全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（9）：1693–1698 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–06–28；修回日期：2011–08–31
基金项目：国家自然科学基金项目（30972014）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xhchen@yzu.edu.cn）
黄瓜 3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克
隆及其涝胁迫响应分析
齐晓花，许学文，罗晶晶，高海洁，徐 强，林肖剑，朱碧云，陈学好*
（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009）
摘 要：以黄瓜耐涝品系‘早二 N’根组织总 RNA 为模板，运用 RT-PCR 结合 RACE 技术，获得了
黄瓜 3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的 cDNA 全长序列，基因编码区共 1 011 bp，编码 336 个
氨基酸（GenBank 登录号 HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH 基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子
叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在 88%以上，与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达 86.8%
和 86%。qRT-PCR 表达分析结果表明：CsGAPDH 基因快速响应涝胁迫，在涝胁迫 2 h，该基因在根中表
达量达到对照水平的 12 倍，在涝胁迫 12 h 达到表达高峰，随后表达量呈现逐渐下降趋势；CsGAPDH 基
因在‘早二 N’的根、茎、叶中均有表达，根和叶中原始表达量高于茎，在涝胁迫 4 h 后均诱导表达，根
中诱导表达量上调幅度最大，为初始表达量的 4 倍。CsGAPDH 属于黄瓜涝胁迫响应基因，在缓解涝胁迫
伤害过程中可能具有重要的调控作用。
关键词：黄瓜；涝胁迫；CsGAPDH 基因；诱导表达
中图分类号：S 642.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）09-1693-06

Cloning，Characterization and Expression of CsGAPDH，A Waterlogging
Responsive Gene in Cucumber
QI Xiao-hua，XU Xue-wen，LUO Jing-jing，GAO Hai-jie，XU Qiang，LIN Xiao-jian，ZHU Bi-yun，
and CHEN Xue-hao*
（College of Horticulture and Plant Protection of Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）
Abstract：Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene（GAPDH）was cloned from root tissues
of cucumber（Cucumis sativus L.）line‘Zaoer N’with high waterlogging tolerance，based on reverse
transcription polymerase chain amplification（RT-PCR）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）
methods. CsGAPDH gene contained an open reading frame（1 011 bp）and encoded a protein of 336 amino
acids. Phylogenetic analysis of CsGAPDH gene showed high conserved character of GAPDH gene among
different crops. CsGAPDH showed the highest homology with dicotyledonous plants such as carrot，grape
and soybean，and the similarity were more than 88%. For monocot crops rice and maize，the similarities of
GAPDH gene were 86.8% and 86%，respectively. The time course expressions of CsGAPDH gene in root
of‘Zaoer N’under waterlogging treatment were determined by quantitative RT-PCR. CsGAPDH gene was

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significantly induced at 2 h after waterlogging treatment，and the peak level of gene expression was at 12 h.
The tissue specific expression of CsGAPDH indicated that the expression level of CsGAPDH gene in root
and leaf was higher than that in stem of the control plant；However，the transcription level of CsGAPDH
gene were significantly up-regulated at 4 h after waterlogging treatment，which were higher in root than
that in leaf and stem. In summary，the CsGAPDH gene was involved in waterlogging response in
cucumber，and might play an important role in releasing waterlogging stress.
Key words：cucumber；waterlogging stress；CsGAPDH；induced expression

黄瓜（Cucumis sativus L.）起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，具有喜湿不耐涝的特性。
由于其根系入土浅，吸收力弱，再生能力差且通气组织不发达，所以极易受到水淹危害。高等植物
对涝胁迫的响应是多方面的，生理生化方面主要表现在气孔关闭，蒸腾作用降低，叶片萎蔫；不耐
涝植物的光合速率迅速下降，叶绿素含量下降，叶片早衰和脱落（Ashraf & Habib-ur-Rehman，1999）；
乙烯释放量增加；钙离子沉淀颗粒明显增多，质膜及其他膜结构的钙离子 ATP 酶活性明显降低（李
阳生和王建波，2001；Shiono et al.，2008）。除了生理生化和形态学上的变化外，植物在受到涝胁
迫时，同时诱导一系列与涝胁迫及涝胁迫导致的低氧胁迫相关的特异基因的表达（Perata &
Voesenek，2007）。
涝胁迫直接导致植物根系周围氧气的缺乏，因此植株启动无氧呼吸的能力与其耐涝性密切相
关。在厌氧环境下，糖酵解和乙醇发酵途径是植物体能量的主要来源，参与该生物途径的一系列酶
类在厌氧胁迫条件下起到了重要的调控作用（Umeda & Uchimiya 1994；Sachs et al.，1996；Perata &
Voesenek，2007）。
GAPDH 基因在糖酵解过程中参与第一个 ATP 的形成，催化 3–磷酸甘油醛转变为 1,3–二磷酸
甘油醛，同时产生 NADPH，从而使植物体维持较高的能荷水平而正常生长（梁颖和李玉花，2009）。
水分胁迫带来的低氧胁迫对 GAPDH 基因表达模式的影响在耐涝作物水稻中有比较深入的研究
（Pillai et al.，2002）。但是在黄瓜应对涝胁迫过程中是否也受到该类基因的调控，其时空表达模式
是否与水稻相似，尚待探明。
为阐明黄瓜应对涝害的分子调控机制，本研究中以耐涝黄瓜品系‘早二 N’为材料，首次克隆
了黄瓜 GAPDH（CsGAPDH）基因，并对该基因在涝胁迫过程中的动态变化及在不同组织中表达特
异性进行了分析。
1 材料与方法
1.1 植物材料及处理
供试材料华南型黄瓜品系‘早二 N’是从前期耐涝种质资源筛选中获得的强耐涝材料（齐晓花
等，2011）。2010 年 10 月 20 日在扬州大学园艺与植物保护学院实验农场的温室中采用穴盘育苗。
在植株三叶一心期置于混凝土水池中进行模拟涝害胁迫处理，水位保持在高出基质表面 3 cm，同时
设正常管理植株为对照。
在涝胁迫处理 0、2、4、8、12、24 和 48 h 分别取处理组和对照组的根系，同时在处理 4 h 取
茎和叶片组织，迅速置于液氮中，–80 ℃保存，用于基因克隆和表达验证分析。
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1.2 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成
RNA 抽提试剂为天根生化公司生产的 DP407-02 提取剂。按照操作说明进行黄瓜组织的 RNA
提取，然后采用 Rneasy Mini Kit（Qiagene）对总 RNA 进行纯化后质检。在 0.2 mL PCR 管中加入以
下试剂：3 μL 样品总 RNA（对照反应使用 1 μg 的 control RNA）、1 μL SMART IV oligo nucleotide
和 1 μL CDS III/3′ PCR primer；混合以上各组分并稍离心；72 ℃温浴 2 min 后稍离心；然后向离心
管中加入 2.0 μL 5 × first-strand buffer、1.0 μL DTT（20 mmol · L-1）、1.0 μL dNTP Mix（10 mmol · L-1）、
1.0 μL powerscript reverse transcriptase，混匀以上各组分并稍稍离心；42 ℃的条件下空气浴 1 h；将
反应管置于冰上终止 cDNA 一链反应。
1.3 CsGAPDH 全长基因克隆
根据 GenBank 中已公布的其它物种 GAPDH 基因的保守序列设计 3′端引物 CUSP1 和 CUSP2，
5′端引物 CUSP3 和 CUSP4。以‘早二 N’根组织 cDNA 为模板，参考 TaKaRa 的 3′-Full RACE Core
Set Ver 2.0 和 5′-Full RACE Core Set Ver 2.0 试剂盒进行 CsGAPDH 基因的 RACE 扩增。
PCR 产物经回收、纯化，与 pMD18-T Vector 连接，转化 DH5α 感受态细胞，蓝白斑筛选后送
TaKaRa 生物工程公司测序。利用 DNAMAN 5.2.2 软件拼接 3′RACE 和 5′RACE 扩增序列，获得黄瓜
CsGAPDH 基因 cDNA 全长序列。
1.4 荧光定量 PCR
根据已经克隆出的 CsGAPDH 基因序列，利用 Primer 5.0 软件设计一对荧光定量表达引物 qCU F
和 qCU R（表 1），以 Actin 基因为内参基因，具体操作步骤参考 SYBR Premix Ex TaqTM kit（TaKaRa）
试剂盒进行。

表 1 基因克隆和 qRT-PCR 表达引物序列
Table 1 Primer sequence used in gene cloning and qRT-PC
2 结果与分析
2.1 CsGAPDH 基因全长 cDNA 克隆
以黄瓜‘早二 N’的根系 cDNA 为模板，用 CUSP1 和 CUSP2 为 outer 和 inner 引物，与试剂盒
提供的 3′ 引物进行 PCR 扩增，获得 CsGAPDH 基因的 3′ 端序列，经测序该核苷酸序列大小为 582 bp，
含有 12 个 A 组成的 Poly A 尾巴。
根据 3′端序列设计 CUSP3 和 CUSP4 为 5′ 末端的 RACE 引物，经 PCR 扩增，获得一条 1 091 bp
的片段。
对 3′ 和 5′ 序列进行拼接，获得黄瓜 CsGAPDH 基因全长序列。该基因全长 1 366 bp，CDS 区域
为 1 011 bp。
2.2 CsGAPDH 基因序列分析
利用 DNAMAN 5.2.2 软件对 CsGAPDH 基因进行序列分析发现，该基因含有一个编码 336 个氨
引物 Primer 序列（5′→3′） Sequence 引物 Primer 序列（5′→3′） Sequence
CUSP1 GTTCACGCAATGACTGCCACA qCU F TCACGGTCACTGGAAGCA
CUSP2 TGTCTTTCCGTGTTCCTACC qCU R ATGGGATCTCGTCTGGATTT
CUSP3 AATAACTTGCGGCTTGAAAA Actin F TGGACTCTGGTGATGGTGTTA
CUSP4 GAGGCAATGTGGACAATCAAGT Actin R CAATGAGGGATGGCTGGAAAA
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基酸的完整阅读框，包括起始密码子和终止密码子。
将该 cDNA 序列在 NCBI 网站中进行同源性 BLAST 比对，发现其与其它物种的 3–磷酸甘油醛
脱氢酶基因具有较高的相似性，与双子叶植物胡萝卜（AY491512.2）、葡萄（XM002263109.1）和大
豆（DQ192668.1）等同源基因的相似性均在 88%以上，与单子叶植物玉米（EU963991.1）和水稻
（GQ848049.1）的同源基因相似性稍低，分别为 86%和 86.8%（图 1）。

图 1 黄瓜 CsGAPDH 核苷酸序列系统进化分析
采用邻接法，分支上的数值表示支持率（%）。
Fig. 1 Phylogenetic analysis of CsGAPDH gene based on neighbor-joining method
The bootstrap values（%）were indicated in the branch.

2.3 CsGAPDH 在涝胁迫条件下的表达变化
为了研究 CsGAPDH 是否为涝害诱导表达基因，在涝胁迫不同时期对‘早二 N’的根组织中该
基因的表达水平进行了分析。
结果显示：涝胁迫 2 h，CsGAPDH 基因的表达量迅速上升，达到对照水平的 12 倍，而后总体
维持在较高的表达水平，涝胁迫 12 h 时该基因的表达达到最高值，并与其它时间点的表达差异达到
显著水平，随后表达量呈现逐渐下降趋势（图 2）。这表明 CsGAPDH 基因表达与黄瓜对涝害胁迫的
响应之间存在紧密联系。
为了研究 CsGAPDH 基因的表达是否存在组织特异性，在涝胁迫 4 h 时对根、茎和叶片组织中
该基因的表达水平进行了比较。
结果显示：CsGAPDH 基因在根和叶中表达量显著高于茎。涝胁迫处理下，该基因在根中被强
诱导表达，达到初始表达量的 4 倍；在茎和叶中的表达量虽有所上升，但上升幅度较低（图 2）。该
结果表明，黄瓜受到涝胁迫危害时，根系作为最直接受害组织，CsGAPDH 基因在其中快速响应并
且高表达。
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图 2 ‘早二 N’品系 CsGAPDH 基因在涝胁迫下的表达变化
采用 Tukey 法分别对涝胁迫处理后不同时间点基因表达进行显著性分析，
不同大写字母表示达到 0.01 显著水平。
Fig. 2 The gene expression pattern of CsGAPDH in‘Zaoer N’under waterlogging treatment
Different uppercase letters indicate significance at 0.01 levels.
3 讨论
目前，模式植物水稻的耐涝抗性调控机理研究已经有了很大进展（Perata & Voesenek，2007），
涝胁迫及其引起的低氧胁迫对相关特异基因表达模式的影响在不耐涝的玉米和拟南芥中已有比较深
入的研究。不耐涝作物在受到涝胁迫时上调表达许多与涝胁迫抗性相关的基因，主要包括糖酵解和
乙醇发酵途径中的酶类基因（Andrews et al.，1994）。玉米幼苗的初生根在厌氧胁迫 2 h 内，立即抑
制有氧蛋白合成并且选择性合成细胞质甘油醛三磷酸脱氢酶（GapC）厌氧诱导肽（Sachs et al.，1980）。
拟南芥的 GapC 水平在厌氧胁迫 2 ~ 4 h 增加了 5 ~ 10 倍，这与本研究结论相吻合。在本试验中，涝
胁迫诱导 CsGAPDH 基因表达水平在胁迫后 2 h 达到对照水平的 12 倍，并持续保持在较高水平，在
12 h 达到表达高峰，这表明在涝胁迫下黄瓜根系中的 CsGAPDH 基因被迅速诱导表达，催化 3–磷
酸甘油醛转变为 1,3–二磷酸甘油醛，同时产生 NADPH，为植株生长提供更多的能量。CsGAPDH
基因在根、茎和叶片中均有表达，当受到涝胁迫后，该基因在根中被强诱导表达，表达量上升幅度
显著高于茎和叶中的增加幅度。这表明黄瓜根细胞是响应涝胁迫的主要组织，在缓解厌氧胁迫引起
的能量匮乏过程中起关键作用。前期的研究显示在涝胁迫条件下，黄瓜叶片中的可溶性总糖含量在
初期呈上升趋势（未发表数据），本研究中茎和叶 CsGAPDH 基因也明显诱导表达，说明涝胁迫使得
茎叶中糖酵解途径增强，糖代谢能力在短时间内得到加强，从而使植物体维持较高的能荷水平而正
常生长。
对部分双子叶植物和单子叶植物的 GAPDH 基因进行系统进化分析表明，CsGAPDH 与胡萝卜、
葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在 88%以上，与单子叶植物水稻和玉米同
源基因的相似性达 86.8%和 86%，说明该基因在植物中较为保守。GAPDH 基因几乎在所有植物组
织中稳定表达，但在各组织中或不同亚细胞定位的蛋白质高级结构略有差别（Ferreira et al.，2006），
在植物研究中常被用来作为内参基因。但该基因在黄瓜涝胁迫下及不同组织之间均存在显著的表达
水平差异，因此该基因在黄瓜上并不适合作为内参基因。
本研究中初步明确了 CsGAPDH 基因在黄瓜涝胁迫的响应机制中的作用，为今后进一步揭示黄
瓜耐涝分子机制奠定了重要基础。今后将构建该基因的超表达载体，并遗传转化不耐涝黄瓜品系，
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征 订
对黄瓜 CsGAPDH 基因进行功能验证。

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