全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (5) : 737 - 742
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 22; 修回日期 : 2009 - 04 - 13
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30871707) ; 农业部 ‘948’项目 (20082Z42)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: huangsanwen@mac1com)
与黄瓜 M 基因连锁的三个共显性标记
时秋香 1 , 刘世强 2 , 李　征 3 , 曹辰兴 1 , 李　颖 2 , 黄三文 23
(1山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 3 上海交
通大学农业与生物学院 , 上海 200240)
摘 　要 : 利用黄瓜近等基因系纯雌株 W I1983G (基因型为 FFMM ) 与两性花株 W I1983H (基因型为
FFMM ) 为亲本 , 以 W I1983H为回交亲本构建了 BC1代分离群体 , 采用 SSR及 SCAR分子标记技术 , 获得
了 3个与 M 基因紧密连锁的标记 SSR23487、 SCAR123和 SSR19914, 它们与 M 基因的遗传距离分别为
0128、0194和 3120 cM , 两侧标记 SSR23487和 SCAR123将 M 基因定位在 1122 cM的遗传区间内。这 3个
分子标记的获得不仅可以用于分子标记辅助选择育种 , 而且为最终 M 基因的克隆打下了基础。
关键词 : 黄瓜 ; 分子标记 ; 性别表达 ; SSR
中图分类号 : S 64212; Q 786　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0520737206
Three Co2dom inan t M arkers L inked to M Gene in Cucum is sa tivus
SH IQ iu2xiang1 , L IU Shi2qiang2 , L I Zheng3 , CAO Chen2xing1 , L I Ying2 , and HUANG San2wen23
(1 College of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricu ltura l U niversity, Taipian, Shangdong 271018, China;
2 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 3 School of A griculture
and B iology, Shanghai J iao Tong U niversity, Shanghai 200240, Ch ina)
Abstract: A segregating cucumber BC1 population was developed using the nearly isogenic lines
W I1983G ( gynoecious, FFMM ) as donor and W I1983H ( hermaphroditic, FFMM ) as recurrent parent.
W ith screening of polymorphism of one SCAR and, 2 112 SSR markers, three polymorphic co2dom inant mark2
ers SSR23487, SCAR123 and SSR19914 were found to be tightly linking to the M /m gene, with a distance of
0128, 0194 and 3120 cM , respectively. The interval between SSR23487 and SCAR123, which locate on each
side of the M /m gene, was 1122 cM. These markers not only could be useful in markers2assisted selection for
gynoecious p lant, but also p rovide a solid basis for isolation of the sex2determ ining M /m gene in cucumber.
Key words: Cucum is sa tivus L. ; molecular marker; sex exp ression; SSR
性别分化是具有重要经济意义的植物发育过程 , 因为作物的性别表达类型决定了其育种和栽培的
方式。黄瓜具有非常丰富的性别表现类型 , 是研究性别表达的模式植物 ( Galun, 1961; Roy & Saran,
1990; Bai et al. , 2004; Tanurdzic & Banks, 2004)。目前已经明确控制黄瓜性别表达的基因位点有
A、F、Gy、 In2F、M、M 22和 Tr ( Galun, 1961; Kubicki, 1969a; 陈惠明和刘晓虹 , 1999; 陈惠明
等 , 2005)。
激素在黄瓜的性别表达中起重要作用。经过严格的生理学试验 , Yin和 Quinn (1995) 提出了黄瓜
性别表达的乙烯控制模型 , 认为乙烯是黄瓜的 “性激素 ”, 它既促进雌性的表达 , 也同时抑制雄性的
表达 , 推断 F基因的产物控制乙烯在黄瓜植株分布的部位和浓度 , 促进雌性的表达 , 而 M 基因的产
物则控制乙烯信号的识别 , 在乙烯浓度高于阈值时抑制雄蕊的发育。近年来 , F基因已被克隆 , 为乙
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烯合成酶基因家族成员之一 ( Knopf & Trebitsh, 2006) , 符合其控制乙烯浓度功能的预测。
Yamasaki等 (2001) 的研究表明 M 位点介导了乙烯诱导的雄蕊滞育。M 基因分子标记的获得始
于 2003年波兰科学家 W itkowicz的研究 , 但没有确定其连锁距离 (W itkowicz et al. , 2003)。邓思立等
(2006) 运用 SRAP ( sequence2related amp lified polymorphism ) 技术获得了一个与 M 基因连锁的标记
ME23SA4, 但距离较远 , 为 1718 cM (邓思立 等 , 2006)。2008年 , L i等及 L iu等几乎同时获得了与
M 基因共分离的分子标记 S_M E8SA7和 CsE IL1 (L i et al. , 2008; L iu et al. , 2008) , 但由于受群体种
类和大小、标记类型等因素的限制 , 分别将 M 基因定位于 611 cM和 215 cM遗传区间内 , 远远未达
到图位克隆 M 基因的目的。
作者采用从美国威廉康辛大学 Jack Staub实验室引进的近等基因系为研究材料 , 采用 SSR及
SCAR标记技术 , 获得了 3个与 M 基因紧密连锁的分子标记 , 最终将 M 基因定位在 1122 cM的遗传区
间内。
1　材料与方法
111　材料
从美国威斯康辛大学 Jack Staub实验室引进了近等基因系 W I1983G和 W I1983H。W I1983G为纯
雌株 , 为 W I5821和 W I5822 ( Peterson et al. , 1986 ) 杂交后代系统选育的高代自交系 , 基因型为
FFMM。W I1983H为两性花株 , 由雄花两性花株 W I1983A ( ffmm ) 作为供体与 W I1983G经 5代回交
及 3代自交获得的自交系 , 基因型为 FFmm。
112　方法
11211　BC1分离群体的构建 　
以 W I1983G为母本 , W I1983H为父本配制杂交组合得到 F1 , F1与 W I1983H回交得到 BC1群体。
BC1群体的 751个单株于 2008年 3月种植于中国农业科学院廊坊基地温室内 , 统一肥水管理。
11212　花性型的调查与统计 　
从植株开花后调查花的性型 , 植株主蔓和侧枝上全开两性花的植株记为两性花株 , 主蔓和侧枝上
全开雌花的植株记为纯雌株。计算两性株与纯雌株的数量 , 通过卡方测验计算其显著性。
11213　总 DNA提取 　
采黄瓜各单株嫩叶 , 用 CTAB 法 ( Jones & W alker, 1963) , 结合高通量的 Retsch细胞破碎仪
(Retsch Inc. , Haan, Germany) 和 96孔 COSTAR深孔板 (Corning Inc. , New York) 进行 DNA快速提
取。提取的 DNA加水溶解 , 于 - 20 ℃保存。
11214　标记来源和反应条件 　
PCR标记引物序列中 SSR引物来自张忠华博士根据黄瓜基因组设计的 2 112对引物 , 由上海生工
生物工程服务有限责任公司合成 ; SCAR123引物序列由上海交通大学农业与生物学院蔡润教授研究
室提供。
15μL PCR反应体系为 : 10 ×buffer 115μL, dNTPs (10 mol·L - 1 ) 012μL, 每条引物 (5 pmol·
μL - 1 ) 015μL, Taq DNA聚合酶 (215 U·μL - 1 ) 012μL, DNA (3 ng·μL - 1 ) 5μL, H2 O 711μL。扩
增程序为 94 ℃预变性 3 m in, 94 ℃变性 20 s, 55 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸 20 s, 共循环 35次 , 最后
72 ℃延伸 5 m in。扩增反应在 9700PCR (App lied B iosystem公司 ) 仪上进行。
PCR扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶在北京市六一仪器厂的垂直电泳槽上进行 , 160 V恒电压下
电泳 2～215 h, 电泳后参照乐晓萍等 (2001) 的方法银染。水洗后用保鲜膜包胶 , 晾干后照相并统计
数据。
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　5期 时秋香等 : 与黄瓜 M 基因连锁的三个共显性标记 　
11215　数据统计和标记命名 　
根据 SSR和 SCAR标记在双亲中的表现进行归类 , 将 W I1983G呈现的带型记为 a, W I1983H呈
现的带型记为 b, F1呈现的带型记为 h, 群体中根据其带型分别记为 b或 h, 缺失的数据记为 u。采用
引物组合的方法对标记进行命名 , 如 SSR23487。
11216　连锁分析 　
应用 JoinMap310 ( Stam, 1993) 对标记位点进行连锁分析 , 采用 Kosambi (1944) 函数将重组率转
化成遗传图距。
2　结果与分析
211　花性型的遗传分析
对亲本纯雌株 W I1983G与两性花株 W I1983H、F1 (各 4株 ) 和 BC1群体 (751株 ) 中各单株花
性型的调查结果显示 , 母本 W I1983G的 4个单株有花节位均为雌花 , 全为纯雌株 ; 父本 W I1983H的
4个单株有花节位均为两性花 , 全为两性花株。F1代的植株全是纯雌株。BC1群体中有两种性型 , 纯
雌株和两性花株 , 751个 BC1群体植株中 , 有 373个纯雌株和 378个两性花株 , 经χ2验证 (χ2 = 0103,
P < 0105) , 符合 1 ∶1的分离比例 , 说明黄瓜单性花性型对两性花性型为完全显性 , 由一对核基因控
制 , 与以往报道 ( Shifriss, 1961; Kubicki, 1969b; Kenigsbuch, 1990) 一致 , 可利用该 BC1群体对控
制目标性状的 M 基因进行遗传定位。
212　亲本间多态性标记的筛选
通过 2 112对 SSR引物组合的筛选 , 两亲本间具多态性的引物组合为 2对 (23487和 19914) , 其
多态性率仅约为 011%。其主要原因可能有两方面 : 第一 , 2 112对 SSR引物采用全基因组设计 , 除
M 基因所在的染色体外 , 其余染色体上的 SSR引物组合肯定没有多态性 ; 第二 , 2 112对 SSR引物当
中 , M 基因附近两侧标记较少 , 较远部位的 SSR标记被近等基因系近乎相同基因组背景所消除掉。
另外一个 SCAR引物组合 123采用类似 SSR的方法进行检测 , 发现在两亲本间同样具有多态性 ,
并且两者条带的大小差别为 4 bp, 其分离效果在 8%的聚丙烯酰胺凝胶中不如 SSR引物组合 23487和
19914。
3个标记 SSR23487、SCAR123和 SSR19914的引物序列见表 1。
表 1　多态性引物序列
Table 1　Sequences of the polym orph ism pr im ers
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′- 3′)
引物长度 / bp
Primer length
扩增片段长度 / bp
Length of amp lified fragment
SSR234872L TGTTTCAAGGTGCTGACCTG 20 139 /147 (M /m )
SSR234872R CCACAACAACAAAAGAATGTGAA 23
SCAR1232L GAAACCACAAGATTCAACCACAC 23 227 /223 (M /m )
SCAR1232R GCATGATGTTCCATCTCAAAGC 22
SSR199142L ATGGTCCACCAAACAAATGG 20 172 /160 (M /m )
SSR199142R GCTGTACTTGGAATCACTTCCC 22
　　注 : L. 上游引物 ; R. 下游引物。
Note: L. Left p rimer; R. R ight p rimer.
213　连锁遗传图
用亲本纯雌株 W I1983G与两性花株 W I1983H间有多态性的引物组合 23487、123和 19914分析
751株 BC1分离单株 , 用 8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析 , 结果都具多态性 , 如 SSR23487
(图 1)。
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图 1　亲本、F1、BC1单株的 SSR23487分析
W I1983G为母本 , W I1983H为父本 , F1为 W I1983G ×W I1983H杂交后代 ;
G: BC1群体中纯雌株 ; H: BC1群体中两性花株 ; 3 表示重组单株。
F ig. 1　SSR23487 ana lysis of the paren ts, F1 and BC1 ind iv idua ls
W I1983G and W I1983H are parental lines; F1was derived from a cross between W I1983G and W I1983H lines;
G: BC1 p rogenies with bearing only p istillate flowers; H: BC1 p rogenies with bearing only bisexual flowers;
A sterisks ( 3 ) shows recombinant.
引物组合 23487在 BC1分离群体当中 , 373个纯雌株和 378个两性株中各有 1株为交换类型 (将
该标记命名为 SSR23487) , 而引物组合 123在 BC1群体中 , 纯雌株和两性花株中的重组单株分别为 4
株和 3株 (将该标记命名为 SCAR123) , 并且后者的重组单株并不包含前者的两个重组单株 , 由此可
得这两个标记位于 M 基因的两侧。
采用类似的方法还获得了另外一个标记 SSR19914, 结合 JoinMap310软件作图分析 , 从而获得了
M 基因的遗传连锁图 (图 2)。
由图 2可以看出 , SCAR123和 SSR19914位于 M 基因的同侧 , SSR23487和 SCAR123位于 M 基因的
两侧 , 与 M 基因的遗传距离分别为 0128 cM和 0194 cM, 最终将 M 基因定位在 1122 cM的遗传区间内。
图 2　M 基因的遗传连锁图
F ig. 2　Genetic map of the M locus
3　讨论
本研究在材料、方法和结论上具有独特的优势。
第一 , 近等基因系的基因组背景几乎完全相同 , 其差异仅局限于控制目标性状基因两侧的极小区
域 , 凡是在这对近等基因系间有多态性的引物组合 , 极有可能与该基因紧密连锁。通过亲本间的引物
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　5期 时秋香等 : 与黄瓜 M 基因连锁的三个共显性标记 　
筛选 , 消除假阳性 , 大大减轻假阳性带来的工作量。
第二 , 与其它标记相比 , SSR标记不仅具有 DNA需量少 , 质量要求不高和基因组中分布广泛等
优点 , 而且该标记呈共显性遗传 , 可以区分纯合与杂合植株 , 可直接用于分子标记辅助育种。
第三 , 根据标记遗传距离小于 5 cM 即可用于 MAS的原则 , 本研究中的 3个标记 SSR23487、
SCAR123和 SSR19914都可以直接应用到分子标记辅助育种领域。与此同时 , 两标记 SSR23487和
SCAR123将 M 基因定位于 1122 cM的遗传区间内 , 与前人的最小遗传距离 215 cM相比 , 有了很大进
步。最近的标记 SSR23487与 M 基因间的遗传距离仅为 0128 cM , 根据黄瓜基因组 367 Mb约 1 000 cM
计算 ( Koo et al. , 2005) , 平均估计 011 cM的物理距离约为 40 kb, 而 BAC文库克隆平均大小约为
100 kb。由此可见 , 以 SSR23487为起点进行染色体步移构建物理图谱乃至于克隆 M 基因极其可行。
尽管本试验中经过 2 112对 SSR引物的筛选获得了 3个与 M 基因紧密连锁的共显性标记 , 并构建
了该基因的局部遗传连锁图谱 , 但受近等基因系及 SSR位点全基因组扫描进行引物设计等因素的限
制 , 所得的分子标记偏少 , 下一步我们将限定于 M 基因两侧的基因组信息设计 SSR引物并结合高通
量 AFLP技术进行分析 , 以寻求连锁更紧密的标记 , 为 M 基因的精细定位乃至克隆奠定基础。
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纪念全国西瓜甜瓜科研生产协作 50周年暨第 12次
全国西瓜甜瓜科研与生产协作会议纪要
会议于 2009年 4月 24～27日在河南省开封市召开。会议由中国园艺学会西瓜甜瓜专业委员会、中国农业科学院
郑州果树研究所主办 , 河南省开封市农林科学研究院、河南省农业科学院园艺研究所承办 , 来自全国 27个省区市 108
个单位的 190多位代表出席了会议。中国园艺学会名誉理事长、中国农业科学院原常务副院长朱德蔚先生 ; 农业部全
国农技中心李莉处长 ; 河南省农业厅薛豫宛副厅长、杜冠华处长 ; 河南省开封市政府王成法秘书长 ; 中国园艺学会西
瓜甜瓜专业委员会主任、中国农业科学院郑州果树研究所刘君璞所长 ; 中国园艺学会副理事长、湖南省瓜类研究所孙
小武所长 ; 中国园艺学会常务理事、河南省农业科学院园艺研究所徐小利所长 ; 河南省开封市农业科学院姚清志院长
等领导同志出席会议开幕式。
中国园艺学会西瓜甜瓜协会王坚副理事长就全国科研与生产协作 50年历程做了回顾总结。全国西瓜甜瓜科研与
生产协作自 1959年秋在甘肃兰州召开首次全国会议 , 奠定协作基础延续到现在 , 形成了包括科研、教学、农技推广、
生产企业等单位数百位专家参与跨专业跨区域的大协作模式 , 已成为我国农业科技协作促进产业发展的成功典范。刘
君璞所长作了题为 “协作 , 创新 , 共求发展 2003～2008年总结 ”的报告 , 充分肯定了全国协作活动适应市场与生产
发展形势 , 以民间科技协作交流为主 , 开展了大量卓有成效的科研与生产协作 , 对促进西瓜甜瓜产业发展起到了重要
作用 , 并总结了存在问题和提出今后工作设想。
会议经过评审对 2003～2008年期间在全国西瓜甜瓜科研、生产、经营工作中做出显著成绩的 28个省、区、市的
46个先进集体和 93位先进个人颁发荣誉证书 , 同时表彰了 50多位老专家。会议主办单位编印了 《全国科研生产学术
交流论文摘要集 》, 共收录摘要 210多篇 , 同时收集约 50幅反映我国西瓜甜瓜科研生产历程的部分照片。
与会代表分组进行了交流。中国园艺学会副秘书长、西瓜甜瓜专业委员会秘书长、全国西瓜甜瓜科研与生产协作
办公室主任马跃进行了会议总结。总结着重提出了突出全国科研生产协作的公益性、学术性、民间性特点 , 进一步加
强交流与协作 , 创新共赢 , 为推动行业科技进步发展而不懈努力。
会议组织了开封、中牟的露地及设施西瓜栽培现场考察。此次会议的规模和影响都超过了以往的全国协作会议 ,
对推动今后全国西瓜甜瓜的科研与生产协作及产业可持续发展具有重要的意义。
全国西瓜甜瓜科研与生产协作办公室
2009年 4月 30日
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