全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (5) : 723 - 726
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 11 - 04; 修回日期 : 2009 - 03 - 24
基金项目 : 江苏省科技支撑计划项目 (BE2008311)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
两个洋葱雄性不育系细胞质类型的鉴定与分析
吴海涛 1, 3 , 王建军 2 , 侯喜林 1, 23 , 刘洪炯 3 , 马蓉莉 3 , 马景蕃 2
(1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室 , 南
京 210095; 3山西省农业科学院蔬菜研究所 , 太原 030031)
摘 　要 : 采用分子生物学手段 , 对从国内品种中选育出的两套洋葱细胞质雄性不育系进行了细胞质类
型的鉴定 , 并用 189个 RAPD引物分析了不育系和相应保持系之间的多态性。结果表明 , 来自品种 ‘沙沟
红皮 ’的不育系为 T型细胞质类型 , 从 ‘朔州紫皮 ’中选育出的不育系为 S型细胞质。对这两套近等位基
因系的基因组随机扩增结果显示 , 与 T雄性不育系相比 , S型不育系与其保持系基因组之间有更多的差异。
关键词 : 洋葱 ; 细胞质雄性不育系 ; 鉴定 ; 多态性
中图分类号 : S 63312　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0520723204
Iden tif ica tion and Ana lysis of Cytopla sm ic M a le Ster ility in On ion ( A llium
cepa L . ) O r ig in from Ch inese Cultivars
WU Hai2tao1, 3 , WANG J ian2jun2 , HOU Xi2lin1, 23 , L IU Hong2jiong3 , MA Rong2li3 , and MA J ing2fan2
(1 S ta te Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N anjing A gricultural U niversity, N anjing 210095, China;
2 Key Labora tory of Sou thern V egetable C rop Genetic Im provem ent, M inistry of A gricu lture, N an jing 210095, China; 3V egetable
Institu te of A gricu lture A cadem y of Sciences in Shanxi, Taiyuan 030031, Ch ina)
Abstract: In this paper, two sets of cytop lasm ic male sterile lines, came from two different onion culti2
vars (A llium cepa L. ) , were investigated by molecular method, and were discussed about their polymorphism s
with corresponding maintainers. The results showed that the cytop lasm s of male sterile lines origin from‘Sha2
gou Hongp i’and‘Shuozhou Zip i’are T and S, respectively. RAPD amp lification showed that the S cyto2
p lasm has more polymorphism than T cytop lasm compared to their maintainer lines.
Key words: onion; cytop lasm ic male sterile line; identification; polymorphism
植物细胞质雄性不育性状是由细胞质基因发生突变引起的 , 细胞核通过特定基因在转录或翻译水
平对突变基因产物进行修复 , 使其恢复育性 ( Patrick & Roger, 1998)。在洋葱 (A llium cepa L. ) 中 ,
与细胞质雄性不育密切相关的细胞质基因变异被用来区别雄性不育遗传表现类型 , 由这些变异发展而
来的分子标记已应用于雄性不育类型的区分以及在苗期从未知群体中筛选不育株。 cob基因变异是在
Northern杂交基础上通过建立线粒体基因组文库 , 克隆并测序后发现的。与保持系相比 , 洋葱 S型雄
性不育线粒体 cob基因上游区域有一个 471 bp片段的插入 , 用这个标记可以方便地从群体中找出含有
S型不育细胞质的植株 ( Satoh, 1998)。但用该标记不能区别 T型细胞质和正常可育细胞质。Engelke
等 (2003) 发现与细香葱 CMS1相关的特殊阅读框 ( orfA501) 在洋葱 S型和 T型细胞质中都存在 ,
但细胞质正常的可育系中没有。二者相结合即可以从分子水平将 S型、T型不育系和可育系区分开。
S型不育可以由一对隐性细胞核基因 (m sm s) 恢复 , 杂交后代按 3 ∶1分离 , 遵循经典的孟德尔
遗传规律 (Jones & Clarke, 1943) , 在 ‘ Italian Red’品种中被发现的不育株 ( Jones & Em sweller,
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1936) 就是这种类型 ; T型不育系是由 Berninger (1965) 在法国品种 ‘Jaune paille des venus’中发
现的 , 它受一对独立的 ( aa) 和两对互补的 ( bbcc) 细胞核基因共同控制 , 杂交后代分离比较复杂
( Schweisguth, 1973)。另一种比较特殊的遗传表现类型是从印度当地品种 ‘Nasik W hite Globe’中发
现的 , 是一种由细胞质控制的显性雄性不育 , 该雄性不育系与 350个其它洋葱品种的杂交后代都表现
雄性不育 ( Pathak & Gowda, 1993) , 从分子水平分析认为它属于 S型细胞质 (Havey, 2000)。
国内洋葱细胞质雄性不育系的选育比较滞后 , 对来源于国内地方品种的雄性不育系细胞质的鉴定
还未见报道。作者对从 ‘沙沟红皮 ’和 ‘朔州紫皮 ’中选育出的洋葱雄性不育系进行了细胞质类型
鉴定 , 并分析了它们与相应保持系的多态性 , 为洋葱杂交品种的选育提供参考。
1　材料与方法
111　材料
试验材料均由山西省农业科学院蔬菜研究所刘洪炯研究员提供。细胞质雄性不育系 8A和保持系
8B , 从 ‘沙沟红皮 ’中选出 , 回交 9代 ; 细胞质雄性不育系 11A和保持系 11B, 从 ‘朔州紫皮 ’中
选出 , 回交 8代。两套不育系和保持系都是近等位基因系。4个品系的种子于 2007年 10月 2日播种
于南京农业大学试验区大棚中 , 用草炭作基质育苗。Taq酶和 dNTP购自 TAKARA公司 ; 引物由金斯
特公司合成 ; PCR反应在 Eppendorf公司生产的 Mastercycler Gradient PCR仪 (型号 5345) 上进行。
112　方法
11211　基因组 DNA的提取 　2008年 2月 10日从 4个月大小的幼苗中取 5株 , 共采 015 g叶片混合 ,
用改良的 CTAB法 (B radeen & Havey, 1995) 提取基因组 DNA。提取的 DNA在 110%琼脂糖凝胶上电
泳 , 以 Marker 2000为对照进行检测并估计其浓度。
11212　细胞质类型鉴定 　区别洋葱不同细胞质类型需参考 cob (Satoh, 1998) 和 orfA501 (Engelke et al. ,
2003) 两个分子标记的扩增产物。cob基因标记引物有 3条 : cob (S) GTCCAGTTCCTATAGAACCTATCACT;
cob (N) TCTAGATGTCGCATCAGTGGAATCC; cob (C) CTTTTCTATGGTGACAACTCCTCTT。orfA501阅读框
的引物为 : F: ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC和 R: CCAAGCATTTGGCGCTGAC。
PCR扩增采用 20μL体系 , 混合液中包含总 DNA 50 ng、各引物 0125μmol·L - 1、 dNTP 0115
mmol·L - 1、Mg2 + 012 mmol·L - 1、 l ×Buffer和 Taq聚合酶 1 U。反应程序为 : 94 ℃, 2 m in; 94 ℃,
30 s, 53 ℃, 1 m in, 72 ℃, 2 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。PCR产物以 115%琼脂糖凝胶为介
质 , 在 1 ×TAE缓冲液中电泳 , EB显色 , 培清 JS2300凝胶图像分析系统中拍照。
11213　RAPD扩增 　用 189个 RAPD引物对基因组 DNA进行扩增 , 扩增程序参考陈沁滨等 (2006) ,
稍修改。20μL反应体系中包含 l ×Buffer、210 mmol·L - 1 Mg2 + 、Taq 1 U、200μmol·L - 1 dNTP、016
μmol·L - 1随机引物和 15 ng DNA模板 ; PCR扩增程序为 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃变性 30 s, 35 ℃退
火 40 s, 72 ℃延长 115 m in, 40个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。扩增产物经 115%琼脂糖凝胶电泳后 , 在
培清 JS2300凝胶图像分析系统中拍照 , 统计有差异条带的引物。
2　结果与分析
211　细胞质雄性不育类型
如图 1所示 , 两个细胞质雄性不育系类型的扩增结果与 Satoh (1998) 和 Engelke等 (2003) 报
道的扩增片段大小相同。采用 cob标记引物在可育系和 T型不育系之间扩增的条带相同 , 414 bp大小
的条带很弱 , 180 bp大小的条带很亮 , 而在 S型不育系中与之相反 , 414 bp大小的条带很亮 , 180 bp
大小的条带很弱 ; 用 orfA501标记引物只能在不育系中扩增出 473 bp大小的条带 , 而可育系中没有或
者很弱。由图 1可以看出 , cob标记在 11A以及它组配的 F1基因组中扩增到的两个条带 ( 414 bp和
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　5期 吴海涛等 : 两个洋葱雄性不育系细胞质类型的鉴定与分析 　
180 bp) 与保持系 (8B、11B)、不育系 8A和以 8A为母本组配的 F1的条带正好相反 , 11A中 414 bp
的条带很亮 , 180 bp的条带亮度很弱 , 说明从 ‘朔州紫皮 ’中选育出的不育系 11A属于 S型细胞质
不育。而不育系 8A与它的保持系 8B以及 F1扩增结果相同 , 无法区分。再根据对 orfA501的扩增结果
(图 1) 可以看出从 8A中扩增到了 473 bp的片段 , 而且亮度与 11A相当 , 证明为雄性不育系 , 因此
可以确定源自 ‘沙沟红皮 ’的雄性不育系 8A属于 T型细胞质不育。对于基因 cob和 orfA501的扩增
结果 , 不育系和其杂交一代总是相同的 , 从而证明试验所用引物的靶基因在细胞质中 (图 1)。
图 1　线粒体 cob和 orfA501标记扩增结果
A: 不育系 ; B: 保持系 ; F1 : 杂交一代 ; 8: ‘沙沟红皮’; 11: ‘朔州紫皮’; M: 分子大小标记。
F ig. 1　Am plif ica tion s of the cob and orfA501 marker
A: Sterility; B: Maintainer; F1 : Hybrid generation; 8: ‘Shagou Hongp i’; 11: ‘Shuozhou Zip i’; M: Molecular marker.
212　基因组 RAPD扩增
采用 189个 RAPD引物对两个雄性不育系和相应保持系的基因组 DNA进行了扩增。在不育系 8A
和保持系 8B之间扩增出差异条带的有 2个引物 (AS15和 RY1) ; 而在不育系 11A和保持系 11B之间
有 5个引物 (AM2、AO4、AO12、RY12、RY13) 扩增出差异条带 (图 2)。其条带差异的表现为有
和没有的差异 (如 AS15、AO4和 AO12) , 说明此处有一个插入或者缺失的突变 ; 也有条带亮度强弱
的差异如 RY1、AM2、RY12和 RY13, 这是由目的基因的重复数不同或错配造成的。从 RAPD扩增结
果来看 , T型不育系和保持系之间多态性较低 , 而 S型不育系和保持系之间多态性高。这个结果与
Holford等 (1991) 和 Havey (2000) 的研究结果一致 , 进一步证明了 T型不育与栽培种基因组差异
较小 , 而 S型不育与栽培种的基因组差异较大。
图 2　两套近等位基因系基因组的随机扩增条带差异
A: 不育系 ; B: 保持系 ; 8: ‘沙沟红皮’; 11: ‘朔州紫皮’; M: 分子大小标记。
F ig. 2　D iversity of RAPD am plif ica tion s in two set of on ion near isogen ic lines ( N IL )
A: Sterility; B: Maintainer; 8: ‘Shagou Hongp i’; 11: ‘Shuozhou Hongp i’;
M: Molecular marker.
3　讨论
洋葱不同类型的细胞质雄性不育系可能会有不同的丰产潜力 , 与不同来源品种的配合力也可能有
差异 , 而且如果单一细胞质类型的杂交品种大面积栽培 , 可能会发生大规模病虫害。因此洋葱雄性不
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育细胞质鉴定有重要意义。 cob和 orfA501两个分子标记是以国外品种为基础材料的研究成果 , 本试
验的结果表明它们也应用于中国当地品种的细胞质鉴定 , 但两个试验材料之间的关系令人怀疑 , 因为
线粒体基因进化速度比较快 (David, 2007) , 而很多线粒体重组都可以导致植物雄性不育 ( Patrick &
Roger, 1998; Renate, 2006 )。另外采用特殊引物扩增时 , 有的品系中条带非常弱 , Engelke 等
(2003) 认为靶基因可能是以 Sublimon的形式存在。本试验中扩增出差异条带的随机引物数量占所用
随机引物总数的比例 (1%和 215% ) 远低于李园园等 (2006) 的 5%和刘杰等 (2004) 的 12%以及
陈沁滨等 (2007) 的 34%。因为所用的两对材料 ———8A /8B和 11A /11B , 分别来自同一个品种 , 且
经过 9代和 8代的回交 , 其细胞核基因几乎相同。而上述研究者所用材料经过 4代 (陈沁滨 等 ,
2007) 和 5代 (李园园 等 , 2006) 回交 , 细胞核基因差异相对较大。虽然在两个类型的雄性不育系
和它们的保持系中扩增出了差异条带 , 但是经过进一步的验证发现它们并不能作为分子标记。可能是
因为这些位点的变异不足以造成细胞质雄性不育 , 或者因为不同不育系不育机理有差异。
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