全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：307–312
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–09–14；修回日期：2009–12–29
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail: zhu2222@126.com）
番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与 X-75 菌株鉴定
王 伟，李术娜，李红亚，郝志敏，王 全，王树香，朱宝成*
（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001）
摘 要：采用琼脂平板扩散法筛选对番茄灰霉菌具有拮抗作用的细菌，经过对 200 株分离自土壤的细菌
菌株进行初筛、复筛后，得到了 1 株具有较高拮抗活性的菌株 X-75。对该菌株进行形态观察和生理生化特征
分析，初步将其鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），将其16S rDNA序列与GenBank中已知标准菌株的16S rDNA
序列进行比对，并用 Neighbor-joining 方法构建 X-75 菌株进化树，结果表明，X-75 与标准菌株 AB245422
Bacillus velezensis 聚于同一分支，同源性最高，达 99.93%；利用番茄离体叶片对 X-75 菌株的防效进行初步
检测，结果表明 X-75 菌株对番茄灰霉病菌具有明显的拮抗作用。
关键词：番茄；灰霉菌；芽孢杆菌；拮抗作用
中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2010)02-0307-06

Screening of Antagonistic Bacteria Against Botrytis cinerea and Identification
of Strain X-75
WANG Wei, LI Shu-na, LI Hong-ya, HAO Zhi-min, WANG Quan, WANG Shu-xiang, and ZHU Bao-cheng*
(College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China)
Abstract：In order to obtain antagonistic bacteria against Botrytis cinerea, about 200 strains of bacteria
isolated from soil samples were screened with the agar plate diffusion method. After primary and secondary
screening, the strain X-75 showed the most significant antagonistic activity. After the morphological
observation and a series of physiological and biochemistry experiments, the bacterial strain X-75 was
primarily identified as Bacillus sp. The similarity of the 16S rDNA sequences between X-75 strain and
AB245422 Bacillus velezensis was 99.93%, so it was finally identified as the nearest genetic relationship with
Bacillus velezensis. And the X-75 strain showed obvious antagonistic activity against Botrytis cinerea Pers on
tomato leaves.
Key words：tomato；Botrytis cinerea Pers；Bacillus；antagonistic activity


番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）侵染引起的病害，主要危害果实和叶子，引起
果实腐烂。目前，由于缺乏抗性品种，生产上对化学防治的依赖性越来越大，田间一个生长季节用药
次数、剂量不断增加，以及长期单一使用同类杀菌剂，特别是作用位点单一的内吸性杀菌剂，使得病
菌在一定程度上对一些常用杀菌剂的敏感性降低，防效下降，同时造成果实的农药污染。近年来人们
通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢物，使生物防治正日益成为灰霉病控制中的一条
重要而有效的途径。国内外报道多种真菌、细菌，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假单孢杆菌、芽孢杆菌

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等，在室内抑菌测定中均对灰霉病菌表现出较好的抑制作用（韩斯琴 等，2004；庄敬华 等，2005）。
其中芽孢杆菌能产生多种抑菌物质，且稳定性好，常用于防治多种植物病害，例如地衣芽孢杆菌对番
茄灰霉菌的田间防效较好（唐丽娟 等，2005），童蕴慧等（2001）也曾筛选出对番茄灰霉菌拮抗性较
高的生防芽孢杆菌，生物防治在控制番茄灰霉病方面将会有更广泛的应用前景，也将是未来防治番茄
灰霉病手段的发展趋势（Kamensky et al., 2003；葛绍荣 等，2007）。
本试验中以灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）为指示菌，对分离自土壤的 200 株细菌菌株进行了
初筛和复筛，筛选出抑菌活性较强并且稳定的菌株，通过形态观察、生理生化实验及分子生物学手段
对其中拮抗活性最强的菌株 X-75 进行了鉴定，利用番茄离体叶片对其防效进行了初步检测，为今后
有效利用该菌防治番茄灰霉病奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌株及其培养基
供试病原菌：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）从田间罹病番茄植株上分离获得，由河北农业大
学生命科学学院制药工程系实验室保藏。供试细菌菌株：分离自土壤，由河北农业大学生命科学学院
制药工程系实验室保藏。PDA 培养基、NA 培养基、NB 培养基的配制详见《微生物学实验技术》（程
丽娟和薛泉宏，2000）。细菌培养特征以及生理生化特性测定所用培养基参见《常见细菌系统鉴定手册》
（东秀珠和蔡妙英，2001）。
1.2 菌株的筛选
将供试细菌分别接种于 NA 培养基斜面上，30 ℃黑暗培养 24 ~ 36 h，–4 ℃保存备用。将番茄灰
霉病菌经复壮及重新分离，接种于 PDA 培养基斜面上，25 ℃黑暗培养 10 d。加入 5 mL 无菌水，轻
轻刮取孢子，将孢悬液（106 个 · mL-1）与融化并冷却至 45 ℃左右的 PDA 培养基混匀，制平板。挑
取 30 ℃活化培养 24 h 的供试细菌点接于病原菌平板上，25 ℃培养 48 h，观测抑菌圈。挑选产生较明
显抑菌圈的菌株进入复筛。
将初筛得到的菌株分别接种于装有 50 mL NB 液体培养基的 250 mL 三角瓶中，30 ℃、200 r · min-1
振荡培养 48 h。收集培养液离心（10 000 r · min-1，4 ℃），将上清用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。在病
原菌平板上均匀打孔，分别注入不同菌株的无菌培养滤液 70 μL，25 ℃黑暗培养 48 h，测量抑菌圈直
径并记录试验结果。
1.3 鉴定
1.3.1 形态鉴定与生理生化鉴定
将待鉴定细菌接种于 NA 斜面上，37 ℃培养 24 h，挑取少量菌体用无菌水稀释。分别取 10-4 和
10-5 稀释液 0.1 mL 涂布 NA 培养基平板，30 ℃培养 24 h，观察菌落形态。
挑取 NA 斜面上 37 ℃培养 24 h 的待鉴定菌进行革兰氏染色，显微观察其菌体及芽孢形态。
将待鉴定菌株分别进行生长温度等生理生化试验。
1.3.2 DNA提取和 16S rDNA基因扩增及序列分析
参考 Kim 等（1995）和 Rainey 等（1996）的方法提取细菌总 DNA，室温干燥后溶于 TE 缓冲液
中，1%琼脂糖电泳检测 DNA 质量。
PCR 所用正向引物为 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为 1495R：5′-CTAC
GGCTACCTTGTTACGA-3′（Lane, 1991）。
PCR 反应体系：DNA（70 ng · μL-1）2 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol · L-1）2.5 μL；27F（20 μmol · L-1）
2 期 王 伟等：番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与 X-75 菌株鉴定 309

1.5 μL；1495F（20 μmol · L-1）1.5 μL；10×ExTaq Buffer（Mg2+ plus）5 μL；ExTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；
ddH2O 补足至 50 L。
PCR 反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 3 min，30 个循环；72 ℃ 5 min。
PCR 产物经试剂盒纯化后测序。
将所得 16S rDNA 序列用 BLAST 软件与 GenBank 数据库进行相似性比对，并与 GenBank 中的相
近序列在 Clustal X（1.8）程序包中进行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，最后形成一个
多重序列匹配排列阵，其中形成的缺口用“–”填补，用 Neighbor-Joining 法构建系统发育树（Saitou
＆Nei, 1987）。
1.4 拮抗细菌 X-75 菌株对番茄灰霉病的防病试验
选择坐果期番茄植株的完整平展叶片，在叶片表面刷涂灰霉菌孢子悬液（1 × 107 ~ 10 × 107
cfu · mL-1），待叶片渐干时用拮抗细菌 X-75 菌株的上清液喷雾，对照以无菌水喷雾。将所有叶片置于
铺有滤纸的保湿培养皿中，叶柄处包脱脂棉吸水保湿。对照与处理组各处理 10 个叶片。22 ℃培养 5 ~
10 d，观察叶片发病情况。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌株的初筛和复筛
对 200 株分离自土壤的细菌菌株进行初筛，其中有 20 株细菌表现出对番茄灰霉病菌有较强的拮抗
活性，抑菌圈直径均大于 14 mm。进一步对这 20 株细菌进行复筛，发现拮抗细菌 X-75 菌株抑菌圈直
径最大，为 17 mm（图 1）。
2.2 拮抗细菌 X-75 菌株的鉴定
2.2.1 形态及生理生化特征
菌株在 NA 平板上生长，单菌落呈近圆形，边缘整齐，半透明，表面光滑，中间有突起，近白色。
革兰氏染色结果表明，该菌株为革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形中生，菌体不具抗酸性，可产生异染
粒，菌体生长物向四周呈云雾状扩散。
生理生化试验结果如表 1 所示。

图 1 复筛时分离菌株 X-75 对番茄灰霉菌的拮抗作用
Fig. 1 Antagonistic effect of isolated bacteria strains in secondary screening
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表 1 拮抗细菌 X-75 菌株的生理生化特征
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic strain X-75
项目 Items 结果 Results 项目 Items 结 果 Results
65 ℃ + 亚硝酸还原试验 Denitrification test +
45 ℃ + 反硝化试验 Denitrification test –
37 ℃ + 产氨试验 Production of ammonia test +
生长温度试验
Growth temperature test
4 ℃ – V.P.试验 V. P. test –
(NH4)2HPO4 + 柠檬酸盐试验 Citrate solution test + 氮源利用试验
Nitrogen utilization test KNO3 + 3–酮基乳糖试验 3-alkone ketone lactose test –
甘露糖 Mannose + 脲酶试验 Urease test +
麦芽糖 Maltose + 色氨酸脱氨酶试验 Tryptophan dehydrogenase test +
蔗糖 Sucrose – 苯丙氨酸脱氨酶试验 Phenylalanine dehydrogenase test +
碳源利用试验
Sugar utilization test
可溶淀粉 Soluble starch + 脂酶(Tween 80) 试验 Lipase test +
IPA – H2S 产气试验 H2S production + IPA 测定试验
IPA test 吲哚 Indole + 牛奶分解试验 Milk decomposition test +
荧光色素试验 Fluorochrome test – 甲基红试验 Methyl red test –
接触酶试验 Catalase test + 糖醇类发酵试验 Sugar alcohol fermentation +
硝酸盐还原试验 Nitrate reduction test + 酒石酸盐的利用试验 Tartrate utilization tests +
淀粉水解试验 Starch hydrolysis test + 脓青素的产生试验 Pus astaxanthin production test –
葡萄糖氧化发酵试验 Glucose zymolysis test + 纤维素分解试验 Cellulose hydrolysis test –
产糊精结晶试验 Crystalline dextrin production test – 丙二酸盐试验 Malonate utilize test –
注：“+”表示阳性，“–”表示阴性。
Note：“+” means masc，“–”means negative.

综合 X-75 菌株的形态特征和生理生化特性，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》（Buchanan & Gibbons,
1984）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）进行检索，初步鉴定为芽孢杆菌属。
2.2.2 拮抗细菌 16S rDNA的序列分析
X-75 菌株的 16S rDNA 序列长 1 460 bp，与数据库中已登录的 16S rDNA 序列用 BLAST 程序进行
序列相似性比对，结果表明供试菌株 X-75 的 16S rDNA 序列与芽孢杆菌属的标准菌株同源相似度大部
分在 99%以上，尤其与标准菌株 AB245422 Bacillus velezensis 的同源性最高，达 99.93%（表 2）。
表 2 拮抗细菌 Bacillus X-75 菌株与标准菌株的相似性比较
Taleb 2 Comparison of similarity between antagonistic strain Bacillus X-75 and norm stains
种名
Species name
序列号
Sequence number
菌种号
Strain number
相似性/ %
Similarity
Bacillus velezensis* AB245422 LMG 22478 99.93
解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens AB255669 NBRC 15535 99.79
花域芽孢杆菌 Bacillus vallismortis AB021198 DSM 11031 99.86
萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus AB363731 NBRC 15539 99.38
Bacillus axarquiensis* DQ993671 LMG 22476 99.10
Bacillus malacitensis* DQ993673 LMG 22477 99.10
漠海威芽孢杆菌 Bacillus mojavensis AB363735 NBRC 15718. 99.03
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis AB271744 NBRC 13719 99.38
木聚糖双芽孢杆菌 Amphibacillus xylanus AJ496807 DSM 6626 88.40
注：“﹡”所标的 3 株菌株为 2005 年新发现的种，其中文名字尚未在文献中出现过。
Note：Three bacterial strains marked with “﹡”were new species which found in 2005 and the Chinese names didn’t appear in literatures.

2 期 王 伟等：番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与 X-75 菌株鉴定 311

将 GenBank 数据库中同源性最高的 10 个菌株与 X-75 菌株的 16S rDNA 构建系统进化树，该供试
菌株与标准菌株 AB245422 Bacillus velezensis 在同一分支上，与比对结果相吻合。
将此结果与菌落形态、菌体特征以及生理生化鉴定结果综合分析，结果表明，X-75 菌株与 Bacillus
velezensis 最相近。
2.3 拮抗细菌 X-75 菌株对番茄灰霉病的防治效果
离体叶片的防效试验结果表明，对照组（图 2，A）的离体叶片经保湿培养后褪绿变黄，并逐渐形
成褐色病斑，随培养时间的延长，病斑不断扩展。而喷洒了拮抗细菌 X-75 菌株上清液的处理组离体
叶片没有明显变化（图 2，B）。说明拮抗细菌 X-75 菌株的发酵液对番茄灰霉病原菌具有明显的拮抗作
用。
3 讨论
番茄灰霉病是一种重要的番茄病害，由于栽培面积的扩大而蔓延加剧，危害越来越大，因此引起
研究者越来越多的关注。芽孢杆菌能产生耐热抗逆的芽孢，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在
环境中存活、定殖与繁殖，具有突出的优势。其中主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢
杆菌（Bacillus polymyxa）、地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenformis）、乳芽孢杆菌（Lactobacillus sp.）等(Akutsu
et al.，1993；Elad et al.，1994；Swadling ＆ Jeffries, 1998；齐爱勇 等，2006)。本试验筛选到了一株
对番茄灰霉病原菌具有较高拮抗活性的菌株，经生理生化鉴定以及 16S rDNA序列分析，最终确定X-75
为 Bacillus velezensis。该菌株用于番茄灰霉病的生物防治尚未见报道，本试验结果为该病的生物防治
提供了新的微生物资源。本试验中对其应用性进行了初步探索，发现其对于番茄灰霉病具有一定的拮
抗作用，但是其防效的稳定性、进一步田间使用及其预防机制还需要进一步深入研究。


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图 2 X-75 菌株发酵液的离体叶片防效试验
A. 对照组；B. 处理组。
Fig. 2 The antagonistic effect of X-75 strain on tomato leaves in vitro
A. Control group; B. Treatment group.
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