全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (6) : 829 - 834
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 02; 修回日期 : 2009 - 05 - 31
基金项目 : ‘十一五’国家科技支撑计划项目 (2006BAD07B02) ; 辽宁省博士启动基金项目 (1040179)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jiechen59@ sjtu1edu1cn)
致谢 : 感谢上海交通大学农业与生物技术学院蔡润教授和潘俊松副教授惠赠黄瓜品种。
白粉病菌胁迫下黄瓜 R17抗病品系叶片蛋白质组
分析
范海延 1 , 陈 捷 23 , 邵美妮 1 , 许玉凤 1 , 张春宇 1
(1 沈阳农业大学生物科学技术学院 , 沈阳 110161; 2 上海交通大学农业与生物技术学院 , 上海 201101)
摘 　要 : 以黄瓜抗白粉病品系 R17为试材 , 在接种白粉病菌 24、48和 72 h后提取叶片蛋白质 , 采用
双向电泳技术研究白粉病菌胁迫条件下黄瓜叶片蛋白质组的变化。结果表明 : 黄瓜幼苗在白粉病菌胁迫下 ,
24、48和 72 h的叶片双向电泳图谱与未接种对照组均存在一定差异。通过质谱分析和数据库搜索 , 共鉴定
出 7种表达差异蛋白点 , 它们分别为磷脂酰肌醇 - 4 -磷酸 5 -激酶、假拟蛋白 g5bf、PSⅡ聚光复合体叶绿
素 a /b结合蛋白、铁氧还蛋白 NADP氧化还原酶、XS结构域所含蛋白、肌球蛋白 X I和苹果酸脱氢酶。这
些蛋白都可能是与应答白粉病菌胁迫相关的蛋白质网络中的一部分 , 它们在黄瓜抗病反应中起着不同的作
用。
关键词 : 黄瓜 ; 白粉病 ; 双向电泳 ; 质谱分析
中图分类号 : S 64212; S 43211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0620829206
Proteom ic Ana lysis of R17 Cucum ber D ifferen tia lly Expressed Prote in s
Induced by Powdery M ildew Fungus
FAN Hai2yan1 , CHEN J ie23 , SHAO Mei2ni1 , XU Yu2feng1 , and ZHANG Chun2yu1
( 1 College of B iolog ica l Science and Technology, Shenyang A gricu ltura l U niversity, Shenyang 110161, China; 2 School of A gricu l2
tu re and B iology, Shanghai J iao Tong U niversity, Shangha i 201101, Ch ina )
Abstract: Two2dimensional gel electrophoresis were emp loyed to analyze the p roteome from leaves of cu2
cumber R17 at 24, 48 and 72 h, after inoculating S phaerotheca fu lig inea. The results showed that there were
significant differences between inoculated p lants and control in the 22DE map. Seven different p roteins of R17
seedling leaves with qualitative changes or relatively high abundance were identified by MALD I2TOF /TOF
searching NCB I, including a p rotein of putative phosphatidylinositol242phosphate 52kinase, hypothetical p ro2
tein g5bf, LHCⅡ type I chlorophyll a /b2binding p rotein, ferredoxin2NADP (H) oxidoreductase, putative XS
domain containing p rotein, unconventionalmyosin X I and malate dehydrogenase. This study gives new insights
into pathogen stress response in cucumber leaves and demonstrates the power of the p roteom ic app roach in
p lant biology studies.
Key words: cucumber; powdery m ildew; two2dimensional gel electrophoresis; mass spectrometry
植物受到病原菌侵害时 , 会通过改变体内蛋白质的表达和酶类的活性等来完成信号的感应、传递
以及生物学效应的实现。以往人们对单一防御反应相关酶蛋白和信号做了大量研究 , 但多数是依据少
数生理因子与抗性关系得出结论。
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
　　随着几种模式生物基因组测序的完成 , 蛋白质组学成为后基因组时代的重要的研究手段。双向电
泳 (22DE) 技术可在同一块胶上同时分离数千种蛋白 , 特别是与质谱分析技术相结合 , 满足了准确、
快速、高通量的蛋白质组学研究需求。
目前应用蛋白质组技术在研究镰孢菌和黄曲霉侵染玉米种胚、弯孢菌叶斑病菌侵染玉米、稻瘟病
菌侵染水稻、白叶枯病菌侵染水稻、等方面已有一定进展 (H irosato et al. , 2001; Chen et al. , 2002;
Campo et al. , 2004; Chen et al. , 2004; Chivasa et al. , 2005; W ang et al. , 2005; Mahmood et al. ,
2006; Zhou et al. , 2006) , 但在黄瓜与白粉病菌互作方面的研究尚鲜见报道。
本试验中通过双向电泳差异显示和质谱分析 , 研究了黄瓜白粉病菌 (S phaerotheca fu lig inea) 侵染
黄瓜抗病品系 R17后的蛋白质组的变化 , 这对从根本上揭示黄瓜应答白粉病菌胁迫的本质 , 进而明
确黄瓜抗白粉病的机制具有重要意义。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2005年在上海交通大学农业与生物学院蛋白质组学实验室进行。
供试黄瓜为抗黄瓜白粉病病原菌的品系 R17, 为荷兰温室类型光皮品种 ‘Nevada’与以色列温室
类型光皮品种 ‘Husen’杂交组合分离的自交 7代的品系。
黄瓜白粉病病原菌 [ Sphaerotheca fu lig inea ( Schlecht) Poll. ] 为上海交通大学农业与生物学院蛋
白质组学实验室活体保存的菌种。
112　方法
将黄瓜种子催芽后播在装有草炭土 ν蛭石体积比为 1∶2的营养钵中 , 温室中培养 , 待长至两片真
叶时用浓度 105个 ·mL - 1白粉病菌孢子悬浮液进行喷雾接种。分别于接种后 24、48和 72 h与空白对
照同时取第一片真叶 , 置于 - 80 ℃冰箱中待用。
黄瓜叶片的蛋白质提取、双向电泳、质谱分析及数据库检索等实验方法参照文献 (郭尧君 ,
1999; 钱小红和贺福初 , 2004; 范海延 等 , 2007) 进行。
2　结果与分析
211　白粉病菌接种不同时间后黄瓜叶片双向电泳图谱的比较
黄瓜叶片接种白粉病菌 24、48和 72 h后 , 提取蛋白质样品 , 经双向电泳 , 共有近 500个蛋白点
在考马斯亮蓝染色的 22D胶上分离。
接种白粉病菌 24 h的处理有 47种蛋白特异表达 , 43种蛋白含量上调 , 26种蛋白含量下调 , 与
对照的双向电泳图谱相似系数为 01811。
接种白粉病菌 48 h的处理有 46种蛋白特异表达 , 50种蛋白含量上调 , 37种蛋白含量下调 , 与
对照的双向电泳图谱相似系数为 01876。
病原菌接种 72 h的处理有 14种蛋白特异表达 , 40种蛋白含量上调 , 27种蛋白含量下调 , 与对
照的双向电泳图谱相似系数为 01884。
在不同重复胶的同一位置都出现的蛋白点认为是同一个蛋白 , 试验重点选取在图谱上表现上调升
高的 10个蛋白点进行分析鉴定。其中 , 蛋白点 SSP4004、SSP3112、 SSP3413和 SSP3206在黄瓜 R17
品系接种白粉病菌后 24、48、72 h蛋白表达量均明显升高 ; SSP7724和 SSP7723蛋白点的表达量在接
种后 48 h显著增加 ; 蛋白点 SSP5513在接种后 72 h蛋白表达量表现上调升高 (图 1)。另有 3个上调
的蛋白点因匹配率太低而未得到鉴定 , 在此未列出。
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　6期 范海延等 : 白粉病菌胁迫下黄瓜 R17抗病品系叶片蛋白质组分析 　
图 1　R17不同处理的差异蛋白点图谱
R j24h、R j48h和 R j72h分别表示 R17接种后 24、48和 72 h的处理 , Ro24h、Ro48h和
Ro72h为相应的空白对照 ; 箭头所示为处理后上调蛋白点。
F ig. 1　The d ifferen tia l prote in spots from pa thogen trea ted R17 plan t leaf
R j24h, R j48h and R j72h means treatments of cucumber R17 at 24, 48 and 72 h after inoculating
S. fulig inea respectively. Ro24h, Ro48h and Ro72h means its control. A rrows indicate the p roteins
with at least two2fold change after inoculation with S. fulig inea.
212　差异蛋白的质谱鉴定
通过串联飞行时间质谱仪质谱分析和数据库查询 , 有 7个蛋白点成功鉴定 (表 1)。
蛋白点 SSP4004为磷脂酰肌醇 - 4 -磷酸 5 -激酶 ( P IPkin) , 它在磷脂代谢中参与磷脂酰肌醇 4,
5 -二磷酸 ( P IP2 ) 的合成。
蛋白点 SSP3112为肌球蛋白 X I, 肌球蛋白 (Myosin) 在胞质运动、胞内小泡运动和膜运输方面
起着重要作用。
蛋白点 SSP3413是 PSⅡ聚光复合体叶绿素 a /b结合蛋白 , 该蛋白 N -端伸展到基质中 , 它与粘着
基粒膜片层和其苏氨酸残基可逆磷酸化的光调节有关 , 这二者被认为可介导 PSI和 PSⅡ之间的激发
能分布。
蛋白点 SSP3206为 XS结构域所含蛋白 , 关于其生物学功能尚鲜见报道。
蛋白点 SSP7724为假拟蛋白 g5bf, 该蛋白在植物中的作用尚属未知。
蛋白点 SSP7723为铁氧还蛋白 NADP氧化还原酶 ( FNR) , 它催化还原的铁氧还蛋白 ( Fd) 将电
子传递给 NADP+ , 完成非循环式电子传递 (李合生 , 2002)。
蛋白点 SSP5513为苹果酸脱氢酶 (MDH) , 在植物呼吸作用的三羧酸循环中起重要作用。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
表 1　接种白粉病菌后黄瓜 R17品系差异蛋白质谱鉴定结果
Table 1　R17 d ifferen tia lly accum ula ted prote in s iden tif ied by M S
序号
Spot No.
蛋白质名称
Protein name
NCB I编号
Accession No.
得分
Score
等电点
P I
分子量 /Da
MW
匹配度
Intensity matched
SSP4004 磷脂酰肌醇 - 4 - 磷酸 5 - 激酶 AAM14925 94 6196 88 14813 251722
Putative phosphatidylinositol242phosphate 52kinase
SSP7724 假拟蛋白 g5bf T52072 245 8119 42 65310 391307
Hypothetical p rotein g5bf
SSP3413 PSⅡ聚光复合体叶绿素 a /b结合蛋白 AAF89207 125 5113 27 95011 221658
LHCⅡ type I chlorophyll a /b2binding p rotein
SSP7723 铁氧还蛋白 NADP氧化还原酶 CAD30024 66 8129 38 78116 191640
Ferredoxin2NADP (H) oxidoreductase
SSP3206 XS结构域所含蛋白 AA060001 64 6149 54 09613 161128
Putative XS domain containing p rotein
SSP3112 肌球蛋白 X I AAF43440 78 8101 171 55917 161675
Unconventional myosin X I
SSP5513 苹果酸脱氢酶 CAC12826 149 5191 35 38512 141175
Malate dehydrogenase
3　讨论
病原物侵入寄主后 , 植物与病原物的互作过程是一个动态的过程 , 植物抵御病害的一系列防御反
应是许多蛋白质相互作用共同完成的 ( Kim et al. , 2004)。蛋白质是生命现象的直接体现者 , 对蛋白
质结构和功能进行研究 , 同时结合基因组学的研究将直接阐明生命在生理和病理条件下的变化机制。
本研究对接种黄瓜白粉病菌与对照黄瓜的叶片蛋白质图谱比较分析后发现 , 在接种 24、48、72 h有
大量蛋白质特异表达和含量上调或下调。
R17在接种白粉病菌后 24、48、72 h, P IPkin蛋白含量均明显上调升高。在伤害刺激中 , 细胞内
钙离子浓度首先上升 , 介导植物磷脂酶 D ( PLD) 转移到质膜上发挥其作用 , PLD被激活作为伤害刺
激早期事件 , 而磷脂酸 ( PtdOH ) 则作为效应器或其他调控物的前体起作用 ( Chapman, 1998;
W ang, 1999)。PtdOH可以调节胞内 P IPkin, P IPkin参与磷脂酰肌醇 4, 5 - 二磷酸 ( P IP2 ) 的合成
(Hammond et al. , 1997)。在植物伤害刺激和激发子诱导中 , 可以观察到 PtdOH的大量增加和其他的
磷脂代谢 , 这一过程与受伤害细胞 PLD和其他磷脂酶的释放有关。在以肌醇磷脂代谢为基础的细胞
信号系统中 , 当膜受体接受胞外信号后 , 由 G - 蛋白介导而使 P IP2水解产生二酯酰甘油 (DG) 和肌
醇三磷酸 ( IP3 )。 IP3作用于液泡膜上的受体后 , 使 Ca2 +从液泡中释放出来 , 引起胞内 Ca2 +水平升
高 , 启动胞内 Ca2 +信号系统 , 从而调节依赖 Ca2 + 、钙调素的酶类的活性变化 (孙大业 等 , 2001)。
当有 Ca2 +存在时 , DG、Ca2 + 、磷脂与 PKC分子相结合 , 使 PKC激活 , 从而对某些底物蛋白或酶类
进行磷酸化 , 最终导致包括抗病生理反应在内的一系列反应 ( Fukam i et al. , 1992)。可见 , 在应答
白粉病菌胁迫过程中以肌醇磷脂代谢为基础的细胞信号系统起到重要作用。
研究证明植物细胞中普遍存在肌动蛋白和肌球蛋白 , 与动物的完全相同。Myosin在植物的生长
发育过程中起着重要作用 , 作为细胞骨架的重要组成成分 , 与细胞的运动有关 , 如细胞的内吞、胞质
环流等。它参与运输、信号传递、细胞分裂、细胞质流动和形态建成等 (Reddy, 2001; Tom inaga et
al. , 2003)。同时 , PSⅡ聚光复合体叶绿素 a /b结合蛋白和铁氧还蛋白 NADP氧化还原酶是植物光合
作用中的关键性蛋白 , 这些蛋白质含量的变化可能是白粉病菌侵入后寄主的代谢途径发生变化引起
的。苹果酸脱氢酶 MDH催化苹果酸转化形成草酰乙酸 , NAD +是氢的受体 , 这是三羧酸循环中第 4
次氧化还原反应 , 也是最后一步 (王镜岩 等 , 2002) ; R17接种 72 h时苹果酸脱氢酶含量明显升高 ,
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　6期 范海延等 : 白粉病菌胁迫下黄瓜 R17抗病品系叶片蛋白质组分析 　
这可能与病原菌侵染促使呼吸作用增强有关。
Ventelon2Debout等 (2004) 研究了水稻黄斑驳病毒对水稻蛋白质组的影响。在抗性品种 ‘ IR64’
和敏感品种 ‘Azucena’中分别发现了 40和 24个差异表达的蛋白 , 各有 19和 13个蛋白得到了鉴定。
这些蛋白可以分为三类 : 即代谢类蛋白、胁迫反应相关蛋白和参与翻译的蛋白。范海延等 ( 2007)
对黄瓜杂交 F2代抗黄瓜白粉病研究表明 , 后代抗性与光合作用、呼吸作用、信号转导及抗性基因表
达有一定的相关性。本研究中黄瓜应答白粉病菌胁迫的蛋白质主要有与光合作用和呼吸作用有关的代
谢类蛋白质 , 与信号转导、物质运输相关的蛋白和未知功能蛋白等 , 这与前人研究结果有相似之处。
这些重要蛋白质各自作用的发挥和群集调控可能控制了黄瓜寄主防御反应。
本研究有利于全面了解白粉病致病过程和黄瓜抗白粉病机制 , 但仍有许多抗性相关蛋白需要进一
步鉴定。随着蛋白质组学技术应用 , 植物抗病分子机理可能会有新的发现 , 将更客观的揭示植物防御
病害的本质。
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“庆祝中国园艺学会创立 80周年暨第 11次
全国会员代表大会”征文通知
中国园艺学会将于 2009年 11月在广州召开 “庆祝中国园艺学会创立 80周年暨第 11次全国会员代表大会 ”, 现
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技术与生理、采后技术与生理等方面未曾发表过的研究论文摘要 (不影响相关论文今后在 《园艺学报 》全文发表 ,
恕不接收综述摘要和品种介绍等 )。
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目的与意义 (宋体 , 5号字 ) □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
材料与方法 (宋体 , 5号字 ) □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
结果与分析 (宋体 , 5号字 ) □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
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