全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 4 631 636
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–01–15；修回日期：2010–03–25
基金项目：江苏省科技支撑计划项目（BE2008311）
T洋葱 型细胞质雄性不育相关基因的结构与表
达模式研究
吴海涛1,3，王建军1,2，侯喜林1,2,*，刘洪炯3，马蓉莉3
（1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；2农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，
南京 210095；3山西省农业科学院蔬菜研究所，太原 030031）
摘 要：orfA501 标记与洋葱细胞质雄性不育表型之间的完全符合引起研究者对其所在基因结构的兴
趣。试验通过锚定 PCR 方法获得了 orfA501 的侧翼序列，明确了其在洋葱 T 型细胞质雄性不育线粒体基
因组中的位置；采用 RT-PCR 方法研究了 orfA501 及其相连基因的转录模式。结果表明：洋葱 T 型细胞质
雄性不育线粒体基因组中 orfA501 的 5′ 端与 coxⅠ基因紧密相连，二者相隔 93 个碱基；orfA501 的 3′端
是由 atp9、atp6、atp1 以及 nad4 等基因片段构成的一个复杂序列；在洋葱 T 型细胞质雄性不育系花药中，
orfA501 与 coxⅠ基因分别转录，且 orfA501 对 coxⅠ的转录具有正调控的作用。
关键词：洋葱；细胞质雄性不育；orfA501
中图分类号：S 633.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）04-0631-06

Studies on Structure and Expression Pattern of Chimeric Genes Associated
with Onion T-type Cytoplasmic Male Sterility
WU Hai-tao1,3，WANG Jian-jun1,2，HOU Xi-lin1,2,*，LIU Hong-jiong3，and MA Rong-li3
（1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，
China；2Key Laboratory of Southern Vegetable Crop Genetic Improve，Ministry of Agriculture，Nanjing 210095，China；
3Vegetable Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）
Abstract：The perfect coincidence of orfA501-marker and the phenotype of onion cytoplasmic male
sterile has arose interesting in researchers. In this experiment，flanking sequences of orfA501 in
mitochondrial genome of onion T-type cytoplasmic male sterility was obtained successfully by anchored
PCR，and expression pattern of the chimeric gene was analysed by real time PCR. The result showed that：
It was cytochrome c oxidase subunit I（coxⅠ）gene who flanked 5′ of orfA501，and a complicated
sequence composed by fractions of atp9，atp6，atp1 and nad4 located in the 3′ region of orfA501. Though
there were 93 bases between orfA501 and coxⅠ，they transcripted seperately in the anthors of T-type
cytoplasmic male sterility，and orfA501 seemed to play an up-regulator factor for the transcription of coxⅠ.
Key words：onion；Allium cepa L.；cytoplasmic male sterility；orfA501

植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）是指由于细胞质基因功能异常，使其不

﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hxl@njau. edu. cn）
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能产生正常花粉而导致的败育现象。在人工控制授粉条件下，这种不育系的后代不但能用恢复系恢
复其育性，而且可以用保持系维持其 100%的不育性状，在植物杂交育种中占有非常重要的地位。
细胞质雄性不育在植物界广泛存在（Schnabel & Wise，1998）。目前的研究发现，几乎所有植物细胞
质雄性不育都与线粒体基因的变异有关，其中起主要作用的是由重要基因和未知片段重组而形成的
开放阅读框（Patrick & Roger，1998）。
洋葱是异花授粉植物，每朵小花只产生 6 粒种子，人工控制授粉成本很高，因此对洋葱细胞质
雄性不育的研究非常重要。20 世纪 90 年代以来，Holford 等（1991）、Satoh 等（1993）、Satoh（1998）、
Havey（2000）和 Cho 等（2006）采用 AFLP、RFLP、分子杂交以及 PCR 等方法研究了洋葱细胞质
雄性不育系和保持系线粒体之间的多态性，并开发出了用于鉴别 S-CMS 和可育系的分子标记。但是，
对于 T-CMS 的鉴别需要另一个能区分洋葱不育和可育胞质的分子标记——orfA501 标记，它来源于
细香葱 CMS1 分子标记。研究发现，orfA501 同样存在于洋葱 T-CMS 和 S-CMS 线粒体基因中，保
持系和正常可育系中没有或者以 sublimon 的形式存在（Engelke et al.，2003）。在细香葱 CMS1 线粒
体基因组中，orfA501 的 3′ 端与 atp6 片段连接然后插入到 atp9 基因中形成新的嵌合基因，该嵌合
基因转录成一个 961 nt 的 mRNA。然而在洋葱中，orfA501 两端的序列以及转录方式还不清楚，本
试验对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用洋葱材料 8A 和 8B 是从山西省当地品种‘沙沟红皮’中选育出来的 T 型细胞质雄性不
育系（T-CMS）和保持系，11A和11B是从‘朔州紫皮’品种中选育出的S型细胞质雄性不育系（S-CMS）
和保持系（吴海涛 等，2009），均由山西省农业科学院蔬菜研究所刘洪炯研究员提供。
2008 年 10 月初将种球定植于南京农业大学园艺学院大棚中，11 月底取新抽嫩叶提取线粒体
DNA。用于 RNA 提取的材料定植在山西省农业科学院蔬菜所试验基地，2008 年 11 月初定植种球，
2009 年 5 月 20 日分别取四分体时期、单核花粉粒时期和花粉粒成熟早期的花药，提取细胞总 RNA。
1.2 不同时期花蕾的分级和取样
用于细胞总 RNA 提取的花蕾需要分时期采收。选择外苞发育不同程度的花球，撕开外苞膜，
测量不同大小花蕾的横、纵径，拨取花药，在载玻片上挤压出小孢子，用 0.5%的醋酸洋红染色，光
学显微镜下观察并统计小孢子发育时期。四分体时期的花蕾横、纵径分别为 0.21 ~ 0.23 cm 和 0.25 ~
0.32 cm，游离小孢子时期横、纵径分别为 0.23 ~ 0.27 cm 和 0.31 ~ 0.35 cm，花粉粒成熟早期横、纵
径分别为 0.27 ~ 0.33 cm 和 0.35 ~ 0.39 cm。
1.3 线粒体DNA和细胞总RNA提取
线粒体DNA提取参照Liza和Eric（2007）的方法，取嫩叶 10 g，加入 50 mL缓冲液〔甘露醇 0.4
mol · L-1，EGTA 1 mmol · L-1，MOPS-KOH 25 mmol · L-1（pH 7.2），tricine 10 mmol · L-1，半胱氨酸
8 mmol · L-1，PVP-40 1%，BSA 0.1%；pH 7.8〕；研磨，过滤，1 600 × g离心 10 min；悬浮液 12
000 × g离心 15 ~ 20 min，取沉淀，加入 20 μL 5 mol · L-1的MgCl2，和 2 μL DNase1；4 ℃放置 1 h
后离心，沉淀用约 1 mL的裂解液悬浮（CTAB，蛋白酶 2 μL，2%巯基乙醇），37 ℃温浴 2 h，氯仿
—异戊醇抽提 2 次；无水乙醇沉淀，70%乙醇清洗 2 次；风干。
细胞总 RNA 的提取参照天根生化科技有限公司试剂盒说明进行。
4 期 吴海涛等：洋葱 T 型细胞质雄性不育相关基因的结构与表达模式研究 633
1.4 锚定PCR方法
根据已知片段分别在 5′ 和 3′ 方向设计两个单向巢式引物，第 1 轮单向引物扩增后，回收 PCR
产物并用 TDT 末端转移酶加尾，再用 AAP 引物和巢氏引物进行第 2 轮扩增，产物经 1.5%琼脂糖电
泳后回收测序（陈柏君 等，2004）。
第 1 轮扩增采用 50 μL体系。混合液包含 10 × Buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol · L-1）3 μL，dNTP
（2.5 mmol · L-1 each）4 μL，引物F1（R1）（10 μmol · L-1）1 μL，DNA（1 μg · μL-1）2 μL；混合液
在 94 ℃预变性 7 min后，加入Taq聚合酶 0.5 μL（2.5 U）。扩增条件为：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，
72 ℃ 2 min；30 个循环。
第 2 轮巢氏PCR扩增采用 25 μL体系。包含 10 × Buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol · L-1）2.5 μL，
dNTP（2.5 mmol · L-1each）2 μL，AAP和巢式引物（F2/R2）（10 μmol · L-1）各 1 μL，DNA（1 μg · μL-1）
1 μL，Taq（5 U · μL-1）0.25 μL。扩增条件为：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，
30 个循环；72 ℃ 5 min。
1.5 片段克隆以及实时定量（RT-PCR）
基因克隆参考陈晓峰（2008）的方法。
实时定量采用双标线法，参考 TaKaRa 试剂盒说明。coxⅠ（cytochrome c oxidase subunit I）引
物根据 GenBank 上的保守序列设计，coxⅠ-F：CATCTTCGGTGCCATTGC；coxⅠ-R：GCGTAAGC
ATCTGGATAATC。orfA501 引物根据 DNA 序列设计多对引物并筛选，orfA501-F：TCCGCACCTTGTT
TATCG；orfA501-R：CACTTTGTCCCACCCGAACTCCAAC。内标引物参考 Callum 等（2001）的
文献，Tubulin-F：CCATCTCGTCCATACCTTC，Tubulin-R：ATCCCAGCTATACCGTTCC。
2 结果与分析
2.1 洋葱CMS与细香葱CMS1 orfA501 序列对比
把 8A（T-CMS）和 11A（S-CMS）（吴海涛 等，2009）的 orfA501 标记片段进行克隆测序，发
现它在两个不育系中的大小都为 473 bp，不是一个完整的阅读框。与其它洋葱 CMS（Kim et al.，2009）
以及细香葱 CMS1 中的 orfA501 片段（Engelke & Tatlioglu，2004）进行对比分析，结果如图 1，同
源性分别是 99.6%和 88.5%。
图 1 洋葱 T-CMS 和 S-CMS 与细香葱 CMS1 的 orfA501 序列对比
Fig. 1 Alignment of orfA501 sequences among onion T-CMS，S-CMS and chive CMS1

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2.2 雄性不育相关线粒体基因的扩展
采用锚定 PCR 方法对 8A 中 orfA501 片段
两端序列进行扩展研究，3′ 和 5′ 方向的引物
位置如图 2，在 5′ 和 3′ 端各扩展了 1 056 bp
和 1 169 bp 大小的片段，用 DNAMAN 软件将
3 个片段拼接在一起，分析后发现，这个片段的
完整阅读框应该是 501 bp。但与细香葱 CMS１
不同的是，洋葱 orfA501 片段 5′ 端比细香葱少
一个 28 bp 的重复片段，并与 coxⅠ基因端紧密
相连，中间相隔 93 个碱基；3′ 端是由 atp9、
atp6、atp1 以及 nad4 等基因片段拼接成的一个
复杂序列，这些片段大小从 42 bp 到 144 bp 不
等，片段之间的相隔从 1 个碱基到 622 个碱基
不等。
图 2 orfA501 在洋葱 CMS 和细香葱 CMS1 线粒体基因中的重组
箭头表示锚定 PCR 时的引物位置和方向。
Fig. 2 Sketch of orfA501 chimeric regions in mitochondrial
genomes of onion CMS and chive CMS1
Arrows indicated positions and directions of primers used
in anchored PCR.
2.3 orfA501 和coxⅠ基因的表达
图 2 表明，在洋葱 T-CMS 线粒体基因组中 coxⅠ和 orfA501 基因紧密相连。为了研究它们是否
同时转录，以及两个基因在可育和不育小孢子发育时期的表达特征，我们对 T-CMS 和保持系的这两
个基因分别进行了实时定量分析。
用光学显微镜观察发现，T-CMS 花药在四分体之后小孢子能正常游离，因此选取 T-CMS 和保
持系花药小孢子发育的四分体、单核花粉粒时期和花粉粒成熟早期 3 个时期进行两个基因的实时定
量分析，结果如图 3 所示。
orfA501 在不育系花药的单核花粉粒时期表达量最高，四分体和花粉粒成熟早期表达量较低，在
可育系中不表达或者表达极少。
图 3 orfA501 和 coxⅠ在洋葱 T 型细胞质雄性不育（8A）和保持系（8B）
花粉发育不同时期的相对表达
Fig. 3 Relative expression quantity of orfA501 and coxⅠ in different pollen development stages of
onion T-CMS（8A）and its maintainer（8B）



4 期 吴海涛等：洋葱 T 型细胞质雄性不育相关基因的结构与表达模式研究 635
与 orfA501 不同，在洋葱 T 型细胞质雄性不育系中，coxⅠ在四分体时期表达量较低，单核花粉
粒时期急剧增加，花粉粒成熟早期最高，这一趋势与其保持系中基本一致，但相同时期 coxⅠ在不
育系中的表达量比保持系中的明显高（图 3，coxⅠ）。另外，不育系中 coxⅠ表达的相对含量比 orfA501
高出几千倍。
3 讨论
3.1 洋葱细胞质雄性不育与orfA501 表达
与植物 CMS 有关的基因主要存在于线粒体中，它们大多是由未知片段与线粒体重要基因重组
形成的，从转录水平或翻译后水平破坏该基因的生物功能（Patrick & Roger，1998；Nancy，2006）。
然而 orf在细胞质雄性不育植株中的表达，有的只在特异部位（花药或小孢子），如大豆的 orf239（Abad
et al.，1995；Sarria et al.，1998）；有的在植株的所有部位都有表达，如玉米的 urf13（von Allmen et
al.，1991）。
在洋葱 T 型细胞质雄性不育系中，orfA501 不但在雄性不育植株的花蕾中表达，而且在即将衰
老的叶片中也表达，因此 orfA501 可能跟玉米的 urf13 一样在营养生长和生殖生长阶段都有表达。但
它们并不能直接导致败育，否则其它组织无法正常生长。Flavell（1974）认为在这种类型的雄性不
育植株的花药中存在一种特定时空表达的 X 物质，当这种物质被合成时它与 ORF 相互作用产生毒
素，引起细胞死亡，从而导致雄性不育。
RT-PCR 结果显示，洋葱 T 型细胞质雄性不育系中，orfA501 在单核花粉粒时期的表达量比四分
体和花粉粒成熟早期的要高，这说明单核花粉粒时期是小孢子败育的关键时期，从光学显微镜的观
察也支持这个结果：四分体以后的小孢子能正常游离，但却看不到正常成熟的花粉粒。
3.2 coxⅠ与orfA501 的转录模式
本研究以 orfA501 为中心向两端扩展的结果发现，orfA501 5′端与 coxⅠ相连，这与 Kim 等（2009）
采用反向 PCR 对 S-CMS 线粒体基因组扩增的结果相同。不同的是，Kim 等（2009）认为 coxⅠ与
orfA501 共转录，但本研究 RT-PCR 的结果并不支持这种转录模式，因为如果二者同时转录，orfA501
和 coxⅠ的转录水平应该大致相同，事实上二者相对含量相差几千倍，不可能同时转录。结合早期
的研究者（Satoh et al.，1993）用 Northern 杂交分析无法区别可育系和 T-CMS 的结果，我们认为洋
葱 T-CMS 与 S-CMS 的不育机制可能不同，T-CMS 中 orfA501 与 coxⅠ分别转录。
3.3 orfA501 对coxⅠ转录的影响
在一些植物细胞质雄性不育系的线粒体基因组中，orf 与线粒体正常基因重组形成一个新的开放
阅读框。几乎所有的研究者都认为这种嵌合基因总是一起转录，因此只关注 Rf 基因对 CMS 相关嵌
合基因转录本的影响，忽略了其中的 orf对与它相连的线粒体基因在转录水平的影响。本试验RT-PCR
结果表明，在单核花粉粒时期和花粉粒成熟早期，coxⅠ在不育系中的表达量比在保持系中高出近一
倍，可能是 orfA501 对 coxⅠ的转录起到了正调控的作用。


References
Abad A R，Mehrtens B J，Mackenzie S A. 1995. Specific expression in reproductive tissues and fate of a mitochondrial sterility–associated protein
in cytoplasmic male-sterile bean. Plant Cell，7：271–285.

636 园 艺 学 报 37 卷
Callum J M，Leite D，Pither-Joyce M，Havey M J. 2001. Expressed sequence markers for genetic analysis of bulb onion（Allium cepa L.）. Theor
Appl Genet，103：979–991.
Chen Bai-jun，Sun Chao，Wang Yong，Hu Yuan-lei，Lin Zhong-ping. 2004. Anchored-PCR：A new method of genome walking. Chinese Science
Bulletin，49 (15)：1569–1571. (in Chinese)
陈柏君，孙 超，王 勇，胡鸢雷，林忠平. 2004. 锚定 PCR（Anchored PCR）：一种新的染色体步行方法. 科学通报，49 (15)：1569–1571.
Chen Xiao-feng. 2008. Molecular characterization of antifungal genes in Brassica campestris ssp. chinensis [Ph. D. Dissertation]. Nanjing：Nanjing
Agricultural University. (in Chinese)
陈晓峰. 2008. 不结球白菜抗真菌病基因的克隆与表达分析[博士论文]. 南京：南京农业大学.
Cho Kwang-soo，Yang Tae-jin，Hong Su-young. 2006. Determination of cytoplasmic male sterile factors in onion plants（Allium cepa L.）using
PCR-RFLP and SNP markers. Mol Cells，21 (3)：411–417.
Engelke T，Terefe D，Tatlioglu T. 2003. A PCR-based marker system monitoring CMS-(S)，CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion（Allium cepa
L.）. Theor Appl Genet，107：162–167.
Engelke T，Tatlioglu T. 2004. The fertility restorer genes X and T alter the transcripts of a novel mitochondrial gene implicated in CMS1 in chives
（Allium schoenoprasum L.）. Mol Gen Genomics，271：150–160.
Flavell R. 1974. A model for the mechanism of cytoplasmic male sterility in plants，with special reference to maize. Plant Sci Lett，3：259–263.
Havey M J. 2000. Diversity among male-sterility-inducing and male-sterile cytoplasms of onion. Theor Appl Genet，101：778–782.
Holford P，Croft J，Newbury H J. 1991. Differences between，and possible origins of the cytoplasms found in fertile and male-sterile onions（Allium
cepa L.）. Theor Appl Genet，82：737–744.
Kim Sunggil，Lee Eul-Tai，Cho Dong Youn，Han Taeho，Bang Haejeen，Patil Bhimanagouda S，Ahn Yul Kyun，Yoon Moo-kyoung. 2009.
Identification of a novel chimeric gene，orf725，and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm
types in onion（Allium cepa L.）. Theor Appl Genet，118：433–441.
Liza A P，Eric A S. 2007. Mitochondria. Beijing：Science Press：66–87.
Nancy A Eckardt. 2006. Cytoplasmic male sterility and fertility restoration. The Plant Cell，18：515–517.
Patrick S，Roger P. 1998. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration. Trends in Plant Science，3 (5)：175–181.
Satoh Y，Nagai M，Mikami T，Kinoshita T. 1993. The use of mitochondrial DNA polymorphism in the classification of individual plants by
cytoplasmic genotypes. Theor Appl Genet，86：345–348.
Satoh Y. 1998. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion（Allium cepa L.）.
Theor Appl Genet，96：367–370.
Schnable P S，Wise R P. 1998. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration. Trends in Plant Science，3：175–180.
von Allmen J M，Rottmann W H，Gengenbach B G，Harvey A J，Lonsdale D M. 1991. Transfer of methomyl and hmt-toxin sensitivity from
T-cytoplasm maize to tobacco. Mol Gen Genet，229：405–412.
Wu Hai-tao，Wang Jian-jun，Hou Xi-lin，Liu Hong-jiong，Ma Rong-li，Ma Jing-fan. 2009. Identification and analysis of cytoplasmic male sterility
in onion（Allium cepa L.）origin from Chinese cultivars. Acta Horticulturae Sinica，36 (5)：723–726. (in Chinese)
吴海涛，王建军，侯喜林，刘洪炯，马蓉莉，马景蕃. 2009. 两个洋葱雄性不育系细胞质类型鉴定及分析. 园艺学报，36 (5)：723–726.