基因进行核苷酸序列的分析、开放性阅读框的查找、氨基酸序列的
翻译等。其他植物的 SPMS 序列均来自 NCBI 数据库，利用 Clustal X2 软件对序列进行多重比对，
用 PHYLIP 法构建系统树并用 TreeView 对系统树进行编辑，形成 SPMS 氨基酸序列的系统进化树。
用 http：//www. expasy. org 在线完成蛋白质基本性质分析。用在线软件 WoLF PSORT（http：//psort.
ims. u-tokyou. ac. jp/form. html）对进行亚细胞定位分析。
1.5 SPMS蛋白的亚细胞定位
将 1.3 中包含 CsSPMS 基因的质粒经 XbaⅠ和 Hind Ⅲ双酶切，回收目的条带；同时 pJIT166-GFP
载体也经 XbaⅠ和 Hind Ⅲ双酶切，回收空载体片段；用 T4 DNA 连接酶连接回收的条带，得到融合
表达载体，命名为 pJIT166-GFP/SPMS，将重组表达载体转入 DH5α，选取阳性克隆提取质粒，对重
组表达载体进行 PCR 和双酶切检测，并测序分析。
亚细胞定位参考杨光等（2011）的方法，加以改进。制备金粒子：取浓度为 50 mg · mL-1 金粉
悬浮液 20 μL，加入 CaCl2（2.5 mol · L-1）50 μL，加入亚精胺（0.1 mol · L-1）20 μL，加入 5 μg
pJIT166-GFP/SPMS 重组表达载体质粒，充分混匀（以 pJIT166-GFP 空载体质粒为对照），转速 12 000
r · min-1 离心 1 min，冰浴 15 min，用 70%乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀 1 次，50 μL 无水乙醇重新悬
浮沉淀。
基因枪轰击洋葱表皮：将幼嫩的洋葱表皮切成约 1 cm 的小块，摆放在 MS 高渗培养基上，25 ℃
黑暗培养 4 h。选用 7 584.5 kPa 的压力膜，在轰击膜中央点上金粉和 pJIT166-GFP/SPMS 重组表达

2294 园 艺 学 报 41 卷
载体质粒混合物，然后在超净工作台中吹干（以 pJIT166-GFP 空载体质粒为对照）。使用 PDS1000/He
型基因枪（Bio-Rad）轰击材料，轰击距离 6 ~ 9 cm，真空度是 84.65 kPa。经处理后的洋葱表皮细胞
经 25 ℃黑暗培养 16 ~ 24 h 后制片，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光在细胞中的分布情况。
1.6 定量PCR分析
利用 Primer Premier 5.0 进行定量引物的设计，采用 ABI 7300 Real-time PCR System，以 β-actin
为内参基因进行荧光定量 PCR 分析。引物序列见表 1。
实时定量 PCR 反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。试验重复 3 次，
利用 LinRegPCR 软件（Ramakers et al.，2003）对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 茶树SPMS基因cDNA全长的克隆
以茶树品种‘迎霜’的 cDNA 为模板，用
简并引物 P01和 P02经 PCR扩增后得到 400 bp
左右的片段。根据测序获得中间片段序列设计
特异引物，利用 RACE 技术进行特异扩增，分
别获得 5′、3′端序列；将两端序列与中间片段
拼接，并在其上、下游另设计引物 P06 和 P07，
PCR 扩增得到茶树 SPMS 基因的全长（图 1）。
利用 Lasergene 软件对 SPMS 基因进行核
苷酸序列分析，序列全长为 1 374 bp，其开放
性阅读框为 1 113 bp，编码 371 个氨基酸，推
测其蛋白质分子量为 41.28 kD，等电点为 5.32。
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测 SPMS 基因 cDNA 序列全长
Fig. 1 Detection the full length of CsSPMS by agarose gel
electrophoresis
2.2 茶树SPMS的氨基酸序列分析
对茶树 SPMS 氨基酸序列进行 Blast 同源性检索与比对，结果表明该蛋白与水稻、拟南芥、白
毛杨等物种相似性较高。对茶树 SPMS 氨基酸序列进行分析，结果显示氨基酸序列第 149 ~ 260 位
具有 6 个典型的保守结构域（图 2，A）。茶树 SPMS 与其他植物 SPMS 氨基酸序列进行多序列比对
表明，中间区域和 C 端区域保守型较强，且都具有能结合 S–腺苷蛋氨酸和脱羧 S–腺苷蛋氨酸（亚
精胺、精胺的前体物）特殊结构域 MotifⅠ-Ⅵ（图 2，B）。因此，该基因属于 SPMS 家族，命名为
茶树精胺合成酶（Camellia sinensis spermine synthase，CsSPMS）（GenBank 登录号为 KJ580429）。
2.3 CsSPMS编码蛋白的亚细胞定位
用 WoLF PSORT 软件进行亚细胞定位预测结果显示，CsSPMS 主要定位在细胞核内。洋葱表皮
亚细胞定位试验的结果也显示 CsSPMS 融合蛋白定位于细胞核内（图 3）。亚细胞定位结果与文献报
道的多胺合成酶蛋白倾向于存在于植物细胞核中（Belda-Palazón et al.，2012）一致。蛋白在细胞中
的定位与其功能存在一定的关系，精胺合酶与亚精胺合酶在细胞核中形成一个氨丙基转移酶二聚体
（代表一种代谢结构），这种结构将底物从一个酶的活性位点高效地传递到另一个酶的活性位点，并
且增加第二个酶活性位点周围的浓度，确保代谢转化的高效性（Panicot et al.，2002；Belda-Palazón
et al.，2012）。因此研究编码蛋白在细胞中的定位有助于进一步鉴定该基因的功能。
11 期 胡靖妍等：茶树 CsSPMS 基因全长 cDNA 克隆和时空表达分析 2295

图 2 茶树 SPMS 的保守域预测及其与其他物种氨基酸序列多重比对
A. 保守域预测；B. 氨基酸比对。红框所示为 6 个保守区域。
Fig. 2 Prediction of the conserved domain and alignment of amino acid of SPMS from tea plant and other plant species
A. Prediction of the conserved domain；B. Alignment of amino acid. The red box marks 6 conservative domains.



图 3 CsSPMS 的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of CsSPMS

2296 园 艺 学 报 41 卷
2.4 CsSPMS在不同组织中的表达
通过荧光定量 PCR 检测在常温（22 ℃）
条件下CsSPMS在不同组织中的表达量（图 4），
CsSPMS 在根和茎中的表达量最高，是叶片、
花、果中表达量的 5 ~ 6 倍，是芽中的 3 倍和
2.5 倍，表明 CsSPMS 在茶树各个组织中都普遍
存在，但表达量存在组织特异性。
图 4 CsSPMS 基因在不同组织中的表达量
Fig. 4 The expression level of CsSPMS in different tissues
2.5 CsSPMS在低温胁迫下不同组织中的表达
如图 5 所示，茶树的根、茎和叶中 CsSPMS
对低温诱导的响应都较快，在处理 1 h 后就有明显上调表达（2.0 倍 ~ 3.5 倍）。在低温处理 2 h 后叶
片中的 CsSPMS 表达量达到峰值，茎部处理 4 h 后达到峰值，而根部则在处理 12 h 后才达到峰值。
各部位 CsSPMS 基因表达量在达到峰值后降低，但一直高于对照水平。

图 6 低温胁迫下 4 个茶树品种的 CsSPMS 表达量
Fig. ant 6 The expression level of CsSPMS in different tea pl
cultivars with or without cold stress
图 5 低温胁迫下不同组织 CsSPMS 基因表达量
Fig. 5 The e cold stress
2.6 CsSPMS 在低温胁迫下不同茶树品种中的表达
耐寒
xpression level of CsSPMS in different tissues under

4个茶树品种中，‘龙井 43’和‘中茶 108’
性较强，‘迎霜’和‘白茶 1 号’耐寒性
较弱 （黄海涛 等，2012）。在常温下，‘龙井
43’的表达量最高，‘中茶 108’的表达量最低，
‘迎霜’和‘白茶 1 号’介于两者之间。低温
处理 12 h 后，CsSPMS 表达量都有不同程度的
升高，与常温相比，‘中茶 108’的上调表达最
高，上升 8.8 倍，表达量最高的是‘龙井 43’
和‘中茶 108’，显著高于‘迎霜’和‘白茶 1
号’，这些结果表明经过低温处理以后，不同茶
树品种的表达量与耐寒性密切相关，在低温条
件下，耐寒性较强品种的表达量高于耐寒性较
弱的品种。
11 期 胡靖妍等：茶树 CsSPMS 基因全长 cDNA 克隆和时空表达分析 2297
3 讨论
本研究中通过 RT-PCR 和 RACE 技术克隆获得茶树中的精胺合成酶 SPMS 基因，与其他植物
SPMS 具有较高的同源性，序列分析表明含有 SPMS 典型的能结合 S–腺苷蛋氨酸和脱羧 S–腺苷蛋
氨酸（亚精胺、精胺的前体物）特殊结构域 Motif Ⅰ~ Ⅵ。WoLF PSORT 进行 CsSPMS 蛋白的亚细
胞定位预测，结果显示 CsSPMS 蛋白最大可能性是定位于细胞核。本研究中通过亚细胞定位试验结
果显示 CsSPMS 蛋白主要定位在细胞核。其他植物 SPMS 的亚细胞定位研究报道（Belda-Palazón et
al.，2012）也一致认为 SPMS 蛋白定位于细胞核。
荧光定量 PCR 结果显示 CsSPMS 受到低温快速诱导，茶树各组织中的 CsSPMS 上调表达到峰值
后又降低并稳定在一定水平，暗示在低温胁迫下 CsSPMS 的上调表达可以启动下游和其它冷胁迫相
关基因的表达，特别是在达到最高值时，从而激活整个冷反应通路，提高植物的耐寒能力（Kasukabe
et al.，2004）。下游基因的上调表达可能对 CsSPMS 有反馈调节（向殿军，2012），使 CsSPMS 的表
达量在达到峰值后又降低。茶树的根、茎、叶等部位在受到低温胁迫后 CsSPMS 等都呈现较大程度
的上调表达，可以推测该基因在低温胁迫下各茶树部位中发挥一定的功能，茶树表现出耐寒性是根、
茎、叶等部位在冷胁迫的不同阶段协同作用的结果。
在低温处理（4 ℃）和对照处理（22 ℃）下，分析 CsSPMS 基因在 4 个茶树品种间的表达量变
化。在低温处理后，耐寒性较强的品种‘龙井 43’的 CsSPMS 基因表达量最高，而耐寒性较弱的品
种‘迎霜’表达量最低，表明 CsSPMS 基因的表达量与品种的耐寒能力相关（李秀芬 等，2004）。
精胺除了具有与耐寒性相关的生理学功能外，还参与植物对其它逆境胁迫的响应。据 Sagor 等
（2013）报道精胺含量与热胁迫呈现相关性，外源精胺能保护拟南芥植株遭受环境热损害，从转录
水平与翻译水平证明了在热胁迫下精胺的增加能保护植株。Shi 等（2010）发现添加外源精胺能使
红橘体内多胺大量累积，通过减少组织损伤与水分流失的方式让植株获得较强的脱水抗性，从而提
高植物的抗旱性。Alet 等（2012）报道用拟南芥突变体基因互补试验证实了，在长期盐胁迫下植株
体内游离态精胺的生理功能。对于 CsSPMS 基因功能的挖掘和鉴定，在茶树缺乏有效稳定的转化体
系情况下，可以使用拟南芥突变体植株，应用基因互补技术，从另一个侧面进一步阐述 SPMS 抗逆
相关的生物学功能。

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