全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（12）：1929–1936
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–07–06；修回日期：2010–11–03
基金项目：国家自然科学青年基金项目（30800772）；国家香蕉产业技术体系建设项目（nycytx-33）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenjianye@scau.edu.cn）
香蕉果实转录因子 MaWRKY1 基因的原核表达
和多克隆抗体制备
洪克前，邝健飞，陆旺金，陈建业*
（华南农业大学园艺学院，广东省果蔬保鲜重点实验室，广州 510642）
摘 要：MaWRKY1 是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能，制备
了 MaWRKY1 多克隆抗体。选取 MaWRKY1 基因全长中 N 端第 168 ~ 400 个氨基酸之间的包括两个
WRKYGQK 保守域的 cDNA 序列，构建了原核表达载体 pET-MaWRKY1，并转化到大肠杆菌 BL21 中诱
导表达菌体蛋白。SDS-PAGE 电泳检测结果表明，His-MaWRKY1 融合蛋白成功获得了高效表达，分子量
在 26 kD 左右。His-MaWRKY1 融合蛋白经过 Ni-NTA 琼脂糖凝胶树脂纯化，SDS-PAGE 制备胶割胶富集，
电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到 0.5 mg · mL-1。经对新西兰兔进行 5 次免疫，获得了多克隆抗血
清，采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA）和蛋白质印迹
（Western blot）分析，表明所制备的抗体具有很好的效价，效价比为 1︰160 000，同时具有良好的灵敏度
和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白，Western blot 检测显示，在分子量 26 kD 左右处出现特异的
蛋白质条带，证明所制备的抗体可以与香蕉 WRKY 蛋白特异性结合，并且低温可以诱导香蕉果实中
MaWRKY1 蛋白表达，暗示 MaWRKY1 蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。
关键词：香蕉；WRKY；转录因子；原核表达；多克隆抗体；耐冷性
中图分类号：S 668.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）12-1929-08

Prokaryotic Expression of Banana Transcription Factor MaWRKY1 Gene
and Preparation of Its Polyclonal Antibody
HONG Ke-qian，KUANG Jian-fei，LU Wang-jin，and CHEN Jian-ye*
（Guangdong Key Laboratory for Postharvest Science，College of Horticulture，South China Agricultural University，
Guangzhou 510642，China）
Abstract：To investigate the function of the MaWRKY1 gene，a transcription factor previously cloned
from banana fruit，the polyclonal antibody of MaWRKY1 was prepared. The recombinant plasmid
pET-MaWRKY1 was constructed with 699 bp segments started from the 168 amino acid to the 400 amino
acid including the two conserved motif WRKYGQK and an about 26 kD expressed His-MaWRKY1 fusion
protein was identified by SDS-PAGE following the expression of the recombinant His-MaWRKY1 fusion
protein in E.coli BL21（DE3）cells with high efficiency. About 0.5 mg · mL-1 fusion protein was obtained
after puified by Ni-NTA agarosecolumn，separated by SDS-PAGE，excised from the gel and electroeluted，
then the purified fusion protein was used as antigen to prepare polyclonal antiserum in rabbits. After the fifth

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injection of antigen，the antiserum was obtained and further purified with method of immuno-precipitation.
Indirect ELISA test and the western blot analysis showed that the obtained anti-MaWRKY1 polyclonal
antibody have good sensitivity and high specificity with a titer of 1︰160 000. Furthermore，western blot
assay revealed that a 26 kD peptide was specifically detected in the total proteins of different banana
tissues with anti-MaWRKY1 polyclonal antibody，indicating that the antibody could react to the total
proteins expressed in banana specifically. In addition，low temperature could induce the expression of
MaWRKY1 protein in banana fruit，suggesting that the expression of MaWRKY1 protein in banana fruit
was likely to be involved in regulating the chilling-tolerance of fruit.
Key words：banana；WRKY；transcription factor；prokaryotic expression；polyclonal antibody；
chilling-tolerance

WRKY 是一类植物所特有的转录因子家族，目前已在 10 多种植物如野燕麦、欧芹、拟南芥、
烟草、水稻、大麦、辣椒、葡萄等克隆到 WRKY 基因（Pandey & Somssich，2009）。WRKY 转录因
子一般都含有 1 或 2 个 WRKYGQK 序列和一个锌指结构约 60 个氨基酸的区域（Dong et al.，2003；
Eulgem & Somssich，2007）。WRKY 蛋白质通过特异地结合靶基因（如 NPR1、病程相关蛋白基因
PR 等）启动子区域的特异序列 TGACC（A T）（W 盒）而调节靶基因的表达（Ulker & Somssich，
2004）。研究表明，WRKY 基因能够调控植物对生物逆境的反应，如调控水杨酸和茉莉酸介导的抗病
反应（Li et al.，2006；Qiu et al.，2007）。此外，WRKY 基因还可以调控植物对非生物逆境，如温度
逆境（Seki et al.，2002）、伤害胁迫（Hara et al.，2000）、氧化胁迫（Rizhsky et al.，2004）、干旱（Pnueli
et al.，2002）及盐害（Seki et al.，2002；Jiang & Deyholos，2009）等的反应。因此，深入研究植物
WRKY 转录因子对逆境的反应及其在逆境条件下的功能，对正确认识胁迫信号的传导、抗逆相关基
因的调控以及提高作物的抗逆性有重要的指导意义和实际应用价值。
香蕉在采后贮运过程中容易遭受低温和病害，从而限制了其贮藏期并导致品质劣变。作者所在
课题组首次从香蕉果实中分离到两个 WRKY 基因全长，分别命名为 MaWRKY1 和 MaWRKY2，分析
表明 MaWRKY1 的基因表达与采后香蕉果实抗冷性密切相关（数据另外发表）。为了在蛋白水平上研
究 MaWRKY1 基因功能，本研究中将 MaWRKY1 基因中最保守序列插入到原核表达载体 pET-30a(+)
中，构建 pET-MaWRKY1 原核表达载体，诱导表达得到纯化蛋白，并制备了 MaWRKY1 多克隆抗体，
旨在为进一步研究 MaWRKY1 基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
香蕉品种为‘巴西’（Musa AAA group，‘Brazil’），果实于 2010 年 5 月购自广东省番禺香蕉果
园，采收成熟度七至八成，落梳后立即运回实验室。分别取幼根、幼叶和花，以及 7 ℃下贮藏 0 d
或 5 d 的果实（分别取果皮和果肉），常温 25 ℃下贮藏 5 d 的果实（分别取果皮和果肉），用液氮速
冻并置于﹣80 ℃备用。
质粒 pET-30a(+)购自 Novagen 公司，E. coli DH5α，BL21（DE3）均由广东省果蔬保鲜重点实验
室保存。pMD18-T、BamHⅠ、NdeⅠ限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、胶回收试剂盒、DNA marker
购自 TaKaRa 公司；Ni-NTA 琼脂糖凝胶树脂购自 Novagen 公司；脱脂奶粉、弗氏完全佐剂和弗氏不
完全佐剂购自 Sigma 公司；预染蛋白质 Marker、PVDF 膜购自 Bio-Rad 公司；辣根过氧化物酶（HRP）
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标记的羊抗兔 IgG 抗体购自 Promega 公司；化学发光检测试剂盒（ECL）购自 Thermo Scientific 公
司；其它常规试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 试验方法
1.2.1 MaWRKY1基因片段的扩增
根据本实验室已克隆的 MaWRKY1 基因全长中 N 端第 168 ~ 400 个氨基酸之间的 cDNA 序列（该
段序列包括两个 WRKYGQK 保守域），在两条引物上分别引入 NdeⅠ和 BamHⅠ酶切位点，上游引
5′-GGAATTCCATATGCATCGKCAGCCWTGGATGCARGCWAGAGCNGATGGCAGYAGATCWCTK
GCATCCAATCCAGCTCACT-3′；下游引物：5′-CGCGGATCCCGCCCTGAGATCATGCGACGC-3′（下
划线为酶切位点）。以合成的香蕉果实 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 产物电泳检测后回收，与
pMD18-T 载体连接，构建重组质粒 pMD-MaWRKY1，用 PCR 扩增或酶切两种方法确认已插入的质
粒作序列分析（由上海英骏生物技术有限公司测序），选择测序正确的阳性克隆提取质粒 DNA。
1.2.2 pET-MaWRKY1原核表达载体的构建
NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切测序正确的质粒，回收目的片段，与经 NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切的
pET-30a(+)载体进行定向连接，构建原核表达载体 pET-MaWRKY1，转化感受态细胞 DH5α，选取酶
切正确的克隆提取质粒 DNA，转化大肠杆菌 BL21（DE3）。
1.2.3 pET-MaWRKY1融合蛋白的诱导表达
挑取带有重组质粒 pET-MaWRKY1和空白载体 pET-30a(+)的E. coli BL21分别接种至含有卡那霉
素（Kan，50 μg · mL-1）的 LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养过夜。再按 1︰100 的比例接种于相同
的新鲜 LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养至 OD600约为 0.6 时，加 IPTG 至终浓度 1.0 mmol · L-1诱导
4 h。离心并收集菌液，4 ℃，12 000 × g 离心 1 min。弃上清液，沉淀用 100 μL 2 × SDS 凝胶加样
缓冲液重悬，混匀后沸水浴 5 min，12 000 × g 离心 1 min。取 20 mL 上清液进行 SDS-PAGE（3%浓
缩胶，12%分离胶）电泳，检测目的蛋白表达情况。
1.2.4 融合蛋白的纯化
参考 Tian 等（2006）和高宁等（2008）的方法进行。将诱导 4 h 后的菌体经裂解液离心后，上
清用 0.45 μm 滤膜过滤，按照 Novagen 公司的 Ni-NTA His-bind resin 亲和柱说明洗脱蛋白。将数次
收集的洗脱峰蛋白用 12%SDS-PAGE 进行分离，将电泳后的凝胶用蒸馏水淋洗干净，再浸泡在预冷
的 0.25 mol · L-1KCl 中染色 2 ~ 5 min 后即可显色，显色后从凝胶上切下目的条带。将所有目的条带
汇集后电洗脱，洗脱液用 PEG8000 浓缩，然后透析去除离子。取少量透析产物和 BSA 标准品进行
SDS-PAGE 电泳，以检测纯化效果和纯化后目的蛋白的浓度。
1.2.5 多克隆抗体制备、效价测定及特异性检测
将纯化、冻干后的 MaWRKY1 融合蛋白（0.5 mg · mL-1）溶于生理盐水和弗氏完全佐剂，研磨
使其相互融合达到油包水状态。按照常规方法免疫成年雄性兔 2 只，免疫 5 次后取血，分离血清，
﹣20 ℃保存。用 Protein A Plus 纯化抗血清后获得 MaWRKY1 多克隆抗体。采用间接 ELISA 法测定
抗体效价。提取转化空载体 pET-30a(+)、经 IPTG 诱导和未诱导重组质粒 pET-MaWRKY1 的菌株蛋
白进行 Western blot，以验证抗体的特异性。
1.2.6 Western blot检测
参考王卓等（2009）的方法提取香蕉不同组织总蛋白，采用 Bio-Rad 公司的 Quick Start Bradford
蛋白定量试剂盒测定所提取的蛋白含量，以 BSA 为标准品建立标准曲线。参考 Chen 等（2008）的
方法进行 Western blot 分析：取 30 μg 香蕉不同组织或菌株的总蛋白进行 SDS-PAGE，电泳结束后将
胶上蛋白质以湿转方式电转移（100 mA，2 h）至 0.2 μm PVDF 膜上。电转后的 PVDF 膜经 TBS（10
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mmol · L-1Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol · L-1NaCl）洗涤后，浸入 30 mL 封闭液（TBS + 0.05% Tween
20 + 50 g · L-1 脱脂奶粉）中在摇床上轻摇，室温封闭 2 h，4 ℃封闭过夜。以本试验制备的 MaWRKY1
多克隆抗体为一抗（1︰3 000），室温下在摇床上轻摇反应 3 h，后用 TBST（TBS + 0.05% Tween 20）
洗膜 3 次，每次 10 min。以 1︰5 000 的比例加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG，室温孵育 2 h，用 TBST
和 TBS 充分洗涤后，用化学发光剂 ECL 孵育膜 3 min，在暗室用 X 光胶片曝光检测。
2 结果与分析
2.1 MaWRKY1 基因片段的分离
经 RT-PCR 扩增后得到长度约为 699 bp 基因片段，与预期结果相符。将此片段连接到 pMD18-T
载体上，选择阳性克隆测序，测序结果显示核苷酸序列与原序列在 5′端出现 4 个核苷酸的突变，同
源性为 99%，但翻译后的氨基酸序列与原序列完全一致。表明已成功分离到香蕉 MaWRKY1 基因片
段 cDNA 序列，具有正确编码框和酶切位点，可用于后续试验。
2.2 pET-MaWRKY1 原核表达载体的鉴定
pET-30a(+)为 5.4 kb 左右的具有多克隆位点的原核表达载体。将测序正确的克隆提取质粒酶切
后，将 MaWRKY1 基因片段插入到同样经双酶切的原核表达载体 pET-30a(+)上，构建原核表达载体
pET-MaWRKY1。对构建的 pET-MaWRKY1 质粒进行 NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切，产物呈现出清晰的两
条带，分别为 pET-30a(+)（5 400 bp）和 MaWRKY1（699 bp），表明原核表达载体构建成功，并将正
确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌 BL21（DE3）。
2.3 MaWRKY1 融合蛋白的诱导表达与纯化
经 IPTG 诱导 4 h 后的 MaWRKY1 融合蛋白的 SDS-PAGE 检测结果如图 1 所示：与转化空载体
pET-30a(+)的大肠杆菌 BL21 相比，含有重组质粒的大肠杆菌 BL21 经 IPTG 诱导后产生大量分子量
约为 26 kD 的表达产物，与预期目的蛋白大小一致，证明目的基因在该表达系统获得了正确表达。

图 1 pET-MaWRKY1 在大肠杆菌 BL21 中表达的 SDS-PAGE 分析
M：蛋白质 marker；1：转化 pET-30a(+)空载体的总蛋白；2，3：转化 pET-MaWRKY1 经 IPTG 诱导 4 h 的总蛋白。
Fig. 1 SDS-PAGE of expression of pET-MaWRKY1 in E. coli BL21
M：Protein marker；1：Total proteins of E. coli BL21 transformed by pET-30a(+) after induction；
2，3：Total proteins of E. coli BL21 transformed by pET-MaWRKY1 at 4 h after induction.

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MaWRKY1 融合蛋白纯化后，进一步 SDS-PAGE 电泳检测证实得到了较纯的 26 kD 的目的条带，
纯化蛋白的浓度约为 0.5 ~ 1 mg · mL-1（图 2），可以用作免疫原。

图 2 纯化后的 MaWRKY1 融合蛋白的 SDS-PAGE 分析
M：蛋白质 marker；1：牛血清蛋白（BSA）2 g；2：BSA 1 g；3：纯化后 MaWRKY1 2 L。
Fig. 2 SDS-PAGE of the purified MaWRKY1 fusion protein
M：Protein marker；1：BSA 2 g；2：BSA 1 g；3：Purified MaWRKY1 2 L.

2.4 MaWRKY1 多克隆抗体制备、效价及特异性分析
将纯化后的MaWRKY1融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔，得到抗血清，进一步经过Protein A Plus
纯化获得多克隆抗体。以 MaWRKY1 纯化蛋白包被 96 孔板（每孔 0.1 g），以未免疫的正常兔血清
为对照，以常规间接 ELASA 法测定抗体效价。结果如图 3 所示，当 OD490 为 0.5 时，抗体的稀释
倍数在 102 400 ~ 204 800 之间，约为 160 000 左右，即利用这一浓度可以有效地检测到抗原，表明
制备的抗体具有很高的检测灵敏度。
图 3 MaWRKY1 多克隆抗体的效价分析
箭头所指为 OD490 为 0.5 时的抗体稀释倍数。
Fig. 3 Analysis of anti-MaWRKY1 titer by ELISA
The arrow indicated the 0.5 absorbance value that corresponds to antibody dilution fold.

为验证制备抗体的特异性，采用 Western blot 在上述大肠杆菌表达体系中进行检测。
结果显示：以转化空载体 pET-30a(+)和未经 IPTG 诱导的重组质粒的菌体裂解物作为对照，未
见信号（图 4），而含有重组质粒经 IPTG 诱导 4 h 的菌体裂解物可见预期信号（图 4），表明制备的
抗体可特异识别 26 kD 的目标抗原。
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图 4 MaWRKY1 多克隆抗体的特异性分析
1：转化 pET-30a(+)空载体的总蛋白；2：转化 pET-MaWRKY1 未经 IPTG 诱导的总蛋白；
3：转化 pET-MaWRKY1 经 IPTG 诱导 4 h 的总蛋白。
Fig. 4 The specificity analysis of polyclonal antibody of MaWRKY1
1：Total proteins of E. coli BL21 transformed by pET-30a(+) after induction；
2：Total proteins of E. coli BL21 transformed by pET-MaWRKY1 without IPTG induction；
3：Total proteins of E. coli BL21 transformed by pET-MaWRKY1
at 4 h after IPTG induction.

2.5 香蕉组织中 MaWRKY1 蛋白的表达分析
Western blot 分析结果表明在幼根、幼叶、花和 7 ℃贮藏前的果肉中没有检测到 MaWRKY1 蛋
白的表达，在 7 ℃贮藏前的果皮中检测到 MaWRKY1 蛋白的表达（图 5），分子量约为 26 kD，这
进一步证实了本试验制备的抗体具有良好的特异性。
值得注意的，7 ℃贮藏 5 d 后，果皮中的 MaWRKY1 蛋白的表达明显增强，果肉中也能检测到
MaWRKY1 蛋白的表达，而常温下贮藏 5 d 后，果皮和果肉中 MaWRKY1 蛋白的表达与 7 ℃贮藏前
一致，无明显变化。
上述结果说明低温可以诱导 MaWRKY1 蛋白在香蕉果皮和果肉中的表达。
图 5 香蕉组织中 MaWRKY1 蛋白的表达分析
1：根；2：叶；3：花；4：7 ℃贮藏前果皮；5：7 ℃贮藏前果肉；6：7 ℃贮藏 5 d 后果皮；
7：7 ℃贮藏 5 d 后果肉；8：常温贮藏 5 d 后果皮；9：常温贮藏 5 d 后果肉。
Fig. 5 Expression analysis of MaWRKY1 protein in banana tissues
1：Root；2：Leaf；3：Flower；4：Peel of fruit prior to stored at 7 ℃；5：Pulp of fruit prior to stored at 7 ℃；
6：Peel of fruit stored at 7 ℃ for 5 day；7：Pulp of fruit stored at 7 ℃ for 5 day；
8：Peel of fruit stored at room temperature for 5 day；
9：Pulp of fruit stored at room temperature for 5 day.
3 讨论
在过去 20多年中，采用各种载体在各种表达系统中已经表达了数百种重组蛋白，尤其是用原核
表达的重组蛋白免疫动物来制备抗体已成为一种行之有效的方法（程彦伟 等，2008）。此外，通过
原核表达获得大量的抗原蛋白，也可用于蛋白质性质与功能、蛋白质的相互作用和多种生化功能研
究（王增 等，2009）。
本研究中，将 MaWRKY1 基因保守片段克隆到 pET-30a(+)原核表达载体上，其表达受噬菌体 T7
强转录及翻译信号控制，以 1.0 mmol · L-1IPTG 诱导 4 h 实现了 MaWRKY1 融合蛋白的高效表达（图
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1）。MaWRKY1 融合蛋白经 Ni-NTA His-bind resin 亲和柱亲和层析洗脱后，经切胶回收、电洗脱、
浓缩以及透析等流程后，得到了满足抗体制备需要的高纯度抗原（图 2），经免疫新西兰兔，Protein
A Plus 纯化抗血清后得到了效价较高、灵敏度和特异性好的多克隆抗体，该抗体不只可以识别在大
肠杆菌原核表达的 MaWRKY1 融合蛋白，而且还可以特异识别香蕉组织总蛋白中的 MaWRKY1 蛋
白。多克隆抗体的成功制备为进一步研究香蕉 MaWRKY1 蛋白功能奠定了基础，也为其免疫定位和
研究与其相互作用的蛋白提供了工具。
近年来，越来越多的研究表明，WRKY 转录因子为接受逆境胁迫信号、调控逆境相关基因表达
的重要转录因子之一，在植物逆境信号转导中具有重要位置（Pandey & Somssich，2009；张娟，2009；
张颖 等，2009）。自 1994 年在甜薯中发现第一个 WRKY 转录因子后，在越来越多的植物中发现了
WRKY 转录因子，目前，在公共数据库中已经发表了多个物种的 WRKY 基因序列，其数量已经超过
1 000 个。但这些 WRKY 基因主要集中在一些已经完成测序的物种如水稻，拟南芥，杨树，葡萄等
（张颖 等，2009），而在其它如蔬菜等经济植物中有关 WRKY 的研究较少。此外，目前有关 WRKY
转录因子家族成员的研究还主要集中在基因的克隆、表达及其通过功能缺失或超表达研究其功能等
方面，制备 WRKY 抗体，从蛋白水平来研究 WRKY 转录因子蛋白表达与植物抗逆性的关系方面报
道甚少。本试验中，利用制备的 MaWRKY1 多克隆抗体初步研究发现 MaWRKY1 蛋白表达受低温
诱导，低温条件下果皮和果肉中 WRKY 蛋白表达明显增强（图 5），结合本课题组前期的研究结果，
7 ℃低温贮藏过程中，香蕉果实冷害指数、果皮 MDA 含量和相对电导率明显上升（Chen et al.，2008），
表明 MaWRKY1 蛋白表达与采后香蕉果实的耐冷性可能有一定的关系。有关 MaWRKY1 蛋白参与
调控香蕉果实耐冷性的机制，将是下一步研究的重点内容。

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——中国园艺学会 2010 年学术年会论文摘要集

本论文摘要集共收录果树、蔬菜、西瓜甜瓜和观赏植物方面论文摘要 137 篇，其中果树 51 篇，蔬菜 56 篇，西
瓜甜瓜 10 篇，观赏植物 12 篇，其它 8 篇，内容涉及种质资源、遗传育种、分子生物学、栽培技术、生理生化、贮
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