全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (2) : 273 - 278
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 08; 修回日期 : 2008 - 12 - 18
基金项目 : 教育部新世纪优秀人才支持计划项目 (NCET20720439) ; 农业部公益性行业科研专项 ( nyhyzx072007)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yingli@ njau1edu1cn)
白菜 S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析
张爱芬 1, 2 , 李　英 1, 23 , 刘同坤 1, 2 , 史公军 1, 2 , 侯喜林 1, 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 以白菜 [B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino ] 自交不亲和系为材料 , 采用 RT2
PCR技术 , 用特异引物对 SLG基因进行克隆 , 获得 SLG基因 cDNA序列长度为 1 324 bp, 命名为 B cSLG。序
列分析表明 : 所获得的白菜 B cSLG基因 cDNA序列包含一完整的编码框 , 编码 432个氨基酸 , 含有 12个保
守的半胱氨酸残基和 7个 N -糖基化位点。序列比对和系统进化分析表明 : B cSLG与其它植物的 SLG基因
氨基酸序列具有较高的同源性 , 与大白菜和甘蓝亲缘关系最近。荧光定量 PCR分析表明 : B cSLG基因在自
交不亲和系的柱头中表达量最高 , 其次是花蕾 , 叶片中表达最低 , 在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中相
对表达较低。
关键词 : 白菜 ; S位点糖蛋白基因 ; 荧光定量 PCR; 基因表达分析
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0220273206
C lon ing and Expression Ana lysis of SLG Gene in B rassica cam pestris L. ssp.
ch inensis ( L . ) M ak ino
ZHANG A i2fen1, 2 , L I Ying1, 23 , L IU Tong2kun1, 2 , SH I Gong2jun1, 2 , and HOU Xi2lin1, 2
(1 S ta te Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing A gricultural U niversity, N anjing 210095, China;
2 College of Horticu lture, N anjing A gricultural U niversity, N anjing 210095, China)
Abstract: Through RT2PCR technique 1 324 bp cDNA sequence of S locus glycop rotein gene (B cSLG)
was obtained from self2incompatible line with specific p rimers in B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. )
Makino. Sequence analysis indicated B cSLG contained one open reading frame, which encoded 432 am ino
acidswith 12 conserved cysteine residues and 7 potentialN2linked glycosylation sites. Sequence alignment and
phyologenetic analysis revealed B cSLG had high sim ilarity to SLG from other p lants and had closest phylogenet2
ic relationship to that in B rassica cam pestris L. and B rassica oleracea L. Real2time PCR analysis showed
B cSLG was highly exp ressed in stigmas, much lower in buds and lowest in leaves of self2incompatible line.
However, in self2compatible line B cSLG was exp ressed in an even lower level whether in stigmas, buds or
leaves.
Key words: B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino; S locus glycop rotein gene; real2time
PCR; quantitative analysis of gene exp ression
植物的自交不亲和性 ( self2incompatibility, SI) 是大多数高等植物防止近亲繁殖的一种遗传屏障 ,
对于白菜等十字花科芸薹属蔬菜杂种优势利用具有重要的作用 , 因此有关自交不亲和性的研究得到了
国内外学者的广泛关注。
根据 SI表型的遗传控制方式可将 SI分为孢子体型 ( sporophytic) 和配子体型 ( gametophytic) 自
交不亲和 (W heeler et al. , 2001)。在单一 S基因位点控制的配子体型自交不亲和反应中 , 目前在分
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
子水平上 S位点已鉴定了至少 2个相连的基因 , 即雌蕊表达的 S 2RN ase基因 ( Tao et al. , 1997) 和花
粉表达的 SFB /SL F ( S2hap lotype2specific F2box /S2locus F2box) 基因 ( Zhang et al. , 2007)。S 2RN ase的
本质是核酸酶 , 能降解来自花粉的 RNA ( rRNA和 mRNA等 ) , 导致自交不亲和反应的发生。孢子体
型自交不亲和由一个复等位基因的多态性 S位点基因控制。已在 S基因座上鉴定出有 3个紧密连锁的
基因参与了花粉和柱头间的相互识别 , 它们是 S基因座受体激酶基因 SR K ( S locus recep tor kinase)、
S基因座糖蛋白基因 SLG ( S glycop rotein gene) 和花粉蛋白外壳基因 SCR ( S locus cysteine2rich p rotein
gene) , 其中 SLG和 SR K为柱头表达蛋白 , SCR为花粉壁中存在的特异因子。当雌蕊和花粉的 S基因
型相同时 , 花粉外壁的 SCR和柱头乳突细胞表面的 SRK的胞外区域发生相互作用 , 结果激活了 SR K
的胞内丝 —苏氨酸蛋白激酶区域 , 导致磷酸化反应的产生 , 随后的信息传递过程中也有柱头水孔蛋
白、THL1蛋白、水离子通道蛋白等的参与。这些蛋白虽然不是由 S位点基因控制 , 但对自交不亲和
反应都具有重要作用 ( Seiji & Akira, 2003; 卢军 等 , 2007)。
芸薹属白菜属于孢子体型自交不亲和。SR K基因是自交不亲和性的雌性专一性决定因子 , 该基因
S域与 SLG具有较高的同源性 , 虽然 SLG基因在花粉拒绝反应中并非是必要的 , 大白菜中甚至没有
SLG基因也同样发生自交不亲和反应 ( Suzuki et al. , 2003) , 但 SLG基因的表达能增强 SR K的活性 ,
是自交不亲和反应的辅助因子 , 能增强自交不亲和反应的能力 ( Takasaki et al. , 2000; Silva et al. ,
2001) , 因而对 SLG基因的研究也具有重要作用。为了进一步分析 SLG在 SI反应中的作用 , 作者以白
菜为材料采用 RT2PCR技术对 SLG基因进行克隆分析 , 并利用荧光定量 PCR技术从量化的角度分析
SLG基因的表达。为深入研究影响自交不亲和反应的功能因子 , 探讨孢子体自交不亲和途径中功能因
子的相互作用机理提供参考。
1　材料与方法
111　材料
试验材料为白菜 [B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino ] 自交不亲和系 ‘03号 ’和
自交亲和系 ‘105号 ’, 由南京农业大学白菜课题组提供。大肠杆菌菌株 JM109, 由本实验室保存 ;
质粒载体 pMD182T vector、Taq DNA聚合酶、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV ) Ver 211、荧光定量试剂
SYBR P rem ix Ex TaqTM、Agarose Gel DNA Purification kit Ver1210试剂盒等均购自 TaKaRa公司。RNA
提取试剂盒 Simp ly P Total RNA Extraction kit购自 B ioflux公司。
112　亲和指数的测定
于 2008年 3月 10起 , 在南京农业大学江浦实验基地进行试验。从田间生长的 ‘03号 ’和 ‘105
号 ’材料中各选 3株发育健壮的植株进行单株套袋自交。开花初期每株上选 3～4个花序 , 摘除已经
开放的花朵和角果 , 套上硫酸纸袋 , 待花期选定 3个花序 , 每个花序上 10朵花进行自花授粉并套袋 ,
挂牌标记。授粉 3～4 d后及时提袋 , 等角果变黄后 , 把角果连同花枝一起剪下装入纸袋内 , 带回室
内经风干后脱粒 , 调查种子结实情况 (刘晓东 等 , 2004)。亲和指数用结籽数占总授粉花数的比率
表示。将花期自交亲和指数小于 015的品系认定为自交不亲和品系 , 大于 015的为自交亲和品系。
113　引物设计和 RT2PCR扩增
依据甘蓝 SLG基因 cDNA 序列编码区设计特异引物 , SLGF: 5′2ATGAAAGGCGTAAGAAAAAC2
CTA23′; SLGR: 5′2CCGTGTTTTATTTTAAGAGAAAGAGCT23′; 以 ‘03号 ’开花当天的柱头为材料 ,
用 RNA提取试剂盒提取柱头总 RNA。以总 RNA为模板 , O ligo ( dT) 18为引物 , 用反转录试剂盒合
成 cDNA的第一条链 , 以 cDNA的第一条链为模板 , 利用上述引物进行扩增 , PCR反应体积为 20μL,
其中含有 30～50 ng模板 cDNA, 1μmol·L - 1引物 , 200μmol·L - 1 dNTPs, 10 ×PCR缓冲液 , 210
mmol·L - 1MgCl2 , 1 U Taq酶。扩增程序为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃变性 1 m in, 55 ℃退火 1 m in;
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　2期 张爱芬等 : 白菜 S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析 　
72 ℃延伸 1 m in 30 s, 30个循环 , 72 ℃延伸 10 m in。4 ℃保存。扩增产物在 110%琼脂糖凝胶中进行
电泳 , 在 UV凝胶成像分析系统进行拍照及分析。
114　目的片段的回收、克隆测序及分析
目的片段的回收按照 TaKaRa生物公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行。回收的 DNA
片段连接到 pMD182T载体上。连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109, 蓝白斑筛选后 , 挑取阳性克隆
经菌液 PCR鉴定正确后送上海博亚生物科技有限公司进行序列测定。相似性比较在 NCB I站点上用
BLAST完成 , 开放阅读框分析在 NCB I站点上用 ORF finder进行 , 功能位点用 InterProScan、SMART
等软件进行分析预测。
多序列比较和系统进化分析利用 DNAman软件完成。
115　荧光定量 PCR反应
以白菜 ‘03号 ’和 ‘105号 ’材料开花当天的柱头、花蕾、叶片为材料 , 用 RNA提取试剂盒分
别提取总 RNA。
以总 RNA为模板 , O ligo ( dT) 18为引物 , 用反转录试剂盒合成 cDNA的第一条链。依据已知
B cSLG基因序列 , 按照荧光定量 PCR引物设计原则设计引物。正向引物为 5′2TCGGAATGACCAACAA2
CA23′, 反向引物为 5′2TACACCCATTTGCCCAGA23′。
以白菜 3 - 磷酸甘油醛脱氢酶基因作为内标基因 , 内标基因引物为 GAPDHF /GAPDHR。GAP2
DHF: 5′2ACTGTCTCGCTCCATTCG23′。GAPDHR: 5′2AGTTTCCCTTTGGGTTAG23′。反应在 Rotor2Gene
3000荧光实时定量 PCR仪上进行 , 反应体系为 25μL, 方法参照 TaKaRa公司荧光定量试剂 SYBR
P rem ix Ex TaqTM说明书。PCR反应热启动程序为 95 ℃变性 2 m in; 95 ℃ 20 s, 52 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s,
共 40个循环 ; 融解曲线测定为从 65 ℃到 95 ℃。
每个试验设 3次重复 , 数据由 Rotor2Gene 6软件分析。
2　结果与分析
211　亲和指数分析
通过田间观察计算开花数、花期授粉数和结籽数来分析验证单株的自交不亲和性。结果表明 , 3
株自交不亲和系的亲和指数分别为 0150、0147、0107, 平均为 0135, 表现为自交不亲和 ; 3株自交亲
和系的亲和指数分别为 5183、4120和 3120, 平均为 4141, 表现为自交亲和。
212　SL G基因 cD NA序列的扩增和序列分析
　　以自交不亲和系 ‘03号 ’材料的柱头 cDNA
为模板 , 用引物 SLGF /SLGR 进行扩增 , 扩增出
一条约 1 400 bp的目的条带 (图 1) , 经克隆测序
后所得序列长度为 1 324 bp (命名为 B cSLG)。
将该序列提交 GenBank数据库 , 用 NCB I的
BLAST软件进行核苷酸序列同源性比对 , 发现与
甘蓝 SLG基因 ( Y00268) 的相似性为 91% , 与
甘蓝型油菜 SLG 基因 ( Z11725 ) 的相似性达
89% , 与萝卜 SLG基因 (AY527401) 的相似性为
89%。
利用 NCB I站点的 ORF finder进行分析发现 ,
B cSLG基因 cDNA序列包含一个完整开放阅读框
图 1　B cSLG基因 PCR扩增的电泳图
F ig. 1　Agarose gel electrophoresis pa ttern of the gene
B cSLG by PCR
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( 1～1 299 bp) , 编码 432个氨基酸 (图 2)。
图 2　B cSL G的 cD NA序列及推导的氨基酸序列
下划线区域分别为起始密码子和终止密码子。
F ig. 2　The nucleotide ac id sequence and deduced am ino ac id sequence for B cSLG
Initial and term inal codons were underlined respectively.
将 B cSLG基因所编码的氨基酸序列进一步进行功能位点分析发现 C端含有 12个保守的半胱氨酸
残基和 7个 N -糖基化位点 , N端为疏水区 , 1～31个氨基酸为信号肽。与其他植物 SLG氨基酸序列
进行比对发现 , B cSLG 基因与甘蓝 ( Y00268 )、萝卜 ( AY527401 )、大白菜 ( D85221 )、芜菁
(AB012105 ) 和甘蓝型油菜 ( Z11725 ) 的 SLG 基因同源性较高 , 分别具有 8615%、 84167%、
84128%、80137%和 82161%的序列相似性 (图 3)。
系统进化分析结果 (图 4) 表明 , 白菜与大白菜亲缘关系最近 , 最先聚类合并在一起 , 接着又与
甘蓝聚类 , 再与萝卜聚类 , 甘蓝型油菜和芜菁聚为一类 , 与甘蓝型油菜和芜菁亲缘关系相对较远 , 最
后聚类。
213　荧光定量 PCR分析
如图 5所示 , B cSLG基因的表达在不同材料的不同组织中存在显著的差异 , 在自交不亲和系的柱
头中表达量最高 , 达到了自交亲和系柱头的 23倍 , 花蕾中 B cSLG基因的表达量仅次于柱头 , 叶片中
最低。
在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中 B cSLG基因的表达量都相对较低 , 其中柱头和花蕾的表达
量基本相同 , 叶片中最低。从而也说明 B cSLG基因主要在自交不亲和系的生殖器官 , 尤其是在雌蕊
柱头中高度表达 , 且在营养器官叶片中也有微量表达。
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　2期 张爱芬等 : 白菜 S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析 　
3　讨论
本研究从白菜中克隆的 B cSLG基因序列编码 432个氨基酸。该基因编码一个分泌型的糖蛋白 , 该
蛋白具有 12个保守的半胱氨酸残基 ( Takayama et al. , 1987)。不同物种中 SLG基因核苷酸序列有所
差异 , 在氨基酸序列上体现 2% ～40%的差异 (N ishio & Kusaba, 2000)。
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Gaude等 (1993) 曾在甘蓝突变体试验中发现自交不亲和植株的 SLG表达水平很低 , 而自交亲和
突变体的 SLG表达水平则很高。W atanabe等 (1997) 在大白菜免疫印迹试验中发现 3个自交亲和植
株中柱头 SLG蛋白的含量低于不亲和植株。本研究的结论与 W atanabe等 (1997) 的试验结果相符 ,
白菜 B cSLG基因在自交不亲和系柱头中的表达水平显著高于自交亲和系 , 这可能是由于 SI材料柱头
中 B cSLG基因的高度表达增强了 SR K基因的生理活性 , 从而间接地增加了植株的自交不亲和性 , 但
这种增强作用的机理仍需进一步的研究。而且 SLG的表达可能与多种因素有关 , 包括材料、S单元型
的不同以及 S单元型的类型等。
实时荧光定量 PCR技术由于具有高准确性、高特异性等优点越来越广泛地应用于各研究领域
(彭书明 等 , 2006)。本研究利用荧光定量 PCR方法研究了自交不亲和相关 SLG基因在白菜自交不亲
和系和自交亲和系不同组织中的相对表达差异 , 为下一步研究白菜中其它自交不亲和功能基因提供了
经验和技术基础。
References
Gaude T, Friry A, Heizmann P, Nariac C, Rougier N, Dumas C. 1993. Exp ression of a self2incompatibility gene in a self2compatibility line of
B rassica oleracea. Plant Cell, 5: 57 - 86.
L iu Xiao2dong, Mu J in2gui, L iu Xue2m in, W angM ing2qiu, W ang Yu2hai. 2004. Studies on autogamy am iability index and itpis change on different
parts of Chinese cabbage at flowering period. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 8 (4) : 34 - 36. ( in Chinese)
刘晓东 , 牟金贵 , 刘学岷 , 王明秋 , 王玉海. 2004. 大白菜花期自交亲和指数测定及不同部位亲和性的变化. 河北农业科学 , 8
(4) : 34 - 36.
Lu Jun, L iLe2yu, Chen Xiao2dan, Zhu L i2quan, W ang Xiao2jia. 2007. Progress on functional factors of self2incompatibility and molecularmecha2
nism in B rassica. Guangxi Agriculture Sciences, 38 (6) : 601 - 605. ( in Chinese)
卢　军 , 李乐玉 , 陈晓丹 , 朱利泉 , 王小佳. 2007. 芸薹属自交不亲和功能因子及分子机制研究进展. 广西农业科学 , 38 ( 6) :
601 - 605.
N ishio T, Kusaba M. 2000. Sequence diversity of SLG and SRK in B rassica oleracea. Annals of Botany, 85: 141 - 146.
Peng Shu2m ing, Tang L in, Ye Yang, Fan Zhe2ren, L iu Yan2jun, Chen Fang. 2006. Studies on tissue2specific exp ression of bitter gourd BAG
gene. Acta Horticulturae Sinica, 33 (5) : 1007 - 1010. ( in Chinese)
彭书明 , 唐　琳 , 叶　杨 , 樊哲仁 , 刘彦君 , 陈　放. 2006. 苦瓜 BAG基因组织特异性表达研究. 园艺学报 , 33 ( 5 ) : 1007 -
1010.
Seiji T, Akira I. 2003. Molecular mechanism of self2recognition in B rassica self2incompatibility. Journal of Experimental Botany, 54 (380) : 149 - 156.
Silva N F, Stone S L, Christie L N, Sulaman W , Nazarian K A P, Burnett L A, A rnoldo M A, Rothstein S J, Goring D R. 2001. Exp ression of
the S recep tor kinase in self2compatible B rassica napus cv. W estar leads to the allele2specific rejection of self2incompatible B rassica napus pol2
len. Molecular Genetics and Genom ics, 265: 552 - 559.
Suzuki G, Kakizaki T, Takada Y, Shiba H, Takayama S, Isogai A, W atanabeM. 2003. The S hap lotypes lacking SLG in the genome of B rassica
rapa. Plant Cell Rep, 21: 911 - 915.
Takasaki T, Hatakeyama K, Suzuki G, W atanabe M, Akira I, Kokichi H. 2000. The S recep tor kinase determ ines self2incompatibility in B rassica
stigma. Nature, 403: 913 - 916.
Takayama S, Isogai A, Tsukamoto C, Ueda Y, H inata K, Okazaki K, Suzuki A. 1987. Sequences of S2glycop roteins, p roducts of the B rassica
cam pestris self2incompatibility locus. Nature, 326: 102 - 105.
Tao R, Yamane H, Sassa H, Mori H, Gradziel TM, DandekarA M, Sugiura A. 1997. Identification of stylar RNases associated with gametophyt2
ic self2incompatibility in almond ( Prunus dulcis) . Plant Cell Physio, 38 (3) : 304 - 311.
W atanabe M, Ono T, Hatakeyama K, Takayama S, Isogai A, H inata K. 1997. Molecular characterization of SLG and S2related genes in a self2
compatible B rassica cam pestris L. var. yellow sarson. Sex Plant Rep rod, 10: 332 - 340.
W heelerM J, Franklin2Tong V E, Franklin F C H. 2001. The molecular and genetic basis of pollen2p istil interaction. New Phytol, 151 ( 3) :
565 - 584.
Zhang S L, Huang S X, Kitashiba H, N ishio T. 2007. Identification of S2hap lotype2specific F2box gene in Japanese p lum ( P runus sa licina
L indl. ) . Sex Plant Rep rod, 20: 1 - 8.
872
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