全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（增刊）：2538 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com

收稿日期：2011–09–12
基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金项目（2009-1001）；浙江省自然科学基金项目（Y3090294）；浙江省人事厅留学回国基金
项目（J20090028）
* 通信作者（E-mail：xlyu@zju.edu.cn；Tel：0571-88982354）
白菜 BcRALF 基因启动子的分离
阮玉蓉，胡 帅，王芳展，刘振宁，刘亚培，余小林*
（浙江大学蔬菜研究所，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）
快速碱化因子（Rapid Alkalinization Factors，RALF）是最早从烟草叶片中发现的一类多肽信号
类物质。本研究中在已分离得到白菜BcRALF基因全长序列的基础上，采用TAIL-PCR技术克隆获得
白菜BcRALF基因的启动子序列，利用PLACE、PlantCARE和DNAMAN等植物转录元件分析软件对
克隆到的启动子序列进行分析，寻找转录因子结合位点和作用元件。通过启动子缺失分析法研究该
启动子的结构和功能，并比较不同类型启动子对BcRALF基因的驱动差异，为精确调控BcRALF基因
在植物体内的表达和深入分析BcRALF基因的生物学功能奠定研究基础。
材料为白菜‘矮脚黄’核不育两用系。TAIL-PCR方法如下：取 50 ng白菜 DNA，在 20 μL体
系中，以 SP1与 6个简并引物分别配对，进行第 1次 PCR扩增，所得产物稀释 40倍后取 1 μL作模
板，以 SP2和相应的简并引物开始第 2次 PCR扩增，所得产物稀释 10倍后取 1 μL作模板，以 SP3
和相应的简并引物开始第 3次 PCR扩增。5′端 3个特异引物序列分别如下，SP1：5′-CTAGAGATTGACCA
CGACAACGAT-3′；SP2：5′-TAAACTGTGATCTCCATGAAG-3′；SP3：5′-AGAGCCAATAACACCACAAG-3′。
通过 TAIL-PCR初步获得了与理论相符即第 2和第 3次扩增产物之间的大小差距与 SP2和 SP3
之间的大小差距相当的扩增产物。将第 1组的第 3轮扩增产物中的目的片段回收，并分别克隆到 T
载体上。经转化、蓝白斑筛选及酶切检测，获得目的重组子。结果显示，该 BcRALF基因启动子序
列为 792 bp，其碱基 A、G、T、C所占比例依次是 34.34%、13.26%、33.33%和 19.07%；A + T的
比例为 67.68%，C + G的比例为 32.32%，符合启动的碱基组成。该启动子区含有丰富的顺式作用元
件。该序列含有 TATA box等启动子特有元件，分别在-50、-459有 2个 TATA box，TATA box其核
心序列为 TATA（A/T），是 RNA聚合酶Ⅱ识别的位点，也是一些反式作用因子与 DNA相互作用的
位点之一；该序列在-13、-122、-558、-632位置存在 4个 GATA box，是 35S启动子特有元件；在-264
处有 1个 EBOX元件 CANNTG；在-480处存在 1个 YTCANTYY元件；在-264位置存在 1个 MYC
识别位点；同时在-135和-761处还存在 2 个 MYB识别位点 WAACCA；在-508位置有 1个 ACGT
元件；在-783位置有 TATCCA元件。此外，在启动子的反向互补链上也发现一些重要的功能元件，
如 2个 POLLEN1LELAT52元件、1个 I-box元件GATAA、1个WRKY710S元件 TGAC、4个 TATA box、
5个 GATA box、2个 GTGA元件、1个MYC识别位点，调节盐和病原物诱导下基因表达的抗性相
应元件。目前正通过瞬间或稳定表达转基因的方法确定该启动子的表达特性。

关键词：白菜；快速碱化因子（RALF）；启动子；分离
中图分类号：S 634.3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）S-2538-01