全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（3）：413–420
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–11–12；修回日期：2010–02–02
基金项目：国家‘973’项目(2009CB119000)；国家自然科学基金项目(30800751)；国家博士后科学基金项目(20070421090)
* 通信作者 Author for correspondence (E-mail: qhshi@sdau.edu.cn)
黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因 CuPPase 的 cDNA 克
隆、序列分析与表达
洪艳艳 1，史庆华 1,2,*，王秀峰 1,2，窦宏伟 3，王双双 1， 刘泽洲 1
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院, 山东泰安 271018；2 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018；3 山东农
业大学林学院, 山东泰安 271018）
摘 要：利用 GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用 RT-PCR 和
RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜 H+-PPase 基因，命名为 CuPPase，GenBank 注册号为
GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高，分别为 94%，92%。生物信息学分析表明，该基因
全长 2 650 bp，开放阅读框（ORF）2 307 bp，编码 768 个氨基酸；CuPPase 蛋白大小约 80 kD，理论 pI
值为 5.32。该基因有 14 个强的跨膜螺旋结构，PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长
素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明，CuPPase 在叶
和根中表达较高，茎中表达较低。CuPPas 表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导，但与处理时间有密切
关系，其表达均表现先升高后降低的趋势。
关键词：黄瓜；cDNA 克隆；序列分析；表达
中图分类号：S 642.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0413-08

Cloning，Characterization and Expression of a H+-PPase Gene CuPPase
from Cucumis sativus L.
HONG Yan-yan1，SHI Qing-hua1,2,*，WANG Xiu-Feng1,2，DOU Hong-wei3，WANG Shuang-shuang1，
and LIU Ze-zhou1
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018， China；
2State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an，Shandong 271018，China；3College of Forestry，Shandong Agricultural
University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract: Using PCR degenerate primers designed based on the conserved amino acid sequences of
known tonoplast H+-PPase to amplify cDNA fragments from cucumber by RT-PCR and RACE-PCR, a
H+-PPase gene named CuPPase was cloned. The CuPPase protein showed 94%, 92% similarity to the
H+-PPases from Cucurbita moschata and Vigna radiata. Bioinformatics analysis indicated that the
full-length cDNA sequence was 2 650 bp, which contained an open reading frame of 2 307 bp and encoded
a protein of 768 amino acid residues with a calculated molecular weight of 80 kD and isoelectric point of
5.32. There was fourteen strong inside to outside transmembrane helix. PlantCare analysis indicated that
there were abscisic acid, somatotropic hormone, salicylic acid cis-acting responsive elements and gibberellin
and low temperature，drought wound-responsive elements in the protein encoded by CuPPase. The result

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of RT-PCR analysis indicated that CuPPase expressions were different in roots，stems and leaves，and
richer in leaves and roots, poorer in stems. The expression of CuPPase is induced by salt stress and low or
high temperature stress, but is closely related to the processing time. Its expression trend increased firstly
and then decreased.
Key words：cucumber；cDNA cloning；sequence analysis；expression

随着黄瓜栽培面积尤其是设施栽培面积的不断扩大，盐害和温度胁迫已成为限制黄瓜生产的重
要障碍因子(段九菊 等，2006；王永健 等，2001)。液泡膜是植物应对逆境反应最为重要的膜系统
之一，而定位于其中的 H+-ATPase 和 H+-PPase 几乎与植物所有的抗性都有密切关系。H+-ATPase 是
由多个亚基组成，是多基因编码的酶,其调控较为复杂，而液泡膜 H+-PPase 是由单基因编码(Maeshim，
2000)，通过分子生物学的手段进行操作以及通过外源物质诱导较为简单，容易达到理想的效果。大
量研究表明，液泡膜 H+-PPase 可以被盐害、干旱、低温、缺氧等胁迫诱导(Carystinos et al.，1995；
Darkey et al.，1995；Fukuda et al.，2004)。Park 等（2005）研究表明，过量表达液泡膜 H+-PPase 显
著增加了番茄植株中离子向液泡膜的转运，增加了干旱胁迫下根系的生物量，显著提高了番茄的抗
旱性。在拟南芥和酵母中液泡膜H+-PPase的过量表达显著提高了其耐盐性(Gaxiola et al.，1999，2001；
Guo et al.，2006)。在低温、缺氧等胁迫下会导致乳酸积累而使细胞质酸化(Roberts et al., 1984)，细
胞质 pH 的降低会通过诱导乙醇发酵的发生，从而抑制 pH 的降低(Rivoal et al.，1991)。在此情况下，
氧化磷酸化就会受到抑制，使 ATP 含量急剧下降，即使 V-H+-ATPase 保持较高的活性，也会由于底
物不足使其质子泵的功能下降。与 ATP 相比，PPi 含量稳定，不因光照条件的改变或呼吸速率的改
变而改变，甚至组织置于缺氧或其它逆境条件下，PPi 含量也保持恒定(Rea et al.，1993)。因此，通
过遗传操作提高液泡膜 H+-PPase 活性对提高植物对逆境胁迫具有非常重要的意义，本试验中克隆出
一条黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因，并对其进行了生物信息学和表达分析，为其在黄瓜遗传改良中的应
用奠定了基础。
6B1 材料与方法
9B1.1 材料与处理
供试黄瓜品种为‘新泰密刺’，克隆受体大肠杆菌菌株为 DH5α。选取生长势一致的幼苗用于基
因表达研究，NaCl 处理为将幼苗转移到 100 mmol · L-1 NaCl 处理液中，高温、低温处理分别为将幼
苗转移到 40 ℃和 4 ℃光照培养箱中处理 0、1、6、12、24 h，处理后取叶片，液氮速冻，−70 ℃保
存备用。
1.2 RNA的提取和cDNA第一链合成
所有植物材料 RNA 采用 TRIzol Reagent（Invitrigen 公司）法提取总 RNA。参照 MBI 公司反转
录试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。
1.3 黄瓜液泡膜H+-PPase基因的克隆
参照 GenBank 登录的植物液泡膜 H+-PPase 的核苷酸保守区序列，设计一对简并引物 P1、P2（表
1，上海生物工程公司合成），以反转录产物为模板进行中间片段扩增：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s， 55
℃ 45 s，72 ℃ 60 s, 共 30 个循环；72 ℃延伸 10 min。反应产物从 1%琼脂糖凝胶上回收后, 克隆
入 pMD-18T 载体, 转化大肠杆菌 DH5α, 提取质粒鉴定后由上海博亚生物技术有限公司测序。
3 期 洪艳艳等：黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因 CuPPase 的 cDNA 克隆、序列分析与表达 415

表 1 引物序列及预期片段大小
Table 1 Sequence of primers and preproduction length
编号
Code
序列
Sequence(5′→3′)
预期片段大小/bp
Predicted size of amp lified product
P1
P2
GCTGA(C/T)AA(C/T)GTGGGTGACAATG
GGC(A/T/G)GAGAACCAGTA(A/T/C)GGAAGC
1 000
P3
P4
TGGAAGCAAGAAAAGGTGTTGG
CAGATCCCATACCGGCAATA
400
P5
P6
TGTTAGCCGTGCTGGTGTTGT
TGGCTTGATCGTTGGTGCTATGC
1 000

P7
P8
ATG(G/A)G(C/T/A)G(C/T)(T/G/A)(G/A)C(G/C)ATTCT(T/G/C)CCAGATC
ACTTTACCCACAAGGTCGGCAC
700
P10
P11
ATGGGA(C/T )GCGGCGATTCTGC
GCCTGTTCTCAATTGGGAAAAAGAG
2 600
ActinF
ActinR
AACGACCTTAATCTTCATGCTGCT
GGTCGTGACCTTACTGATGCTCTC
400

因为中间片段距 5′ 端太远，所以根据所得的中间片段，设计特异引物 P4 和兼并引物 P3，向上
游再扩增一个片段，反应程序同上。根据测序结果，设计特异引物 P5、P6 和 B26 进行巢式 PCR 扩
增 3′ 端，反应参数为: 第 1 轮 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s, 共 25 个循环；最后
72 ℃延伸 10 min。第 2 轮 PCR 以第 1 轮产物稀释 20 倍后取 1 μL 为模板，94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，
57 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s, 共 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物进行序列测定。根据所获得
该基因的中间片段和 3′ 端序列，设计特异引物 P8、P9 和兼并引物 P7 进行 PCR，扩增得到该基因
的 5′ 端序列，反应程序同上。反应产物进行序列测定。然后根据所得的拼接序列在起始密码子和终
止密码子附近设计特异上游引物 P10，下游引物 P11、P12 进行扩 PCR 增，得到黄瓜 H+-PPase 基因
编码区全长序列。测序结果用 Blast 软件和 DNAMAN 软件进行序列比较分析。
1.4 生物信息学分析
用DNAStar 的EditSeq 程序分析克隆基因序列，用ORF Finder ( http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)
寻找最大的开放阅读框（open reading frame）；在 NCBI 网站（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）对
核苷酸序列进行 BLASTn 和 BLASTp 分析,以推断 ORF 的正确性。理化性质分析用 ExPASy 的
ProtParam Tool 软件；顺式作用元件用 PlantCare 在线分析; 跨膜结构分析用 TMp red Server 软件。
1.5 RT-PCR表达分析
根据已获得基因全长设计引物，扩增 400 bp 左右的基因片段, 并以黄瓜看家基因 actin (GenBank
登录号：DQ115883) 设计内参引物，作为内参。PCR 反应的扩增条件为 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 50 s, 53 ℃
45 s, 72 ℃ 1 min, 28 个循环。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
2 结果与分析
2.1 黄瓜叶片总RNA的提取
黄瓜的总 RNA 经电泳检测呈现出 3 条清
晰可区分的条带(图 1) , 表明 RNA 未降解。经
紫外分光光度计检测, RNA样品A260 /A280的
比值介于1.8 ~ 2.0之间, 据此认为RNA中蛋白
质或者其他有机物的污染可以忽略。因此, 可 图 1 黄瓜叶片总 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果 Fig. 1 Result of agarose gel electrophoresis of total RNA
extracted from cucumber leaf
416 园 艺 学 报 37 卷
图 2 黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因 PCR 扩增
1：中间片段 1；2：中间片段 2；3：3′ 端 cDNA 片段；4：5′ 端编码区片段；5：全长 cDNA 片段；M：DL 2000 DNA marker。
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for the cloning of vacuole membrane H+-PPase from cucumber
1：Middle fragment 1；2：Middle fragment 2；3：3′ fragment；4：5′ encoding cDNA fragment；5：Full length fragment；
M：DL 2000 DNA marker.
以选取这些 RNA 样品作为反转录模板。
2.2 黄瓜液泡膜H+-PPase基因全长的克隆
利用简并引物扩增得到一条大小约为 1 000 bp 的中间片段 1（图 2）, 通过 BLAST 比对分析表
明, 该片段与多种植物的 H+-PPase 基因有较高的同源性，再设计引物扩增一条约 360 bp 的中间片段
2，进而通过 RACE-PCR 技术分别获得约 1 000 bp 的 3′ 端和 730 bp 的 5′ 端编码区序列。
为确保该 3′ 端和 5′ 端为同一基因的两段序列, 在拼接序列起始密码子和终止密码子附近设计
一对特异引物，PCR 扩增获得约 2 500 bp 的目的条带，测序结果与拼接的编码区序列结果完全吻合。
将该基因命名为 CuPPase，GenBank 注册号为 GQ223786。该 cDNA 推导编码 768 个氨基酸（图 3）。
2.3 CuPPase基因的生物信息学分析
通过序列比对，在氨基酸水平上，CuPPase 与已知南瓜（BAA33149），绿豆（BAA23649）的
同源性较高，分别为 94%和 92%（图 4）。
CuPPase 全长 2 650 bp, 含有 2 307 bp 的完整开放阅读框, 编码 768 个氨基酸。CuPPase 编码的
蛋白质分子量为 80 659.7D，理论 pI 值为 5.32, 分子式为 C3688H5782N904O1057S30。
用 TMpred 软件预测: 该基因编码的蛋白有 14 个强的跨膜螺旋结构（大于 500 为有意义的跨膜
区）（图 5）。
用 PlantCare 分析基因序列的转录调控元件, 结果显示该基因序列正链和反链上具有脱落酸诱
导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温、干旱等伤害诱导等顺式作用元件。
2.4 黄瓜液泡膜H+-PPase酶基因的组织表达分析
2.4.1 在不同器官中表达
如图 6 所示，正常生长条件下，CuPPase 在叶片和根中表达量较高，茎中较低。这说明在未受
胁迫的情况下不同组织中的 CuPPase 均有一定的基础表达水平，且其表达具有组织特异性。
2.4.2 NaCl 处理对黄瓜叶片 CuPPase 基因表达的影响
100 mmol · L-1 NaCl 处理 1 h 内，叶片中 CuPPase 基因表达量很低，随着处理时间延长，表达
水平逐渐增强，当 NaCl 处理 6 h 后达到最高，之后下降，这说明 NaCl 可以诱导 CuPPase 基因的表
达，这种诱导表达与处理时间有密切关系（图 7）。
2.4.3 高温和低温处理对叶片 CuPPase 基因表达的影响
3 期 洪艳艳等：黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因 CuPPase 的 cDNA 克隆、序列分析与表达 417

图 3 CuPPase 基因全长核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
DNA 序列从起始密码子开始，包括编码区和 3′ 非编码区。终止密码子（TAA）用星号表示。
Fig. 3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the CuPPase cDNA
The DNA sequence starts from the start codon and includes the putative coding region and the 3′ noncoding regions.
Stop codon (TAA) is marked with asterisk.
如图 8 所示，4 ℃低温处理 1 h 表达量上升且表达量最高，6 h、12 h 开始下降但比 0 h 高，24 h
表达量很低，40 ℃高温处理 1 h 表达量上升，6 h 开始表达量开始下降，说明高低温在处理前期也能
诱导 CuPPase 基因的表达。
418 园 艺 学 报 37 卷
图 4 CuPPase 与其他植物的同源性比对
图中的蛋白质序列在 GenBank 中的号：黄瓜 CuPPase(GQ223786), 绿豆 VsPPase（BAA23649），
南瓜 CPPase(BAA33149), 白杨 PsPPase(XP002331062)。
Fig. 4 Alignment of the deduced CuPPase protein and PPases from other plants
The protein sequences shown in these diagrams are listed in the GenBank database under the following accession numbers：CuPPase
(GQ223786)，VsPPase（BAA23649），CPPase (BAA33149)，PsPPase(XP002331062).
3 讨论
3 期 洪艳艳等：黄瓜液泡膜 H+-PPase 基因 CuPPase 的 cDNA 克隆、序列分析与表达 419

图 5 CuPPase 跨膜结构预测
Fig. 5 Transmembrane region prediction of CuPPase
图 7 NaCl 100 mmol · L-1 胁迫下 H+-PPase 基因在
黄瓜叶片中的表达
Fig. 7 Expression of H+-PPase gene in cucumber leaf under
100 mmol· L-1 NaCl stress
图 8 低温（4 ℃）和高温（40 ℃）胁迫下 CuPPase 基因在黄瓜叶片中的表达
Fig. 8 Expression of CuPPase gene in cucumber leaf under 4 ℃ and 40 ℃ stress
3 讨论
利用 RT-PCR 和 RACE-PCR 方法从黄瓜克隆得到 CuPPase 基因，采用多种生物信息学方法对
CuPPase 进行分析，其 cDNA 全长 2 650 bp，ORF 为 2 307 bp，编码 768 个氨基酸的多肽，分子量
约为 80 kD。同源序列比较发现，黄瓜的 CuPPase 基因的序列与南瓜、烟草、绿豆、白杨的液泡膜
H+-PPase 基因的序列高度同源，因此推断获得的全长 cDNA 编码的产物是黄瓜液泡膜 H+-PPase。
作为一种跨膜蛋白，其功能的发挥与其跨膜结构密切相关，TMpred 软件分析表明，黄瓜 CuPPase
编码的蛋白存在 14 个跨膜区域，这与绿豆液泡膜是一致的（Maeshima, 2000）。
利用 PlantCare 软件分析发现该基因序列正链和反链上具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱
图 6 RT-PCR 检测 CuPPase 基因在黄瓜不同
组织中的表达
Fig. 6 Expression of CuPPase gene in different tissues
of cucumber by RT-PCR
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导、水杨酸诱导、低温、干旱等伤害诱导等顺式作用元件。研究表明， H+-PPase 可以被盐、干旱、
低温、缺氧等胁迫以及脱落酸和生长素诱导（Carystinos et al.,1995；Darkey et al.,1995；Fukuda et al.，
2004，Fukuda & Tanaka, 2006）。因此，这些顺式作用元件的存在可能在黄瓜对逆境胁迫响应中发挥
重要作用。
正常生长条件下，CuPPase 在黄瓜幼苗叶片和根系中表达量较高，而茎中较低，说明其有一定
的基础表达水平，且具有组织特异性，这种特异性可能与不同组织的老化程度有关。一般情况下幼
嫩组织表现出较高的 H+-PPase 活性（Maeshima, 2000），相对而言黄瓜幼苗的叶和根属于比茎幼嫩的
组织。本试验中，NaCl 以及高、低温胁迫在较短时间范围内都诱导了黄瓜叶片 CuPPase 的表达，
表明它对逆境胁迫能够做出积极的反应，在黄瓜适应逆境中发挥重要的作用，此结果为利用该基因
创造适应能力强的黄瓜种质资源提供了一定的理论依据。

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