全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (5) : 679 - 684
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 15; 修回日期 : 2009 - 04 - 21
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30400304)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yanghq@zjfc1edu1cn)
转反义 PH YA基因对番茄红素合成的影响
吴峰华 , 常银子 , 杨虎清 3
(浙江林学院农业与食品科学学院 , 浙江临安 311300)
摘 　要 : 通过根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 介导法 , 以番茄叶片作外植体 , 将番茄 (Sola2
num lycopersicum L. ) 反义光敏色素 A ( PHYA ) 基因片段导入番茄。通过 PCR扩增、 Sourthern blot检测 ,
证明反义光敏色素 A的基因片段已整合到番茄基因组。在转基因番茄材料中 , PHYA 基因表达受到抑制 ,
番茄红素的合成显著减少 , 果实没有表现出正常的红色果皮 ; 转基因果实成熟过程中乙烯能够正常合成 ,
与对照番茄之间没有显著差异。推测在调控番茄红素合成的模式中 , 光敏色素可能位于乙烯的下游位点起
作用 , 二者共同调控番茄红素的合成。
关键词 : 番茄 ; 番茄红素 ; 光敏色素 ; 乙烯
中图分类号 : S 64112; Q 785　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0520679206
Regula tion of B iosyn thesis of L ycopene in Toma to by An tisen se Tran sforma2
tion w ith Phytochrom e A Gene
WU Feng2hua, Chang Yin2zi, and YANG Hu2qing3
(School of A gricu lture and Food Science, Zhejiang Forestry U niversity, L inpian, Zhejiang 311300, China)
Abstract: Young leaves as exp lants, the tomato (Solanum lycopersicum L. ) was transformed with anti2
sense genom ic DNA of phytochrome A, which mediated by A grobacterium tum efacien. It was shown by PCR a2
nalysis and Sourthern blotting detection that the fragment of PHYA was integrated into the tomato genome. Sev2
eral results were observed from transgenic tomato friuts including inhibition of exp ression of PHYA , siginificant
decrease in biosynthesis of lycopene and the abnormal color of the fruit skin. There were no siginificant differe2
necs between transgenic fruits and the control group s in the p roduction of ethylene. Therefore, we p resumed
that phytochrome existing in the downstram of ethylene, which along with PHYA , p layed a role in the regula2
tion of biosynthesis of lycopene. However, more studies on how both of them regulate the biosynthesis of lyco2
pene are needed.
Key words: tomato; lycopene; phytochrome A; ethylene
番茄红素是一种很有开发前景的功能性色素 , 对于预防多种疾病 , 增强机体免疫力和抗衰老等均
有重要作用。番茄和番茄制品是番茄红素的主要来源 , 因此提高番茄中番茄红素的含量具有重要意义
(李君明 等 , 2001; 王晋华 等 , 2009)。
目前对番茄红素的生物合成途径已经有了比较清楚的了解 (Bartley & Scolnik, 1994; Ronen et
al. , 1999) , 对于其合成的调控研究则刚刚起步。已经发现 , 光敏色素 ( Phytochrome, 简称 PHY)
对番茄红素的合成具有重要调节作用 (A lba et al. , 2000) , 但目前还不知道光敏色素参与调控番茄红
素合成的作用方式和分子机理。因此 , 本研究中构建了反义光敏色素 A ( PHYA ) 基因植物表达载体 ,
利用农杆菌介导进行遗传转化并获得转基因番茄植株 , 对光敏色素调控番茄红素合成的分子机理进行
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
了初步的研究 , 为通过基因工程技术提高番茄红素合成提供理论依据。
1　材料与方法
111　材料与试剂
试验于 2007年在浙江林学院果蔬采后生理与分子生物学实验室进行。番茄 (Solanum lycopersicum
L. ) 自交纯合系 B1 (大红果 ) , 高抗番茄青枯病 , 由浙江大学生物技术研究所提供 , 外植体选用苗
龄 7～9 d的无菌子叶。大肠杆菌菌株为 DH5α, 根癌农杆菌 (A grobacterium tum efaciens) 菌株为
EHA105。
112　反义植物表达载体 PB I2Y HQ的构建
植物双元表达载体 pB I121, 含 CaMV35S启动子调控的β - 葡萄糖苷酸酶 (GUS ) 报告基因和抗
卡那霉素 ( Kan) 筛选的新霉素磷酸转移酶 (N PTⅡ) 基因。含有 PHYA cDNA 序列的质粒 pCM 2
PHYA由本实验室保存。
利用 PCR从 pCM 2PHYA上扩增出约 016 kb的 PHYA序列。上述 PCR产物与 pB I121载体分别用
内切酶 X baⅠ和 SacⅠ消化 4～8 h后 , 电泳割胶回收大片段。将两个大片段用 T4 DNA连接酶连接形
成反义植物表达载体 PB I2YHQ (图 1)。
图 1　反义植物表达载体 PB I2Y HQ的构建
F ig. 1　Con struction of the an tisen se PH YA gene vector ( PB I2Y HQ)
113　番茄的转化
用三亲交配法将 PB I2YHQ转入根癌农杆菌菌株 EHA105。用叶盘法 (Horsh et al. , 1985) 转化番
茄无菌苗的真叶叶盘。
114　转基因番茄反义 PH YA序列的 PCR检测
用改良 CTAB法提取番茄的基因组 DNA , 利用 PCR检测外源基因是否已经插入并整合到番茄的
基因组中。上游引物 P1: 5′2CCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT23′, 根据 CaMV35S启动子的一段序列
设计 ; 下游引物 P2: 5′2CATCTAGAAAGCGGACCATTTCAGT23′, 根据番茄反义 PHYA的 3′末端序列设
计。
PCR扩增条件为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环 ; 最后 72
℃延伸 10 m in。
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　5期 吴峰华等 : 转反义 PHYA基因对番茄红素合成的影响 　
115　转基因番茄的 Southern blot检测
分别对转基因及阴性对照番茄总 DNA用 H indⅢ ( TaKaRa) 进行酶切后 , 在 018%琼脂糖凝胶上
电泳分离。DNA片段分离后经毛细作用转移到硝酸纤维素膜上。
以 N PTⅡ ( Km) PCR回收产物作为探针 , 用 Promega Primea2Gene Label试剂盒进行标记 , 然后
65 ℃杂交过夜。
116　果实采样及样品保存
选择转基因与野生型番茄植株在温室培养 , 从花药开放之日挂牌标记花和果实 , 当果实绿熟或花
蒂出现第一丝红色时 (破色 , BK) 采收果实 , 然后于室温 (20 ℃) 成熟。以 BK为起点 , 分别取处
于 0、5、10、15 d的果实切成 1 cm3大小 , 立即以液氮速冻 , 保存于 - 70 ℃供 RNA提取和番茄红素
测定。
117　转基因番茄 PH YA基因表达水平的检测
采用异硫氰酸胍法提取番茄果实 RNA , RNA甲醛变性凝胶电泳及转移至尼龙膜、杂交、洗膜等
按 Sambrook等 (1989) 的方法进行。
以 600 bp大小的 PHYA基因片段为探针进行 Northern杂交 , 探针标记采用 Promega Promea2Gene
Label试剂盒。
118　番茄红素与乙烯测定
参考 Fish等 (2002) 的方法测定番茄红素 , 参考杨虎清等 ( 2003a) 的方法用 SP6800A气相色
谱仪 (山东鲁南华工仪器厂 ) 测定乙烯释放量 , 重复 3次。
2　结果与分析
211　转基因番茄植株的获得和对外源 PH YA反义基因片段的检测
经表达载体 PB I2YHQ转化 , 共获得 15个具有 Kan抗性的 T0代转基因番茄株系。生根后将其移栽
于温室中培养 , PCR检测证明其中 4株可扩增出 117 kb的特异片段 (图 2) , 分别命名为 YHQ1～
YHQ4。
图 2　转基因番茄株系的 PCR检测
M: DNA标准分子量 ; 1: PB I2YHQ (阳性对照 ) ; 2～5: 转基因番茄 ;
6、7: 未转化番茄 (阴性对照 )。
F ig. 2　PCR detection of the an tisen se PH YA gene in the toma to genom e
M: DNA markers; 1: PB I2YHQ (positive control) ; 2 - 5: Transformed tomato;
6, 7: Untransformed tomato ( negative control) .
PCR结果显示外源 PHYA 反义基因片段包括 CaMV 35S启动子已经整合到转基因株系的基因组
中。为了对上述 PCR的结果做进一步的验证 , 以 N PTⅡ基因 PCR的扩增产物为探针和阳性对照 , 以
未转化的番茄为阴性对照 , 对 4株 PCR鉴定为阳性的转化植株进行 Southern杂交 , 结果 (图 3) 表明
外源 N PTⅡ基因已整合到番茄染色体上 , 推测反义 PHYA片段也一并整合到番茄基因组中。
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图 3　转基因番茄株系中 N PTⅡ的 Southern blot分析
1～4: 反义 PHYA转基因番茄 ; 5: 未转化番茄 (阴性对照 ) ; 6: PCR回收产物 (阳性对照 )。
F ig. 3　Southern blotting ana lysis of N PTⅡ for tran sgen ic plan ts
1 - 4: Transformed tomato with antisense PHYA; 5: Untransformed tomato ( negative control) ;
6: PCR p roduct of N PTⅡ (positive control) .
212　转基因番茄 PH YA基因表达水平的检测
选择转基因植株与野生型植株果实在破色期采收 , 提取 mRNA进行 Northern blot分析。
如图 4所示 , 转反义 PHYA基因植株的 PHYA表达水平明显低于未转化植株。
说明转入的反义 PHYA基因序列已经得到表达。
图 4　破色期番茄果实 PH YA基因表达水平
1: 未转化番茄 (阴性对照 ) ; 2～4: 转反义 PHYA基因番茄。
F ig. 4　Expression of toma to PH YA in the broken fru it
1: Untransformed tomato ( negative control) ; 2 - 4: Transformed tomato with antisense PHYA.
213　转反义 PH YA基因对果实番茄红素合成的影响
由图 5可以看出 , 果实采后成熟过程中番茄红素含量急剧上升 , 在采后 0～5 d, 转基因番茄和对
照 (W ild2type) 果实番茄红素含量差异不显著 ; 但在采后 10 d以后 , 对照果实的外表呈现正常的红
色 , 番茄红素含量急剧上升 , 显著高于转基因番茄 ( P < 0105) , 转反义 PHYA 基因对果实番茄红素
合成有显著抑制作用 , 果实表面未形成正常的色泽。
图 5　番茄果实番茄红素的变化
F ig. 5　Con ten t of lycopene in toma to fru it
图 6　番茄果实乙烯释放量的变化
F ig. 6　Change of fru it ethylene production
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　5期 吴峰华等 : 转反义 PHYA基因对番茄红素合成的影响 　
214　转反义 PH YA基因对果实乙烯合成的影响
如图 6所示 , 转基因番茄与对照番茄采后乙烯合成逐渐升高 , 乙烯释放高峰出现在破色后第 6
天 , 但二者之间度差异不显著 ( P > 0105) , 说明转反义 PHYA 基因对番茄果实的乙烯合成没有显著
影响。
3　讨论
光敏色素是植物体内最重要的光受体 , 参与调控植物发育中许多生理过程。目前在番茄中已经克
隆到 5个光敏色素基因 , 如 PHYA, PHYB 1, PHYB 2, PHYE和 PHYF ( Hauser et al. , 1997; Pratt et
al. , 1997)。但在果实成熟期间只发现 PHYA的表达 (A lba et al. , 2000) , 这些结果表明 PHYA可能
参与调控番茄果实的成熟过程。
本试验采用反义基因技术对 PHYA实施 “基因封闭 ”, 获得了仅有一个基因差异的反义转基因番
茄材料。本研究发现 PHYA被封闭以后果实成熟有如下特点 : (1) PHYA的表达水平降低 ; (2) 番茄
红素的合成受到显著抑制 , 果皮没有表现出正常的红色 ; (3) 果实成熟过程中乙烯正常合成 , 与对
照番茄没有显著差异。
在植物体内番茄红素是通过类异戊二烯途径合成的 (Rongen et al. , 1999) , 催化该途径的关键酶
是番茄红素合成酶 ( PSY) , 它受到遗传、环境以及内源分子如光敏色素、乙烯等因素的共同调控
(Andrew & Gop inadhan, 2005)。光敏色素对番茄红素的调节机理 , 目前有两种假说 ( Jen & W atada,
1977; A lba et al. , 2000) : ①光敏色素可以调节番茄红素的积累 , 作用于生物合成的下游位点 , 乙烯
也可调节番茄红素的合成 , 光敏色素和乙烯的作用是相互独立的 , 光敏色素不影响乙烯的合成 , 果实
内光敏色素不是番茄果实成熟过程的中心调节物质 ; ②光敏色素调节类胡萝卜素的生物合成与红光诱
导乙烯的合成有紧密联系 , 果实内光敏色素是番茄果实成熟过程中番茄红素合成的中心调节物质。一
般认为 , 乙烯调节果实成熟是通过调节成熟过程中相关基因的表达实现的 , 如提高呼吸速率与乙烯自
动催化产量 , 加快叶绿素分解 , 促进类胡萝卜素合成 , 增强细胞壁水解酶活性等 ( Gray et al. ,
1992)。
研究发现 , 阻断乙烯信号传导系统能够抑制果实番茄红素合成 (杨虎清 等 , 2003b) , 而用乙烯
处理番茄能够提高 PSY的表达水平 , 促进番茄红素的合成 (Hoeberichts et al. , 2002)。转反义 PHYA
基因能显著抑制番茄红素的合成 , 但对番茄的乙烯合成没有显著影响 , 推测在调控番茄红素合成的模
式中 , 光敏色素可能位于乙烯的下游位点起作用 , 二者共同调控番茄红素的合成 , 关于乙烯和光敏色
素的相互关系 , 还需要进一步研究证明。
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