全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2009, 36 (9) : 1375 - 1380
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 13; 修回日期 : 2009 - 07 - 14
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 (30830079) ; 国家自然科学基金项目 (30671419, 30700541) ; 国家高技术研究发展计划
专项 (2008AA10Z150, 2006AA10Z1A8, 2006AA100108) ; 国家重点基础研究发展计划项目 (2009CB119000) ; 国家科技支撑计划项目
(2008BADB105, 2006BAD13B06, 2006BAD01A725211)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jfchen@njau1edu1cn)
6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因 (6PGDH ) 的克隆与
甜瓜属异源四倍体的分子验证
魏 跃 1, 2 , 吴志明 1 , 张蜀宁 1 , 陈劲枫 13
(1南京农业大学 , 南方蔬菜遗传改良重点开放实验室 , 南京 210095; 2 江苏农林职业技术学院 , 江苏镇江 212400)
摘 要 : 根据已发表的黄瓜 6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (62phosphogluconate dehydrogenase ) 基因 6PGDH
的 cDNA序列 ( GenBank登录号 : EU815934) 设计引物 , 扩增了甜瓜属异源四倍体新种及野生种和栽培黄
瓜 ‘北京截头 ’的 6PGDH基因片段 , 测序结果表明 3个种的 6PGDH基因片段序列表现出高度的一致性 ,
长度均为 1 098 bp包含 936 bp编码 311个氨基酸的阅读框和 162 bp的 3′非翻译区末端 , 片段内无内含子存
在。利用 DNAMAN软件检测到异源四倍体新种与野生种和栽培黄瓜 ‘北京截头 ’氨基酸的差异位点有 3
个 , 碱基差异位点有 22个 , 差异位点的遗传分布符合孟德尔遗传学定律 , 从而在分子水平证实了异源四倍
体新种是野生种和栽培黄瓜 ‘北京截头 ’的杂交后代。
关键词 : 黄瓜 ; 异源四倍体 ; 6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶 ; 杂交种 ; 克隆
中图分类号 : S 652 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0921375206
C lon ing of 62phosphoglucona te D ehydrogena se Gene ( 6PGD H ) and M olecu2
lar Conf irma tion of A llotetraplo id in C ucum is
W E I Yue1, 2 , WU Zhi2m ing1 , ZHANG Shu2ning 1 , and CHEN J in2feng13
(1 Key Laboratory of Sou thern V egetable C rop Genetics Im provem ent, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, Ch ina;
2 Poly techn ical College of A griculture and Forestry, Zhen jiang, J iangsu 212400, China)
Abstract: In order to demonstrate that the synthetic allotetrop loid species ( Cucum is hytivus Chen and
Kirkbride. , 2n = 38) was the hybrids p rogeny originated from crossing between the wild Cucum is species (C.
hystrix Chakr. , 2n = 24) and the cultivated cucumber‘Beijing J ietou’(C. sa tivus L. , 2n = 14) in molecu2
lar level, p rimers were designed according to the 62phosphogluconate dehydrogenase ( 6PGDH ) gene cDNA
sequence of cucumber ( GenBank accession number: EU815934). The 6PGDH gene fragments were amp lified
from allotetrop loid, the wild Cucum is and cultivated cucumber‘Beijing J ietou’, respectively. Sequence
analysis showed that the 6PGDH fragments in three species were highly homologous, having 1 098 bp length
each. It encompassed of 936 bp long open reading frame (ORF) encoding 311 am ino acids and had 162 bp
non2translation 3′2term inal end region (3′UTR) , no intron existed in 6PGDH fragment. The sequences were
analyzed by software p rogram DNAMAN, detected three variable am ino acid locipis and twenty2two bases locipis.
The inheritance of variable locipis were congruence with the Mendelpis genetics law of inheritance, therefore, it
is p roven at molecular level that this synthetic allotetrap loid species was the hybrid originated from C. hystrix
and C. sa tivus‘Beijing J ietou’crossing.
Key words: cucumber; allotetrop loid; 6PGDH; hybrid; clone
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园 艺 学 报 36卷
甜瓜属异源四倍体新种 (C. ×hy tivus Chen and Kirkbride. , 2n = 38, HHCC) 是陈劲枫等利用甜
瓜属野生种 (Cucum is hystrix Chakr. , 2n = 24, HH) 与黄瓜栽培品种 ‘北京截头 ’ (C. sa tivus‘Bei2
jing J ietou’, 2n = 14, CC) 进行杂交选育而成 (Chen et al. , 1997, 2000, 2002, 2003; Chen & Adel2
berg, 2000)。对于该异源四倍体新种的遗传鉴定 , 前人从农艺形态特征 (陈劲枫 等 , 2001)、同工酶
(陈劲枫 等 , 2002)、细胞遗传学 (庄飞云 等 , 2005)、RAPD、SSR、AFLP分子标记 (庄飞云 等 ,
2003, 2005, 2006) 等方面进行了研究。
6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶 ( 6PGDH ) 是戊糖磷酸途径的一个限速酶 (沈同和王镜岩 , 1990 )。
6PGDH基因已经从玉米 ( Zea m ays AF061838)、大豆 (Glycine m ax AB007907)、苜蓿 (M edicago sa ti2
va U18239 )、拟南芥 (A rabidopsis tha liana AY084486 )、菠菜 ( Spinacia oleracea AF295670 )、水稻
(O ryza sa tiva AY278362) 等中克隆。作者曾以栽培黄瓜品种 ‘露丰 ’为材料对 6PGDH 基因片段
( GenBank登录号 : EU815934) 进行了成功克隆。在此基础上 , 本试验选择经过 5代自交的异源四倍
体新种及甜瓜属野生种和栽培黄瓜品种 ‘北京截头 ’作为研究对象 , 对其 6PGDH基因序列进行克
隆 , 并用 6PGDH基因作为分子标记 , 旨在分子水平上探讨 3个种在 6PGDH序列上的差异与遗传分布
规律 , 同时也为对能否利用类似 6PGDH的功能核基因序列进行杂交种的鉴定提供借鉴。
1 材料与方法
以南京农业大学黄瓜课题组提供的黄瓜栽培品种 ‘北京截头 ’、甜瓜属野生种及其异源四倍体新
种 F5代为试验材料。种子播种于灭菌基质中并放置于人工气候箱中培养 , 温度为 28 ℃, 每日光照
14 h, 幼苗 2～3片真叶时取嫩叶。M 2MLV反转录酶、PMD192T载体、Taq酶均为 TaKaRa公司产品 ,
大肠杆菌 TOP10为本实验室保存 , TR IZOL为美国 B IPEC公司生产。
黄瓜叶片 DNA提取采用 CTAB法 (Murray & Thomp son, 1980) , RNA提取采用 TR IZOL试剂法 ,
以 O ligo ( dT) 14 : 5′2GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTT23′( Hayashi et al. , 2004) 为反转录
引物 , M 2MLV反转录酶合成 cDNA。
根据已发表的黄瓜 6PGDH cDNA序列 ( GenBank登录号 : EU815934) 设计上、下游引物。上游
引物 : 5′2GGGAATTTTGTGAAGATGGT23′; 下 游 引 物 : 5′2CTGCTATCTACTCCCCTAA23′。分 别 以
cDNA、DNA为模板进行 PCR扩增 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 115 m in, 35个循环 ;
72 ℃ 10 m in, 4 ℃保存。
回收的目的片段连接到 PMD192T载体上 , 连接产物转化感受态大肠杆菌 TOP10, 进行蓝白斑筛
选。挑取白斑接种于 1 mL LB (含 100 mg·L - 1氨苄青霉素 ) 液体培养基中。37 ℃ 150 r·m in - 1培养
振荡过夜。在相同条件下进行 PCR扩增 , 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。
序列测定由上海博亚生物科技公司完成 , 在 NCB I站点进行 BLAST相似性比较 , 利用 DNAMAN
软件进行多序列比对及同源性分析。
2 结果与分析
211 ‘北京截头 ’、野生种、异源四倍体新种 6PGD H 基因克隆
‘北京截头 ’、野生种、异源四倍体新种分别以叶片 cDNA和 DNA (图 1) 为模板进行扩增都得
到长度为 1 098 bp的条带。测序结果显示 ‘北京截头 ’碱基序列与报道的黄瓜 6PGDH碱基序列完全
一致。在 NCB I进行 B last分析 , 野生种、异源四倍体新种 cDNA编码的 311个氨基酸序列与黄瓜、拟
南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜 6PGDH基因有 75%以上的同源性 , 由此确定为 6PGDH基因片段。
三者 cDNA片段均编码 311个氨基酸 , TGA 为终止子密码 , 接着为长度 162 bp 的 3′端非翻译区
(UTR) 末端。3个种 6PGDH基因编码区 (ORF) 的 cDNA序列与各自相对应的 DNA序列完全相同 ,
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9期 魏 跃等 : 6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因 (6PGDH) 的克隆与甜瓜属异源四倍体的分子验证
说明编码区内均无内含子存在。
图 1 以 cD NA ( A) 和 D NA ( B) 为模板 6PGDH 基因的 PCR扩增结果
M: 标准分子量 ; 1: 野生种 ; 2: 异源四倍体新种 ; 3: ‘北京截头’。
F ig. 1 The electrophoresis results of 6PGDH gene PCR products using cD NA ( A) and D NA ( B) a s tem pla te
M: Marker; 1: W ild species; 2: A llotetrop loid; 3: Cucumber‘Beijing J ietou’.
212 6PGD H 基因氨基酸、碱基差异位点的遗传分析
利用 DNAMAN软件对 ‘北京截头 ’、异源四倍体新种、野生种 6PGDH基因片段编码的 311个氨
基酸序列进行比对分析 (图 2) , 结果显示只有 3个氨基酸位点存在差异 , 同源性达到 99168% , 差异
位点占氨基酸总数比率仅为 0196% , 表明 6PGDH在甜瓜属不同种中保守性较强。
图 2 三个物种 6PGDH 氨基酸序列同源性比较
F ig. 2 A lignm en t of pred icted am ino ac id sequences of 6PGDH from three spec ies
异源四倍体新种在第 28和第 99氨基酸位点 , 继承了野生种的 H、A, 不同于 ‘北京截头 ’的
R、V; 在第 183氨基酸位点继承了 ‘北京截头 ’的 F, 不同于野生种的 L。差异氨基酸位点的遗传分
布符合孟德尔遗传学定律 , 表明异源四倍体新种是 ‘北京截头 ’和野生种的杂交后代。将所得 3个
种的 6PGDH基因 DNA碱基序列经过比对 (图 3) , 对其中的差异位点 (3个种同一位点上的碱基类
型不完全相同 ) 及其碱基组成进行分析统计 , 详细结果列于表 1。
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图 3 三个物种 6PGD H D NA碱基序列同源性比较
F ig. 3 A lignm en t of D NA ba se sequences of 6PGDH from three spec ies
表 1 6PGDH 基因 D NA序列碱基差异类型
Table 1 The var iable loc i and ba se types of 6PGDH gene D NA sequences
样品 Samp le
差异位点 Locus number
3 9 12 54 83 105 201 219 294 296 300 396 411 444 549 636 744 795 837 962 1043 1071
‘北京截头’ G T G C G C T C T T G G C T T C C G G C T C
‘Beijing Jietou’
异源四倍体 G T G C A C T C T C A G C C T C C G G C N3 N3
A llotetrop loid
野生种 A C T G A T C G C C A T G T G T G A A T C T
W ild species
3 N =A + T + C + G。
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9期 魏 跃等 : 6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因 (6PGDH) 的克隆与甜瓜属异源四倍体的分子验证
长度为 1 098 bp碱基序列共有 22个差异位点 , 占序列总长度的 2% , 碱基的差异比率大于氨基
酸 , 这可能是因为氨基酸在进化过程中所承受的选择压力比较大而碱基往往较易发生不改变氨基酸的
同义突变。22个差异碱基中有 19个发生在编码区 , 3个发生在 3′端非编码区。编码区中 19个差异位
点中只有 3个导致编码氨基酸不同 , 其余 16个属于同义突变 , 这证实了碱基易发生同义突变的推断。
在异源四倍体新种 22个差异碱基中 , 有 16个完全来自 ‘北京截头 ’, 占差异总数的 7217% , 3个来
自野生种 , 占差异总数的 1316% , 第 444个碱基位点发生 T→C的转换突变而与双亲都不相同 , 第
1 043个、第 1 071个碱基位点经过突变产生了全部 4种碱基而与双亲部分相同。经统计有 8614%的
差异碱基遗传分布完全符合孟德尔遗传学定律 , 支持异源四倍体新种是 ‘北京截头 ’和野生种的杂
交后代。另存在 911%的差异碱基与双亲部分相同 , 415%的差异碱基与双亲都不相同 , 这可能是因
为异源四倍体新种经过 5代自交积累的 DNA突变而造成的基因序列多样化。
3 讨论
Chen等 (2002)、庄飞云等 (2003) 从形态特征上发现甜瓜属异源四倍体新种的主蔓直径、叶
柄长、第 1朵雄花萼筒和花冠长度、叶形状和大小介于双亲之间而呈中间型 ; 主蔓节长、密棕茸毛
(尤其是在花瓣和雌蕊上 )、桔黄色花冠及卵圆形果实特征与野生种相似 ; 植株的分枝数、第 1雌花
节位偏向父本 ‘北京截头 ’。此外还表现出一些独特的性状 , 如苗期叶色呈黄绿色 , 叶缘弯曲度大 ,
缺刻多 , 茎节间较短而壮。利用分子标记 RAPD、SSR、AFLP (庄飞云 等 , 2003, 2005, 2006) 进行
分析 , 大多数扩增反应中亲本的条带基本上在异源四倍体新种中获得了表达 , 但在一些引物中出现父
母本条带的偏表达或缺失现象 , 此外还出现了新种的特征带。这些形态特征和分子标记都为明确 3个
种的亲缘关系提供了依据。
从孟德尔遗传学定律以及植物有性生殖的特点可知 , 当两个亲本进行杂交如果两个亲本在相同位
点上的等位基因序列不同 , 那么在高代自交后代中将会含有两种不同等位基因序列中的一个。因此当
需要验证一个植物杂交种或一个杂交组合是否成功 , 可以通过检测亲本和杂交后代基因序列上各个位
点的氨基酸和碱基组成的方法来进行判断 , 这种序列分析的方法比上述形态学、分子标记的方法能更
精确地反映出亲本和杂交后代之间细微的基因差异和遗传关系 , 且不受倍性和栽培环境的影响。进行
此类研究时为了获得相对可靠的结果 , 往往会选择进化速率慢相对保守的氨基酸或外显子序列进行分
析。6PGDH保守性较强 ( Fahrendorf et al. , 1995) , 且编码区中不含内含子 ( Karsten et al. , 2001;
Huang et al. , 2003; B rover et al. , 2006 ) , 这是本试验中选用其作为亲源关系研究的依据。本研究中
通过对 6PGDH氨基酸和碱基遗传分布分析表明异源四倍体新种是栽培种黄瓜和甜瓜属野生种的杂交
后代 , 与形态特征和分子标记分析的结论一致。此方法在甜瓜属种间远缘杂交鉴定的成功应用 , 表明
基因序列分析方法是分析亲缘关系和分子遗传特性的一条十分有效途径。值得注意的是功能基因的氨
基酸序列在进化过程中选择压力大 , 保守性强 , 进行亲缘关系分析准确性高但可提供分析的差异位点
较少 , 如果双亲亲缘关系较近可能由于差异位点太少而无法分析 ; 基因碱基序列由于存在密码子的简
并性 , 差异比率相对高一些 , 可提供分析的差异位点相对较多 , 但由于存在 DNA突变与积累 , 随着
自交代数增加导致杂交后代与亲本的碱基偏离增大 , 误差增加会影响判断的准确性。因此基因序列分
析方法最适用于双亲亲缘关系较远且杂交后代是低代的情况。本试验中由于 6PGDH是核编码基因
( Karsten et al. , 2001; Huang et al. , 2003; B rover et al. , 2006 ) , 因此无法证实杂交种的父母本 , 如果
利用细胞器如线粒体、叶绿体编码的基因进行序列分析还可明确杂交中的母本 , 这一推测尚需相关试
验进行验证。
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