全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2010, 37 (1) : 121 - 128
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 05; 修回日期 : 2009 - 11 - 16
基金项目 : 北京市人才强教—拔尖创新人才计划项目 ( PXM200720142072044560) ; 北京市农业科技项目 ( 20070101) ; 北京市科
技新星人才培养项目 (2006B25)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yaoyc_20@1261com)
苹果属观赏海棠实生单株亲本的 AFL P鉴定
赵天田 , 沈红香 , 姚允聪 3 , 曹庆芹 , 宋婷婷
(北京农学院植物科学技术学院 , 北京 102206)
摘 　要 : 应用 AFLP技术 , 对以苹果属观赏海棠品种王族 (M alus‘Royalty’) 为母本 , 以 5个材料为
父本的 38个实生单株进行多态性分析。结果表明 : 筛选出的 9对分辨率高的引物共扩增出 349条带 , 其中
多态性带 303条 , 多态位点百分率达 8618%。根据聚类分析和电泳图谱扩增得到亲本材料的特征带 , 鉴定
出 19株实生单株的父本可能为 ‘宝石 ’ (M alus‘Jewelberry’) ; 7株实生单株的父本可能为海棠花 (M alus
spectabilis Borkh. ) ; 3株实生单株的父本可能为草莓果冻 (M alus‘Strawberry Parfait’) ; 不能确定其父本的
实生单株有 9株。
关键词 : 苹果属 ; 观赏海棠 ; 实生单株 ; AFLP; 亲本鉴定
中图分类号 : S 685199　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2010) 0120121208
Iden tif ica tion of Paren tage of O rnam en ta l Crabapple Seedlings Using AFL P
M arkers
ZHAO Tian2tian, SHEN Hong2xiang, YAO Yun2cong3 , CAO Q ing2qin, and SONG Ting2ting
( P lant Science and Technology College, B eijing U niversity of A griculture, B eijing 102206, China)
Abstract: The polymorphism was analyzed by AFLP in 38 O rnamental Crabapp le seedlings from female
parent, M alus‘Royalty’, and 5 possible male parents. Results showed that the total 349 informative AFLP
fragments were generated using the selected 9 EcoR Ⅰ - M seⅠ p rimer combinations with high resolution
capacity. Among them there were 303 polymorphic fragments with a polymorphism percentage of 8618%.
According to the characteristic bands of electrophoretogram and Cluster Analysis, the male parents of 19, 7
and 3 seedlings were identified to be M a lus‘Jewelberry’, M a lus spectabilis Borkh. and M alus‘Strawberry
Parfait’respectively. The remnant 9 seedlings could not be confirmed or identified.
Key words: M alus; O rnamental Crabapp le; seedling; AFLP; identification of parentage
我国拥有 24种苹果属植物 (韩振海 等 , 1995) , 蕴藏着大量的可用于观赏的种类和类型 , 如海
棠花、垂丝海棠、湖北海棠等。观赏海棠 (O rnamental Crabapp le) 是欧洲育种家以原产亚洲的山定子
(M a lus bacca ta Borkh. )、苹果 (M alus pum ila M iller. )、三叶海棠 (M alus siebold ii Rehd. )、楸子
(M a lus prun ifolia Borkh. )、新疆红肉苹果 (M alus pum ila N iedzwetzkyana. ) 和原产北美的奥涅海棠
(M a lus fusca Schneid. )、草原海棠 (M alus ioensis B rit. )、野香海棠 (M alus coronaria M ill. ) 为亲本 ,
通过大量的偶然实生选育出的木本观赏植物 (张宁 等 , 2007; 郑杨 等 , 2008) , 目前存在着亲缘关
系难以确认的问题。
石胜友等 (2008) 用 AFLP分子标记技术对苹果属小金海棠起源进行研究 , 发现小金海棠与变叶
海棠、陇东海棠有较近的亲缘关系 , 并推测小金海棠可能是变叶海棠的某一类型和陇东海棠的自然杂
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交种。祝军等 (2000a, 2000b) 用 P44 /M64引物构建了 5个苹果矮化砧木 (M7、M9、M26、M27、
MM106) 的基因型指纹 , 发现各基因型扩增带型互不相同 , 可一一分开 , 且各基因型分别拥有自己
的特征带。另外应用引物 P32 /M46构建的苹果品种的 AFLP指纹图谱中 , 供试样品国光、金矮生、摩
里士、王林和旭有特异带 , 根据各自的特异带或差异带可以区分供试的 25个苹果品种。鲍露等
(2005) 利用 AFLP技术成功的区分了葡萄品种超藤和藤稔两个亲缘关系很近的品种。杨朝东等
(2004) 用 AFLP对梅花杂交后代进行了快速鉴定。
作者从以苹果属观赏海棠品种王族为母本与同园紧邻的 5份观赏海棠种质自然杂交获得的实生后
代群体中 , 选择一部分优良单株 , 利用 AFLP标记技术鉴定实生单株可能的父本来源 , 为苹果属观赏
海棠新品种的鉴定与筛选和进一步的遗传改良提供理论依据和技术方法。
1　材料与方法
试验选择 44份苹果属观赏海棠种质资源 (6份亲本种质和 38份实生单株 ) 为试材 , 其中的 38
份实生单株均是以苹果属观赏海棠品种 ‘王族 ’为母本和以 ‘宝石 ’、‘火焰 ’、‘凯尔斯 ’、‘草莓果
冻 ’ (产地美国 ) 和海棠花 (产地华北 ) 等 5份具有优良观赏性状的种质为父本 , 以空间隔离法 (景
士西 , 2000) 获得的自然杂交实生后代。
以上材料均来自北京农学院观赏海棠基地。
采集观赏海棠幼嫩叶片 , 立即放入液氮中 ( - 80 ℃) 保存。采用改良 CTAB (Murray & Thempo2
son, 1999) 法提取总基因组 DNA, 用 1%的琼脂糖胶电泳检测 DNA质量 , 检测后样品置于 4 ℃冰
箱 , 备用。
AFLP分析参考 Vos等 (1995) 的方法稍作修改 , 采用 EcoRⅠ和 M seⅠ两种限制性内切酶 , 37 ℃
酶切 3 h, 65 ℃酶切 3 h, 16 ℃连接 3 h; AFLP预扩增采用 E00 /M00引物组合 , 预扩增产物稀释 20倍
为选择扩增 DNA模板 ; 选择性扩增采用 ( E + 3) / (M + 3) 引物组合 , 其中 E和 M分别表示 EcoRⅠ
和 M seⅠ引物的共同序列 , 银染技术参考 Promega公司方法。
将图谱上清晰的条带记为 “1”, 同一位置没有条带记为 “0”, 生成 “1”和 “0”组成的原始矩
阵。多态性比率 ( % ) = (多态性条带数 /总条带数 ) ×100。采用生物学统计软件 NTSYS2pc 2110e进行
数据处理。
数据录入 NTedit 111b后获得每对引物 AFLP标记数据 , 以遗传相似系数为基础 , 采用 UPGMA
(Unweighted pair2group method with arithmetic mean) 方法进行聚类分析 , 得到亲缘关系树状图。
利用 AFLP特征带进行实生单株亲本鉴定 , 鉴定方法参考鹿金颖等 (2005) 对枣实生后代的鉴定
方法。
2　结果与分析
211　AFL P扩增的多态性分析
用筛选出的 9对引物组合对 6份观赏海棠亲本和 38份观赏海棠实生单株的基因组 DNA进行扩
增 , 共扩增出 349条带 , 平均每个引物组合扩增出 3817条 , 其中多态性带 303条 , 占总带数的
8618% (表 1)。
不同引物组合扩增出的谱带差异反映出不同材料间的遗传差异。
图 1为引物 E2ACA /M 2CTG对 44份材料的扩增图谱。
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　1期 赵天田等 : 苹果属观赏海棠实生单株亲本的 AFLP鉴定 　
表 1　9对 AFL P引物选择性扩增结果
Table 1　The AFL P am plif ied results ba sed on 9 pr im ers selected
引物组合
Primer combination
总带数
Total number of AFLP bands
多态性带数
Polymorphic band
多态位点百分率 /%
Percent of polymorphic loci
E2AAG/M2CTA 32 25 7811
E2AAG/M2CAG 40 29 7215
E2AAC /M2CTA 39 33 8416
E2ACA /M2CTG 45 43 9516
E2ACG/M2CAA 40 37 9215
E2ACC /M2CAC 46 40 8710
E2ACA /M2CAG 23 22 9517
E2ACA /M2CTA 43 40 9310
E2AAC /M2CAG 41 34 8219
总计 Total 349 303 8618
图 1　供试材料的 AFL P指纹图谱 ( E2ACA /M 2CTG)
M: 分子量标准。1～38: 实生单株 ; 39: 王族 ; 40: 宝石 ; 41: 火焰 ; 42: 凯尔斯 ; 43: 草莓果冻 ; 44: 海棠花。
F ig. 1　AFL P f ingerpr in ts genera ted using pr im er com b ina tion E2ACA /M 2CTG for 44 germ pla sm resources
M: Marker. 1 - 38: Seedlings; 39: M alus‘Royalty’; 40: M alus‘Jewelberry’; 41: M alus‘Flame’;
42: M alus‘Kelsey’; 43: M alus‘Strawberry Parfait’; 44: M alus spectabilis Borkh.
212　实生单株及亲本的聚类分析
以相似系数为基础 , 利用 UPGMA方法进行聚类分析 , 构建了 38份实生单株和 6个亲本之间的
亲缘关系树状图 (图 2)。44份供试材料两两间的相似系数分布在 0168～0190之间。说明在分子水平
上各种质间的遗传多样性丰富。其中实生单株 33和 34相似系数最大 , 为 0190, 表明两个实生单株
间亲缘关系最近 , 可能具有相同的父本 ; 实生单株 16与其它实生单株相距较远。
以相似系数 0174为标准 , 可将供试的 44份材料分为 7组。第 1组 : 王族 (M a lus‘Royalty’,
39)、实生单株 1～6、8～10、14、15、17～20和 22～38; 第 2组 : 宝石 (M a lus‘Jewelberry’, 40)、
实生单株 7、11、12、13 和 21; 第 3 组 : 火焰 (M alus‘Flame’, 41 ) ; 第 4 组 : 凯尔斯 (M alus
‘Kelsey’, 42) ; 第 5组 : 草莓果冻 (M alus‘Strawberry Parfait’, 43) ; 第 6组 : 海棠花 (M alus spect2
abilis Borkh. , 44) ; 第 7组 : 实生单株 16。通过聚类发现 , 只有 5株实生单株与父本宝石 ( 40) 聚
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类到了一起。大部分实生单株与母本王族 (39) 聚到一起 , 表明与父本相比大部分实生单株与母本
亲缘关系更近 , 实生单株有向母本聚类的趋势。王斐等 (2007) 对 20个梨的杂交后代分析中也发现
杂交后代与母本的相似性大于父本。
图 2　实生单株及其亲本的 AFL P聚类图
1～38: 实生单株 ; 39: 王族 ; 40: 宝石 ; 41: 火焰 ; 42: 凯尔斯 ; 43: 草莓果冻 ; 44: 海棠花。
F ig. 2　D endrogram of O rnam en ta l Crabapple seedlings and paren ts ba sed on AFL P markers
1 - 38: Seedlings; 39: M alus‘Royalty’; 40: M alus‘Jewelberry’; 41: M alus‘Flame’; 42: M alus‘Kelsey’;
43: M alus‘Strawberry Parfait’; 44: M alus spectabilis Borkh.
213　实生单株与其亲本的 AFL P特征位点分析
从不同引物对供试材料进行扩增的 AFLP指纹图谱中 , 经过计算和分析 , 不仅可以得到供试亲本
的多态性条带 , 而且可以从这些多态性条带中进一步筛选得到一些反映供试亲本与其实生单株遗传关
系的特征性条带。这些特异性条带是区别不同供试亲本品种的特征带 , 包括表现为 “存在 ”的特征
带和表现为 “缺失 ”的特征带两种 (图 3, 图 4) , 也可以作为鉴别供试亲本和其实生单株遗传关系
的特征带 (张开春 等 , 1997; 王斐 等 , 2007)。
图 3　引物 E2ACC /M 2CAC扩增出的宝石的特征带
1～38: 实生单株 ; 39: 王族 ; 40: 宝石 ; 41: 火焰 ; 42: 凯尔斯 ; 43: 草莓果冻 ; 44: 海棠花。ø 代表存在的特征带。
F ig. 3　The character istic bands from Jewelberry am plif ied by E2ACC /M 2CAC pr im er
1 - 38: Seedlings; 39: M alus‘Royalty’; 40: M alus‘Jewelberry’; 41: M alus‘Flame’; 42: M alus‘Kelsey’;
43: M alus‘Strawberry Parfait’; 44: M alus spectabilis Borkh.ø means characteristic bands rep resent p resent.
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图 4　引物 E2AAG /M 2CAG扩增出的宝石、凯尔斯的特征带
1～38: 实生单株 ; 39: 王族 ; 40: 宝石 ; 41: 火焰 ; 42: 凯尔斯 ; 43: 草莓果冻 ; 44: 海棠花。ø 代表存在的特征带 ; Ô代表缺失的特征带。
F ig. 4　The character istic bands from Jewelberry, Kelsey am plif ied by E2AAG /M 2CAG prim er
1 - 38: Seedlings; 39: M alus‘Royalty’; 40: M alus‘Jewelberry’; 41: M alus‘Flame’;
42: M alus‘Kelsey’; 43: M alus‘Strawberry Parfait’;
44: M alus spectabilis Borkh.ø means characteristic bands rep resent p resent;Ô means characteristic bands rep resent absent.
不同的供试亲本具有不同的特征带 , 基于这些特征带可以把所有的供试亲本鉴别开来 (表
2 ) 。
母本王族 (39) 具有区别于其他亲本品种 (可能的父本 ) 的 5条特征带 , 其中包含表现为 “存
在 ”的特征带 2条 ( E2AAG/M 2CAG, 1 400 bp和 E2AAG/M 2CAG, 570 bp) , 表现为 “缺失 ”的特征
带 3条 ( E2ACA /M 2CTG, 1 500 bp; E2AAG/M 2CTA, 1 000 bp和 E2ACC /M 2CAC, 960 bp)。
38株实生单株材料 , 全部都具有母本的特征带 , 其中一些实生单株具有两条以上母本的特征带 ,
一些具备 1条母本的特征带 , 如 12号单株具有 4条母本的特征带 , 9号单株、35号单株具有 3条母
本的特征带 , 5、13、17、19、20、21、23、33、36号单株具有 2条母本的特征带 , 其余实生单株具
有 1条母本的特征带。说明供试的实生单株与母本之间在 DNA水平上存在着一致性。
供试的其它亲本材料也具有自身的特征带 , 如宝石 (40) 有 3条特征带 ( E2AAG/M 2CAG, 680
bp; E2ACC /M 2CAC, 650 bp和 E2ACC /M 2CAC, 940 bp ) ; 凯尔斯 ( 42) 有 2条特征带 ( E2AAC /M 2
CAG, 710 bp和 E2AAG/M 2CAG, 700 bp) ; 海棠花 (44) 有 3条特征带 ( E2AAC /M 2CAG, 1 200 bp;
E2ACA /M 2CTG, 1 600 bp和 E2ACA /M 2CTA, 470 bp) 等。
在 38个实生单株中 , 有一些单株除具有母本王族 (39) 的 1个或几个特征带之外 , 同时只具有
某一个可能的父本的特征带 , 例如实生单株 4、8、13、21、26、28、29、30、34、36、37和 38号除
具有王族 (39) 的特征带外 , 只具有宝石 (40) 的特征带 (表 2, 图 3) , 再如实生单株 6、9、18、
22、23、24和 25号除具有王族 (39) 的特征带外 , 只具有海棠花 (44) 的特征带 (表 2)。有一些
单株除具有母本王族 (39) 的特征带之外 , 同时具有某 2个或 3个父本的特征带 , 如实生单株 11、
12和 15号具有宝石 (40) 和凯尔斯 (42) 的特征带 (表 2, 图 4) , 再如实生单株 27号除具有宝石
(40) 的特征带和凯尔斯 (42) 的特征带 (图 4) , 还具有火焰 (41) 的特征带 (表 2)。
通过这些实生单株具有的父本特征带 , 能够反映出实生单株与可能的父本之间在 DNA水平上具
有一定的亲缘关系。
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表 2　扩增得到的亲本材料的特征带
Table 2　The character istic bands of paren ts am plif ied by AFL P pr im ers
种质名称
Germp lasm
具有的特征带 /bp
Characteristic bands of parents
实生单株 Progeny
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
王族 M.‘Royalty’ E2AAG/M 2CAG21400 (□) + + + + + + + + + + + + + + + + +
E2AAG/M 2CAG2570 (□) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
E2ACA /M 2CTG21500 (○) + + + + + + + + + + + +
E2AAG/M 2CTA 21000 (○) + + + + +
E2ACC /M 2CAC2960 (○)
宝石 E2ACC /M 2CAC2650 (□) + + + + + + + + + + + + +
M.‘Jewelberry’ E2AAG/M 2CAG2680 (□) + + + + + + + + + + + + + +
E2ACC /M 2CAC2940 (○)
火焰 M.‘Flame’ E2ACA /M 2CTA 2900 (○) + +
凯尔斯 M.‘Kelsey’ E2AAC /M 2CAG2710 (○) +
E2AAG/M 2CAG2700 (○) + + + +
草莓果冻 M. E2ACA /M 2CTG2560 (□) + + +
‘Strawberry Parfait’ E2ACA /M 2CTG2550 (○) + + +
海棠花 E2AAC /M 2CAG21200 (□) + + + + +
M. spectabilis E2ACA /M 2CTG21600 (○)
E2ACA /M 2CTA 2470 (○) + +
　　注 : +表示有特征带 ; □表现为 “存在 ”的特征带 ; ○表现为 “缺失 ”的特征带。
　　Note: + characteristic bands revealed; □ characteristic bands rep resent p resent; ○ characteristic bands rep resent absent.
214　实生单株父本的鉴定
聚类图 (图 2) 中实生单株 7、13、21号和宝石 (40) 聚类到了一起 , 且这 3个实生单株全部只
具有宝石这 1个父本 (除母本王族外 ) 的特征带 , 因此可以鉴定出它们的父本为宝石。实生单株 4、
5、8、14、19、20、26、28、29、30、31、33、34、36、37和 38号全部只具有宝石这 1个父本 (除
母本王族外 ) 的特征带 , 并且聚类到一起 , 这 16株实生单株的父本为宝石。根据特征带鉴定出实生
单株 6、9、18、22、23、24和 25号的父本为海棠花 , 实生单株 1、2和 3号的父本为草莓果冻 , 这
些实生单株也分别聚类到了一起。
通过聚类分析发现 : 除实生单株 7、13和 21号直接和它的父本 (宝石 ) 聚类到一起外 , 上述大
部分实生单株没有和它们的父本直接聚类到一起 , 而是和王族聚类到一起。可能与这些实生单株遗传
了母本较多的遗传信息有关 , 杂交后代与母本的相似性大于父本 , 有向母本聚类的趋势。
还有一部分实生单株具有 2个或 3个父本的特征带 , 如实生单株 11、12和 15号具有宝石和凯尔
斯的特征带 , 实生单株 35号具有宝石和火焰的特征带 , 实生单株 27号具有宝石、凯尔斯和火焰的特
征带 , 在聚类图中这 5株实生单株同凯尔斯、火焰两个父本品种相比与宝石相距较近 , 亲缘关系上更
近 , 它们的父本是宝石的可能性较大。
另外 , 实生单株 10、16、17和 32号不具有任何一个父本的特征带 , 但是全部都具有王族的特征
带 , 它们有可能是王族自交或者无融合生殖的后代 , 可能不是杂交种。这 4株需要用其它的方法进一
步的鉴定。
3　讨论
苹果属观赏海棠品种在全世界大约有 700多种 , 多数是通过偶然实生选育的 (郑杨 等 , 2008) ,
具有自交不育率较高的遗传特点 , 是高度的杂合体。本试验中的母本王族自交结实率极低 , 而无融合
生殖率也非常低 (曲晓玲 , 2006)。所以试验中获得的实生单株应该是母本与其它品种杂交而来的 ,
杂交得到的实生后代应同时具有母本和父本的遗传信息。石胜友等 ( 2005) 就根据变叶海棠同时具
有花叶海棠和陇东海棠的专有谱带 , 根据叠加性证实变叶海棠是花叶海棠和陇东海棠的自然杂交种。
本试验的 38个实生单株中 , 有部分单株除具有母本王族的 (一个或几个 ) 特征带之外 , 同时只具有
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某一个父本的特征带 , 如实生单株 6、9、18、22、23、24和 25号除具有王族的特征带之外 , 只具有
海棠花的特征带 , 不具有其它父本材料的特征带 , 而且这些实生单株在聚类图中聚类到一起 , 因此推
测实生单株 6、9、18、22、23、24和 25号的父本为海棠花。有部分实生单株除具有母本王族的 (一
个或几个 ) 特征带之外 , 同时具有某 2个或 3个可能的父本的特征带 , 如实生单株 15号具有宝石和
凯尔斯的特征带 , 实生单株 35号具有宝石和火焰的特征带 , 实生单株 27号具有宝石、凯尔斯和火焰
的特征带等。这可能与父本之间本身就具有很近的亲缘关系有关。通过本试验的聚类分析也发现 , 6
个亲本之间亲缘关系较近 , 相似系数大于 0169。鹿金颖等 ( 2005) 用 AFLP对自然授粉实生后代的
鉴定中也出现了 8株实生后代同时具有尖枣和金丝小枣两个父本的特征带。这种情况应该筛选更多的
引物来进行实生单株亲本的鉴定。另外本试验中还有一部分实生单株 10、16、17和 32号不具有父本
的特征带。Ozaki等 (1995) 在应用 RAPD和 DNA杂交技术对以父本 ‘Benisashi’与母本 ‘Kensaki’
杂交所得 9株梅 F1代进行亲子鉴定 , 以父本的特征带为探针 , 9株 F1代中只有 5株有该特征带 , 余下
的 4株也没有父本的特征带 ; 鹿金颖等 (2005) 对冬枣实生后代的鉴定中同样也出现了 2株实生后
代不具有任何一个父本的特征带 ; 唐建民等 (2006) 在用 RAPD和 SSR分子标记鉴定小金海棠 F1代
杂种实生苗的研究中发现 : 在 F1代中出现了亲本特异带的缺失或部分缺失 , 而经鉴定这些 F1代有部
分不是杂交种。本试验中这 4株实生单株有可能出现了父本特征带的缺失 , 或者本身就不是杂交种 ,
虽然王族的自交率和无融合生殖率很低 , 但是也存在自交和无融合生殖的可能性。
利用 AFLP特征位点进行实生单株亲本的鉴定是可行的 , 但是也存在着一定的缺陷 , 如部分实生
单株同时具有两个或多个父本材料的特征带 , 父本不能够确定 , 还需要和其它的鉴定方法相结合 , 如
形态学方法 (陆秋农和贾定贤 , 1999)、细胞学方法 (郭振怀 等 , 1996)、孢粉学方法 (李晓磊 等 ,
2008)、生化标记的方法 (D raper, 1987) 等来进一步的验证 , 才能够更准确的鉴定出实生单株的亲
本。尽管如此 , 利用 AFLP标记仍为自然杂交或者其它遗传背景不清楚的材料的父母本的鉴定提供了
一种可行的方法 , 它可以为新品种的开发和利用提供理论依据。
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