全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（10）：1613–1620
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–04–19；修回日期：2010–08–06
基金项目：农业部‘948’项目（2006-G13）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2060302-2-09）；公益性行业科研（农业）
专项（200903016）；农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
* E-mail: fy_zhuang @caas.net.cn
胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导
庄飞云*，裴红霞，欧承刚，胡 鸿，赵志伟，李金荣
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：选用胡萝卜 7 个常规品种、10 个自交系、16 个 F1 代杂交种和 6 个 F2 代材料研究基因型、
植物生长调节剂、AgNO3以及低温预处理（4 ℃）对花药培养的影响。在参试的 39 份材料中有 6 份材料
产生小孢子胚状体，其中 50071 号材料出胚率最高，达到 3.89%，有 30 份材料产生小孢子愈伤组织，其
中 600Q6 号材料出愈率达到 36.70%。在 B5 培养基上添加 2,4-D 和 NAA 组合中，选用的 4 份参试材料均
产生小孢子愈伤组织，其中 50071 和 70Q67 号材料产生胚状体，而添加 6-BA 和 NAA 组合中均未产生胚
状体和愈伤组织。培养基中添加 AgNO3 对部分材料的出胚率有一定促进作用，50071 和 70Q67 号材料在
8 mg · L-1 AgNO3 下出胚率分别达到 10.00%和 2.00%。低温预处理对部分材料的胚状体及小孢子愈伤组
织形成有一定作用，50069 号材料经 4 ℃ 1 d 预处理出胚率达 1%，预处理 2 d 和 3 d 出愈率均达到 11.25%，
70Q67 号材料在 3 d 预处理后出胚率达到 4.00%。经细胞学鉴定，在 121 株由胚状体产生的再生植株中
93.39%为二倍体，说明胡萝卜花药培养过程中易发生自然加倍。
关键词：胡萝卜；花药培养；胚状体；小孢子愈伤组织；自然加倍
中图分类号：S 631.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）10-1613-08

Induction of Microspores-derived Embryos and Calli from Anther Culture
in Carrot
ZHUANG Fei-yun*，PEI Hong-xia，OU Cheng-gang，HU Hong，ZHAO Zhi-wei，and LI Jin-rong
（Key Laboratory of Horticultural Crops Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Institute of Vegetables and
Flowers，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China）
Abstract：The influence of genotype，hormone，AgNO3 and low temperature (4 ℃) on anther culture
of carrot (Daucus carota L.) was investigated with 7 open pollinated cultivars，10 inbred lines，16 F1 and 6
F2. Microspore embryogenesis occurred on six accessions and the highest frequency was 50071 with
3.89%. Thirty accessions formed the calli derived from microspores and 600Q6 had the highest frequency
with 36.70%. On the B5 media with 2,4-D and NAA，all of four tested accessions formed the calli，and
both of 50071 and 70Q67 formed the microspores-derived embryos，but none on the media with 6-BA and
NAA. 50071 and 70Q67 were induced about 10.00% and 2.00% of embryos on the media with 8 mg · L-1
AgNO3，respectively. Low temperature was effective on some accessions to form embryos and calli. 50069
had the embryo ratio of 1% under the treatment of 1 d，and the callus ratio of 11.25% under the treatment
of 2 d and 3 d，respectively. 70Q67 had the embryo ratio of 4.00% with 3 d treatment. About 93.39% plants

1614 园 艺 学 报 37 卷
were diploid among 121 plantlets regenerated from embryos with cytogenetic analysis，which was
regarded as the result of spontaneous diploidization during anther culture.
Key words：carrot；anther culture；microspore-derived embryo；callus；spontaneous diploidization

单倍体技术的快速发展，成为许多植物创制纯合自交系的有效途径之一（Maluszynski et al.，
2003；Palmer et al.，2005；张晓伟 等，2008）。现有研究表明，胡萝卜花药培养受到基因型、小孢
子发育时期、植物生长调节剂、低温预处理以及供体植株生长条件等影响（Andersen et al.，1990；
Matsubara et al.，1995；Adamus & Michalik，2003；Górecka et al.，2005）。Andersen等（1990）首
先通过花药培养获得了胡萝卜单倍体植株，产生胚状体和小孢子愈伤组织比例为0.8%，而游离小孢
子培养仅获得了小的愈伤组织，没有产生胚状体和再生植株。Adamus和Michalik（2003）对21份不
同胡萝卜基因型材料进行花药培养，其中8份材料产生胚状体，最高出胚率为1.2%，17份材料产生
小孢子愈伤组织，最高出愈率为20.8%。AgNO3可以明显促进芸薹属和马铃薯等作物花药培养的胚
状体形成（Biddington et al.，1988；Tiainen，1992），但在胡萝卜花药培养研究中未见报道。
本研究中选用不同基因型胡萝卜材料，包括橘红色栽培类型（黑田类型、南特斯型、皇帝型、
丹佛斯型和阿姆斯特丹型），黄根和紫根类型，以及不同类型材料之间杂交的F1和F2代植株，在植
物生长调节剂、AgNO3、低温预处理等方面深入进行研究，为推进胡萝卜花药培养研究提供有效数
据。
1 材料与方法
1.1 材料
2006—2008 年共选用 39 份不同基因型材料进行花药培养，包括 7 个常规品种、10 个自交系、
16 个 F1 代杂交种、以及 6 个 F2 代材料（表 1），其中时田五寸（50038）、Beta Ⅲ（50069）和 HCM
A.C.（50071）重复 3 年，6524B（50359）、2327（60120）、Amsterdam × 2327（600Q6）、超级黑田
五寸 × 5238B（60Q10）和 Touchon × 山西绛紫（60Q14）重复 2 年。选用 50069、50071、70Q67
和 70Q74 作为研究植物生长调节剂、AgNO3、低温预处理等因素的试材。
1.2 花药培养
3 月中旬种植胡萝卜种根，5 月初至 6 月上旬选择健康花序，用 1%的醋酸洋红进行小孢子发育
时期鉴定，选取小孢子处于单核中期前后的花蕾进行花药培养。花序先用 75%乙醇浸泡 1 min，10%
次氯酸钠处理 15 min，无菌水冲洗 3 次，拨取花药接种到诱导培养基上。花药接种后先在 32 ℃培
养箱中处理 48 h，再在 25 ℃进行暗培养（Górecka et al.，2005）。
基因型材料筛选、AgNO3 处理和低温预处理使用的诱导培养基均为 B5 + 2,4-D 0.1 mg · L-1 +
NAA 0.1 mg · L-1 + Gln 500 mg · L-1 + Ser 100 mg · L-1 + 蔗糖 10% +琼脂 0.7%，pH 5.8（Andersen et
al.，1990）。
AgNO3 设定 0、4 和 8 mg · L-1 3 个浓度处理。低温预处理设计为将花药置于 4 ℃冰箱中处理 0、
1、2 和 3 d。植物生长调节剂组合设计 12 个处理（表 3）（Matsubara et al.，1995；Adamus & Michalik，
2003），添加到上述不含 2,4-D 和 NAA 培养基中。每个试验处理至少重复 5 皿，每皿接种 20 个花
药。每隔 30 d 观察 1 次，记录产生胚状体和小孢子愈伤组织的花药数，采用 DPS 软件中的邓肯氏
新复极差测验进行方差分析。
10 期 庄飞云等：胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导 1615

表 1 用于花药培养的不同基因型材料
Table 1 Different genotype accessions selected for anther culture
编号
Code
材料名称
Name
类型
Type
来源*
Source*
50003 F8-4-4 丹佛斯型自交系 Danvers，inbred line 1
50006 F8-4-1 丹佛斯型自交系 Danvers，inbred line 1
50038 时田五寸 Shitian 5 cun 黑田类型常规种 Kuroda，op variety 2
50069 Beta Ⅲ 皇帝型自交系 Imperator，inbred line 3
50071 HCM A.C. 皇帝型自交系 Imperator，inbred line 3
50073 6274B 南特斯型自交系 Nantes，inbred line 3
50075 Touchon 南特斯型常规种 Nantes，op variety 4
50208 改良黑田五寸 Gailiang Heitian 5 cun 黑田类型常规种 Kuroda，op variety 2
50292 Puma 南特斯型常规种 Nantes，op variety 4
50317 2005-071 南特斯型常规种 Nantes，op variety 5
50358 5238B 皇帝型自交系 Imperator，inbred line 3
50359 6524B 南特斯型自交系 Nantes，inbred line 3
50363 东方红秀 × Amsterdam Dongfang Hongxiu × Amsterdam F2 1
50368 002-M1645 × HCM A.C. F1 1
50370 F8-4-1 × HCM A.C. F1 1
50374 7262B × HCM A.C. F1 1
60120 2327 南特斯型自交系 Nantes，inbred line 3
60Y15 9304B 皇帝型自交系 Imperator，inbred line 3
60D15 山西细心黄 Shanxi Xixinhuang 黄根栽培种 Yellow root，cultivar 1
60D25 7262B 紫根自交系 Purple root，inbred line 3
600Q2 (F8-4-1 × HCM A.C.) × 2327 F1 1
600Q6 Amsterdam × 2327 F1 1
60Q10 超级黑田五寸 × 5238B Chaoji Heitian 5 cun × 5238B F1 1
60Q12 Little × 山西绛紫 Little × Shanxi Jiangzi F1 1
60Q14 Touchon × 山西绛紫 Touchon × Shanxi Jiangzi F1 1
60Q17 山西绛紫 × Beta Ⅲ Shanxi Jiangzi × Beta Ⅲ F1 1
60Q22 （超级黑田五寸 × HCM A.C.）× 2327
（Chaoji Heitian 5 cun × HCM A.C.）× 2327
F1 1
70ADD Amsterdam 阿姆斯特丹型常规种 Amsterdam，op variety 6
70Q18 [(F8-4-1 × HCM A.C.) × 2327]-11 F2 1
70Q20 [(F8-4-1 × HCM A.C.) × 2327]-15 F2 1
70Q27 (Amsterdam × 2327)-2 F2 1
70Q33 (Amsterdam × 2327)-18 F2 1
70Q36 3080B × 时田五寸 3080B × Shitian 5 cun F2 1
70Q67 F8-9-5-9 × 2327 F1 1
70Q69 F8-2-1 × 3080B F1 1
70Q73 6274B × 澳 K 6274B × Ao K F1 1
70Q74 2005-071 × 时田五寸 2005-071 × Shitian 5 cun F1 1
70Q77 山西绛紫 × Little Shanxi Jiangzi × Little F1 1
70Q78 山西绛紫 × F8-4-1 Shanxi Jiangzi × F8-4-1 F1 1
*：1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所；2. 日本；3. 美国；4. 法国；5. 俄罗斯；6. 荷兰。
*：1. Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences；2. Japan；3. USA；4. France；5. Russia；6. Netherland.
1616 园 艺 学 报 37 卷
1.3 再生植株细胞学鉴定
将小孢子形成的胚状体转接到分化培养基上（1/2 MS + 蔗糖 1% + 琼脂 0.7%），4 周后长成再
生植株。
将再生植株驯化移栽至日光温室中，随机选取 121 株进行染色体倍性鉴定。具体方法参照裴红
霞等（2008）稍作改动：选取 1 cm 左右的幼嫩根尖，用 0.002 mol · L-1 的 8–羟基喹啉溶液处理 3 h
后，放入卡诺溶液（无水乙醇︰冰醋酸 = 3︰1）中处理 24 h，用蒸馏水清洗 3 次后放入酶液中（4%
纤维素酶和 1%果胶酶，用柠檬酸缓冲液溶解），37 ℃水浴锅中酶解 60 min。将根尖放在载玻片上，
用卡宝品红溶液染色，敲片，在 ZEISS Axioskop 40 显微镜下观察照相，分析各再生植株的染色体
倍性。
2 结果与分析
2.1 基因型对小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
花药培养40 d后部分花药壁逐渐愈伤化，形成绿色、淡绿色或者淡黄色体细胞愈伤组织（图1，
a）。
培养60 d后部分花药发生破裂，产生质地较为紧密的淡黄色愈伤组织，成为小孢子愈伤组织（图
1，b），或者形成的淡黄色小孢子胚状体（图1，c）。
图 1 花药培养获得小孢子愈伤组织及胚状体
a：花药壁产生的体细胞愈伤组织；b：小孢子愈伤组织；c：胚状体。
箭头所指为破裂的花药。
Fig. 1 Calli and embryos derived from microspores in anther culture
a：Somatic cell callus；b：Microspore callus；c：Embryo.
Arrow showing the broken anther.


在39份材料中，所有材料均产生不同比例的体细胞愈伤组织（在2% ~ 30%之间），有6份材料产
生胚状体，分别是50317、50358、50359、50071、600Q2及70ADD，其中50071号材料出胚率最高达
3.89%，有30份材料产生小孢子愈伤组织，其中600Q6号材料出愈率达到36.70%（表2）。
同一基因型材料在不同年份中产生的结果差异较大（表2）。50071号材料在2006年没有产生胚
状体，2007年和2008年出胚率分别是3.89%和1.43%；3年均产生小孢子愈伤组织，其中2006年和2007
出愈率分别是11.50%和18.00%，而2008年只有1.43%。50069号材料在3年中产生的出愈率分别是
13.90%、2.00%和3.75%。600Q6号材料在2007年和2008年产生的出愈率分别是36.70%和2.00%。

10 期 庄飞云等：胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导 1617

表 2 不同基因型材料产生的小孢子胚状体和愈伤组织比率
Table 2 The frequency of microspore embryos and callus induced from different genotype accessions
年份
Year
编号
Code
花药数
Number of
anthers
出胚花药数
Number of anther with
embryos
出胚率/ %
Embryos
frequency
出愈花药数
Number of anther
with calli
出愈率/ %
Calli frequency
50003 300 0 0 46 15.33
50006 300 0 0 72 24.00
50038 600 0 0 1 0.17
50069 840 0 0 117 13.90
50071 1440 0 0 160 11.50
50073 300 0 0 5 1.67
50075 300 0 0 41 13.67
50208 300 0 0 67 22.33
50292 300 0 0 89 29.67
50317 300 1 0.33 9 3.00
50358 900 1 0.11 44 4.89
50359 300 1 0.33 0 0
50363 300 0 0 3 1.00
50368 300 0 0 48 16.00
50370 300 0 0 32 10.67
2006
50374 300 0 0 6 2.00
50038 300 0 0 6 2.00
50069 300 0 0 6 2.00
50071 900 35 3.89 162 18.00
50359 300 0 0 10 3.30
60120 1470 0 0 5 0.34
60Y15 300 0 0 7 2.33
60D15 300 0 0 1 0.33
60D25 300 0 0 18 6.00
600Q2 300 10 3.33 39 13.00
600Q6 300 0 0 110 36.70
60Q10 300 0 0 0 0
60Q12 300 0 0 25 8.33
60Q14 300 0 0 12 4.00
60Q17 300 0 0 2 0.70
2007
60Q22 570 0 0 105 18.40
50038 60 0 0 0 0
50069 160 0 0 6 3.75
50071 140 2 1.43 2 1.43
60120 80 0 0 0 0
600Q6 100 0 0 2 2.00
60Q10 60 0 0 0 0
60Q14 60 0 0 0 0
70ADD 100 2 2.00 4 4.00
70Q18 100 0 0 33 33.00
70Q20 100 0 0 0 0
70Q27 100 0 0 0 0
70Q33 100 0 0 0 0
70Q36 100 0 0 0 0
70Q67 120 0 0 0 0
70Q69 60 0 0 0 0
70Q73 100 0 0 0 0
70Q74 160 0 0 1 0.62
2008
70Q77 80 0 0 8 10.00
70Q78 80 0 0 0 0
1618 园 艺 学 报 37 卷
2.2 植物生长调节剂对小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
据国外文献报道和 2006、2007 年的试验结果，确定以 50069、50071、70Q67、70Q74 号材料用
于试验。
在添加 2,4-D 和 NAA 的 1 ~ 6 号处理中均产生小孢子愈伤组织（表 3），其中 6 号处理中 4 份材
料均产生小孢子愈伤组织，50071 号材料在 5 号处理中的出愈率达到最高，为 28.33%，并产生 3.33%
胚状体。70Q67 号材料在 5 号处理中产生了 1.25%胚状体。而添加 6-BA 和 NAA 的 7 ~ 12 号处理中
均未出现小孢子胚状体和愈伤组织。
表 3 不同植物生长调节剂浓度组合对不同基因型材料小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
Table 3 Effect of media with different concentration of hormones on formation of embryos and calli
植物生长调节剂/
(mg · L-1) Hormones
出胚率/ %
Embryos frequency


出愈率/ %
Calli frequency 处理号
Code
2,4-D 6-BA NAA

50069 50071 70Q67 70Q74 50069 50071 70Q67 70Q74
1 0.1 – 0.1 0 1.00 0 0 0 1.00 0 0
2 0.1 – 0.2 0 0 0 0 0 2.00 0 0
3 0.1 – 0.5 0 0 0 0 0 1.00 0 0
4 0.5 – 0.1 0 0 0 0 0 26.67** 0 1.00
5 0.5 – 0.2 0 3.33** 1.25 0 0 28.33** 3.75* 0
6 0.5 – 0.5 0 0 0 0 3.33* 25.00** 8.33** 4.00*
7 – 0.1 0.1 0 0 0 0 0 0 0 0
8 – 0.1 0.2 0 0 0 0 0 0 0 0
9 – 0.1 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0
10 – 0.5 0.1 0 0 0 0 0 0 0 0
11 – 0.5 0.2 0 0 0 0 0 0 0 0
12 – 0.5 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0
注：*和**分别表示相同项目下数值之间达到α = 0.05和α = 0.01差异水平。
Note：* and ** showed significantly different at α = 0.05 and α = 0.01 level，respectively.
2.3 AgNO3 对小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
从表 4 可看出，添加 AgNO3 对部分基因型材料出胚率有一定促进作用，在添加 8 mg · L-1 AgNO3
的培养基中，50071 和 70Q67 号材料出胚率分别达到 10.00%和 2.00%。但对于小孢子愈伤组织的形
成效果差异不显著。
表 4 不同 AgNO3 浓度下不同基因型材料小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
Table 4 Effect of different concentration of AgNO3 on formation of embryos and calli
出胚率/ %
Embryos frequency
出愈率/ %
Calli frequency AgNO3/
(mg · L-1)
50069 50071 70Q67 70Q74 50069 50071 70Q67 70Q74
0 0 0.83 0 0 3.00 1.67 0 0
4 0 6.00** 0 0 5.00 0 1.00 0
8 0 10.00** 2.00 0 2.00 1.00 1.00 0
注：*和**分别表示相同项目下数值之间达到α = 0.05和α = 0.01差异水平。
Note：* and ** showed significantly different at α = 0.05 and α = 0.01 level，respectively.
2.4 低温预处理对小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
4 ℃低温预处理对部分材料的胚状体及小孢子愈伤组织形成有一定作用（表 5），50069 号材料
10 期 庄飞云等：胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导 1619

经 1 d 低温预处理产生了 1%的出胚率，而在上述其它处理中未曾出现，处理 2 d 和 3 d 产生的出愈
率均达到 11.25%。70Q67 号材料经 3 d 低温预处理产生了 4.00%的出胚率，但对出愈率的影响不显
著。
表 5 不同时间 4 ℃低温预处理下不同基因型材料小孢子胚状体和愈伤组织诱导影响
Table 5 Effect of low temperature pretreatment on formation of embryos and calli
出胚率/ %
Embryos frequency
出愈率/ %
Calli frequency 处理时间/ d
Time
50069 50071 70Q67 70Q74 50069 50071 70Q67 70Q74
0 0 0 0 0 3.75 1.25 0 0
1 1.25 1.00 0 0 7.50* 5.00* 1.00 0
2 0 1.00 1.67 0 11.25** 6.00* 0 0
3 0 0 4.00** 0 11.25** 2.50 2.00 0
注：*和**分别表示相同项目下数值之间达到α = 0.05和α = 0.01差异水平。
Note：* and ** showed significantly different at α = 0.05 and α = 0.01 level，respectively.
2.5 再生植株染色体倍性鉴定
对 121 株再生植株进行细胞学鉴定，有 113 株为二倍体，占 93.39%。其中 50071 号材料产生 1
株单倍体和二倍体的嵌合体植株、2 株同源四倍体植株。600Q2 号材料产生 2 株单倍体和二倍体的
嵌合体植株、2 株同源三倍体植株。70Q67 材料产生 1 株二倍体和三倍体的嵌合体植株。Adamus 和
Michalik（2003）的试验结果胡萝卜二倍体再生植株比例也达到 86%，这说明胡萝卜花药培养过程
中具有较高的自然加倍率。
3 讨论
花药培养中的小孢子发育途径有两种：1）小孢子直接分化形成胚状体，长成小植株；2）小孢
子形成愈伤组织，再通过继代培养产生胚状体或者不定芽和不定根（Bajaj，1990）。适合培养的胡
萝卜花蕾大小小于 1 mm，人工挑取花药时会刺伤花药壁，易产生体细胞愈伤组织。本试验中体细
胞愈伤组织的比例在 2% ~ 30%之间，并且易与小孢子形成的愈伤组织混淆。因此，胡萝卜花药培养
最佳途径是小孢子直接分化产生胚状体。但本试验仅有 6 份材料直接形成胚状体，其中出胚率最高
仅有 3.89%，而且这些材料在不同年份间表现不稳定（表 2），这与国外报道结果（Andersen et al.，
1990；Adamus & Michalik，2003）相似，说明基因型对胡萝卜花药培养产生胚状体起着关键性的作
用。
2,4-D对于启动胡萝卜花药小孢子分化起着重要作用，而细胞分裂素反而对其小孢子分化起到抑
制作用。本试验中在添加6-BA和NAA的处理中均未产生胚状体和小孢子愈伤组织，这在黄瓜花药培
养中出现类似的结果（Ashok Kumar et al.，2003）。
低温预处理及高温预处理是提高许多植物孤雄生殖效率的关键因素（Touraev et al.，1997）。本
试验中选了4 ℃对胡萝卜花药进行低温预处理，4份材料中有3份材料均产生胚状体，未经低温预处
理的花药均未产生胚状体，说明低温预处理有利于逆转小孢子的发育过程，促进胚状体的发生。

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