全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1255 - 1260
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 10; 修回日期 : 2009 - 07 - 14
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2008AA10Z157) ; 高等学校博士点基金项目 (20060434009) ; 山东省良种工程项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: youchunxiang@ sdau1edu1cn)
苹果 M dF T基因对番茄的遗传转化
李伟明 1, 2 , 王双双 1 , 姚玉新 1 , 赵长增 2 , 郝玉金 1 , 由春香 13
(1山东农业大学作物生物学国家重点实验室 , 园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018; 2 甘肃农业大学农学院园艺
系 , 兰州 730070)
摘 　要 : 通过 RT2PCR扩增 , 从苹果叶片 cDNA中克隆了 FT基因的同源基因 M dFT, 构建了花椰菜病
毒 35S启动子驱动的 M dFT植物表达载体 35S: : MdFT, 并利用根癌农杆菌介导法将其导入番茄栽培品种
‘中蔬四号 ’; 同时转化拟南芥 A tFT基因作为阳性对照。从添加卡那霉素的筛选培养基上再生了抗性植株 ,
PCR扩增证明 , 外源基因 M dFT和 A tFT已经整合到转基因番茄的基因组 , 半定量 RT2PCR则证明它们已经
在转基因番茄中得到异位过量表达。形态鉴定发现 , 转基因番茄植株比非转基因对照植株开花早 , 表明成
功地从苹果中克隆了成花素基因 M dFT, 该基因具有通过转基因缩短苹果树童期的潜在价值。
关键词 : 苹果 ; FT基因 ; 异位过量表达 ; 番茄
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921255206
Genetic Tran sforma tion of Apple M dF T Gene in to Toma to
L IW ei2m ing1, 2 , WANG Shuang2shuang1 , YAO Yu2xin1 , ZHAO Chang2zeng2 , HAO Yu2jin1 , and YOU
Chun2xiang13
(1 S ta te Key Laboratory of C rop B iology, College of Horticu lture Science and Engineering, Shandong A gricu ltura l U niversity,
Taipian, Shandong 271018, Ch ina; 2D epartm ent of Horticu lture, College of A gronom y, Gansu A gricu ltura l U niversity, L anzhou
730070, Ch ina)
Abstract: It is of great importance for field yield of fruit trees to generate flower buds. Recently, FT
p rotein has been p roved to be a florigen in higher p lants. In this study, full2length cDNA of M dFT gene, a
homolog of A rabidopsis A tFT, was amp lified from app le leaf cDNA s with RT2PCR. Subsequently, a p lant
exp ression construct containing M dFT gene driven by cauliflower mosaic virus 35S p romoter was obtained and
introduced into tomato cultivar‘Zhongshu 4 ’with A grobacterium 2mediated transformation. In parallel,
A rabidopsis A tFT gene was transformed as a positive control. Finally, transgenic tomato lines were regenerated
from selection medium p lus kanamycin. PCR amp lification verified the integration of exogenous genes into the
host genome, and sem iquantitative RT2PCR disp layed their ectop ic overexp ression in transgenic tomatoes.
Furthermore, morphological observation found that transgenic tomato lines flowered earlier than the non2
transgenic control, suggestive of our successful cloning of florigen gene M dFT from app le, which has the
potential as a target gene to shorten juvenility in app le tree.
Key words: app le; FT gene; ectop ic overexp ression; tomato
一般说来 , 多年生果树都有童期现象 , 童期可以使果树在开花结果前完成树体的形态建成 , 是果
树长期进化的结果。但童期现象严重阻碍了杂交育种的进程 , 延长了育种周期 , 缩短童期一直是果树
育种的重要目标之一。通过常规方法缩短童期非常困难 , 最近的研究表明 , 基因工程为解决这一难题
提供了新途径。W eigel等 (1995) 将拟南芥的 L FY基因导入欧洲山杨 , 转基因植株仅需 5个月即可
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开花 , 而欧洲山杨实生苗在自然条件下开花需要 8～20年。Penà等 ( 2001) 将拟南芥的开花调控基
因 L FY和 A P1转入枳壳 , 转基因植株 1年内即可开花结果。两个案例都明显缩短了转基因植物的营
养生长期 , 表明转基因技术在缩短童期方面具有很大的应用潜力。
在拟南芥中 , FLOW ER ING LOCUS T ( FT) 是光周期影响开花途径的促进因子 ( Kardailsky et
al. , 1999) , 更重要的是 , 研究表明 FT蛋白在叶片中合成后 , 能通过韧皮部长距离运输到顶端生长
点 , 诱导顶端分生组织向生殖发育方向转化 , 形成花芽 , 这与 “开花素 ”假说完全一致 (Corbesier et
al. , 2007; Jaeger &W igge, 2007; Mathieu et al. , 2007; Yang et al. , 2007)。在苹果中 , FT基因的同源
基因是 M dFT, 其编码框全长序列已经在 2004年被克隆 ( GenBank登录号 AB161112) ( Kotoda &W a2
da, 2005) , 但其功能研究一直未见报道。作者通过构建其植物表达载体并转化番茄 , 对其功能进行
初步鉴定。
1　材料与方法
111　试验材料
采用的苹果 (M alus dom estica Borkh. ) 栽培品种为 ‘嘎拉 ’, 树龄为 6年 , 在山东农业大学农场
自然条件下生长 , 2007年 5月 5日摘取充分伸展的幼嫩叶片 , 用液氮速冻 , 保存于 - 80 ℃备用。拟
南芥 (A rabidopsis tha liana) 材料采用生态型 Columbia ( Col) 的莲座叶。番茄 (L ycopersicon escu len2
tum ) 转化采用栽培品种 ‘中蔬四号 ’。
112　菌株和质粒
植物双元载体 pB I121和根癌农杆菌菌株 LBA4404为本实验室保存 , T/A克隆载体 pMD182T购自
TaKaRa公司 (中国大连 )。
113　化学试剂和工具酶类
限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及 RT2PCR试剂盒为 Promega公司产品。AMV反转录酶和 LA
Taq耐高温 DNA聚合酶购自 TaKaRa公司。其它主要化学试剂为美国 Sigma公司或国产 AR级试剂。
PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。
114　总 RNA提取和 cD NA克隆
拟南芥和苹果的总 RNA提取分别采用 Trizol试剂法和 CTAB方法 (Chang et al. , 1993)。取 2μg
总 RNA , 用 oligo ( dT) 引物进行反转录。根据 GenBank公布的序列 (M dFT为 AB161112, A tFT为
NM105222) , 设计了两对引物 , 一对为 MdFT5 ( 5′2ATGCCTAGGGATAGGGACC23′) 和 MdFT3 ( 5′2
TTATCTTCTCCTTCCACCGG23′) ; 另一对为 A tFT5 (5′2GATGTCTATAAATAT AAGAGACCCTC23′) 和 A t2
FT3 (5′2TCTAAAGTCTTCTTCCTCCGCAGC23′) , 分别用于苹果 M dFT和拟南芥 A tFT (即 FT ) 的 RT2
PCR扩增。反应条件均为 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃变性 45 s, 54 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s, 35个
循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 m in。将扩增出的特异片段连接到克隆载体 pMD182T上 , 进行序列测定。
115　载体构建、番茄遗传转化和鉴定
通过测序确认序列正确后 , 将 M dFT和 A tFT分别插入植物表达载体 pB I121, 获得植物表达载体
35S: : MdFT和 35S: : A tFT。然后转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 , 筛选连接产物 , 提取质粒 , 用冻
融法将质粒导入根癌农杆菌 LBA4404感受态细胞中 (Chen et al. , 1994)。挑取单菌落进行 PCR验证 ,
确认正确后 , 采用农杆菌浸染法对番茄进行遗传转化。
获得抗生素卡那霉素抗性再生植株后 , 从抗性植株中分别提取 DNA和 RNA , 采用 PCR和半定量
RT2PCR法对抗性植株进行鉴定 , 确定转基因植株。进行 PCR 检测时 , 用引物 Np tⅡ5 ( 5′2GTG2
GAGAGGCTATTCGGCTATGACTG23′) 和 Np tⅡ3 ( 5′2AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC23′) 扩增
N ptⅡ基因片段 ; 用 CaMV 35S的通用引物 35 s (5′2CGCACAATCCCACTATCCTT23′) 和目的基因下游
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引物 M dFT3或 A tFT3扩增目的基因 M dFT或 A tFT片段。进行半定量 RT2PCR检测时 , 用组成型表达
的β2ACTIN 基因检测反转录效果 , 并作为上样量对照 , 上下游引物分别为 Actin5 (5′2CTTCAGTCCA2
CAATCGGTGG23′) 和 Actin3 ( 5′2CATTCCGAGTTGAGCTGCTG23′)。将转基因再生植株移到温室后 ,
统计形成第 1朵的节位数 , 与对照非转基因再生植株比较 , 判断其是否早花。
2　结果与分析
211　目的基因的克隆和表达载体构建
用 M dFT基因特异引物 MdFT5和 MdFT3, 从 ‘嘎拉 ’苹果叶片 cDNA中扩增到约 530 bp的目的
片段 , 与已公布序列大小相符 (图 1, A )。将其插入 pMD182T载体 , PCR鉴定并测序确认 , 发现
M dFT基因全长为 525 bp, 包含完整的开放阅读框 , 编码 174个氨基酸残基 , 在氨基酸水平上与 A tFT
的同源性达 7216%。同时 , 用 A tFT基因特异引物 A tFT5和 A tFT3, 从拟南芥叶片 cDNA中克隆了
A tFT做阳性对照 (图 1, A)。然后 , 用 X baⅠ、S a lⅠ进行双酶切并电泳 , 分别回收目的基因 M dFT和
A tFT; 同时 , 用相同的限制性内切酶消化植物表达载体 pB I121, 并电泳回收切除 GUS基因的 pB I121
空载体 , 最后用 T4DNA连接酶将两个目的基因分别与空载体相连 (图 1, B ) , 连接产物分别转化大
肠杆菌 DH5α感受态细胞。用 35S和 MdFT3对可能含有 35S: : MdFT载体的单菌落进行 PCR检测 ,
获得大小约 560 bp的预期目的片段 ; 用 35S和 A tFT3对可能含有 35S: : A tFT载体的单菌落进行 PCR
检测 , 也获得大小约 560 bp的预期目的片段 ; 用 Np tⅡ5和 Np tⅡ3对两种菌落进行 PCR检测 , 均获
得了 550 bp的预期目的片段 (图 1, A) , 说明目的基因已经插入表达载体 , 植物表达载体 35S: : MdFT
和 35S: : A tFT构建成功 (图 1, A )。
从大肠杆菌提取质粒后 , 分别导入根癌农杆菌 LBA4404感受态细胞 , 挑取单菌落进行 PCR检测 ,
结果与对大肠杆菌进行的检测结果相似 , 表明表达载体已经转化入农杆菌 LBA4404中。
图 1　M dF T和 A tF T基因的克隆及其表达载体构建
A: M, DL2000 DNA分子量标记 ; 1和 5, M dFT扩增条带 (模板分别为苹果叶片 cDNA和 35S: : MdFT载体 ) ;
2和 6, A tFT扩增条带 (模板分别为拟南芥叶片 cDNA和 35S: : A tFT载体 ) ; 3和 4, N ptⅡ扩增条带
(模板分别为 35S: : MdFT载体和 35S: : A tFT载体 )。B: 35S: : M dFT /A tFT基因植物表达载体构建示意图。
F ig. 1　C lon ing and expression vector con struction of M dF T and A tF T genes
A: M, DL2000 DNA marker; 1 and 5, PCR p roducts of M dFT from app le leaf cDNA s and 35S: : MdFT construct, respectively;
2 and 6, PCR p roducts of A tFT from A rabidopsis leaf cDNA s and 35S: : A tFT construct, respectively;
3 and 4, PCR p roducts of N ptⅡ from 35S: : MdFT and 35S: : A tFT constructs, respectively.
B: An illustration for the construction of p lant exp ression vector 35S: : MdFT and 35S: : A tFT.
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212　转基因番茄抗性芽的获得
取 8～10 d番茄无菌苗中段子叶 , 置 MS培养基上预培养 1 d。用含有 35S: : MdFT或 35S: : A tFT
质粒的根癌农杆菌 LBA440 (OD600≈ 015) 菌液侵染子叶 5～8 m in, 灭菌滤纸吸干多余菌液 , 重新放
回看护 MS培养基 , 黑暗条件下共培养 2 d。2 d后将子叶转移至筛选培养基上 (MS + ZT 110 mg·L - 1
+ Cef 500 mg·L - 1 + Km 100 mg·L - 1 ) , 每 15 d继代一次。当抗性再生芽长至 1 cm时 , 将芽切下 ,
转移至生根培养基 (MS + 011 mg·L - 1 IAA + Cef 300 mg·L - 1 + Km 50 mg·L - 1 ) 中诱导生根。分别
获得了 19株 35S: : MdFT和 15株 35S: : A tFT Km抗性植株。生根培养 3～4周后移栽到育苗钵。
213　转基因番茄的 PCR检测和半定量 RT2PCR分析
对全部 Km抗性植株和非转化再生植株 (阴性对照 ) , 分别抽提总 DNA作为各自模板 , 以相应质
粒作阳性对照 , 通过 PCR方法扩增再生植株中的 N ptⅡ、M dFT和 A tFT基因。结果表明 , 非转化阴性
对照植株 DNA的 PCR没有扩出任何条带 ; 19株 M dFT基因的 Km抗性植株中 , 有 16株可同时扩增
出约 550 bp和 560 bp的 N ptⅡ和 M dFT基因片段 ; 而 15株 A tFT基因的 Km抗性植株中 , 有 12株可同
时扩增出相应大小的片段 (图 2, A)。表明 M dFT或 A tFT已经整合进这些阳性植株的基因组中。
对可同时扩增出 N ptⅡ和 M dFT /A tFT基因片段的再生植株和非转化再生植株 , 各自抽提总 RNA ,
反转录合成 cDNA第一链 , 然后进行 PCR扩增。电泳结果显示 , 有 5株小苗扩出了 560 bp左右的
M dFT基因片段 , 有 4株小苗扩出了 560 bp左右的 A tFT基因片段 , 而阴性对照没有条带 , 说明外源
基因已经在这些阳性转基因番茄中转录表达 (图 2, B)。
图 2　转基因植株的 PCR检测 ( A) 和半定量 RT2PCR检测 ( B)
A: M, DL2000 DNA分子量标记 ; 1, 质粒 (阳性对照 ) ; 2～4, 转 35S: : MdFT基因的不同植株 ;
5～7, 转 35S: : A tFT基因的不同植株 ; 8, 非转基因植株 (阴性对照 )。
B: M, DL2000 DNA分子量标记 ; 1, 非转基因植株 : 2～4, 转 35S: : MdFT基因的不同植株 ;
5～7, 转 35S: : A tFT基因的不同植株。
F ig. 2　PCR ( A) and sem iquan tita tive RT2PCR ( B) checks of tran sgen ic plan ts
A: M is DL2000 DNA marker; lane 1, p lasm id (positive control) ; 2 - 4, different 35S: : MdFT transgenic lines;
5 - 7, different 35S: : A tFT transgenic lines; 8, non2transgenic p lant ( negative control) .
B: M, DL2000 DNA marker; 1, non2transgenic p lant; 2 - 4, different 35S: : MdFT transgenic lines;
5 - 7, different 35S: : A tFT transgenic lines.
214　转基因番茄出现早花现象
正如所期望的那样 , 转基因番茄植株表现出了早花现象。部分 35S: : A tFT转基因植株在生根培
养基中就能进行花芽分化 , 形成花蕾 (图 3, C)。个别 35S: : MdFT转基因植株也能在生根培养基中
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形成花蕾 , 只是频率低于 35S: : A tFT转基因植株 (图 3, A )。将生根小苗移栽到温室中 , 转基因植
株能在很低的节位上 (第 4～9节位 ) 形成花器官 (图 3, B ) , 在 5株 35S: : MdFT转基因植株中 ,
花芽分别为第 4、8、11、7和 9节位形成 , 在 4株 35S: : A tFT转基因植株中 , 花芽分别为第 8、11、
6和 7节位形成 , 而在 10株非转基因再生对照植株中 , 均在第 11节位以上形成花芽 (表 1)。说明在
番茄中异位过量表达苹果 M dFT基因和拟南芥 A tFT基因 , 能导致番茄出现早花现象 , 但苹果 M dFT
基因在促进番茄提早开花方面的效果略逊于拟南芥 A tFT基因。
图 3　转基因番茄的早花现象
A: M dFT转基因番茄生根苗的早花现象 ; B: 温室中生长的 M dFT转基因番茄的低节位成花现象 ;
C: A tFT转基因番茄在培养基上的早花现象 ; 箭头指示成花位置。
F ig. 3　Tran sgen ic toma toes flowered early
A: M dFT2overexp ressing seedling set flowers at the base of stem ( flowers formed on rooting medium) ;
B: M dFT2overexp ressing seedling formed flower at a relative low2node position, grown under glasshouse conditions;
C: A tFT2overexp ressing seedling showed extremely early flowering ( flower formed on rooting medium).
A rrowheads in A, B and C indicated the positions of flowers.
表 1　转基因番茄不同开花节位的株数
Table 1　The num ber of plan t of d ifferen t flower setting node in tran sgen ic toma toes
植株
Plants
总株数
Total number
开花节位 Number of flower setting node
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
对照 Control 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 3
35S: :MdFT 5 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0
35S: : A tFT 4 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0
3　讨论
高等植物的花芽形成是一个十分复杂的过程 , 目前普遍认为存在着 4条发育途径 , 即光周期途
径、自主途径、春化途径和 GA途径 , 这些途径之间又存在着复杂的调节网络 , 单独或共同决定花的
形成与否 , 这或许是常规方法难以缩短童期的原因。但是遗传学研究表明 , 这些调节途径存在着几个
共同的整合因子 ( Yoo et al. , 2005) , 如 CO、FT、SOC1、LFY和 AP1等 , 且单个整合因子的异位过
量表达可能极大地缩短多年生木本植物的童期 , 使其在短时间内开花结果 (W eigel & N ilsson, 1995;
Penàet al. , 2001)。然而 , 许多转基因试验也表明 , 由于不同种类的植物对密码子有着不同的偏好性
及一些尚未明确的原因 , 有时在植物体内过量表达外源基因效果并不理想 (N ilsson & W eigel,
1997) , 因此还需要不断挖掘相应植物的自身基因 , 并对其进行功能鉴定。转基因研究还表明 , 促进
开花的基因很可能会同时对花和果实的发育产生影响 ( Kardailsky et al. , 1999; Endo et al. , 2005) ,
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因此将其导入以果实为收获对象的植物时 , 应选择适合于果实性状研究的模式植物作为受体材料。
在拟南芥中 , A tFT基因的功能和作用机理已经得到广泛的研究 , 其基因表达产物已被证明是
“成花素 ”物质 ( Corbesier et al. , 2007; Jaeger & W igge, 2007; Mathieu et al. , 2007; Yang et al. ,
2007) , 这必将会对植物的育种研究产生深远的影响 ( Kobayashi & W eigel, 2007)。近年来 , 多年生
木本植物的开花相关基因也在不断地得到克隆和鉴定 , 其中 , A tFT基因在杨树、柑桔和苹果中的同
源基因已经得到克隆 , 而且 BÊhlenius等 (2006) 的研究已经揭示了杨树 CO / FT基因的特异时空表达
对其季节性生长和花芽形成具有调控作用。但目前尚无报道表明 FT蛋白在木本植物的叶片中合成
后 , 可以作为 “成花素 ”物质 , 被长距离运输到枝梢顶端或腋芽处促使植物开花 , 同样地 , 其运转
过程中是否有辅助因子参与也还不清楚。
本研究克隆的 M dFT序列包含完整的 OR F, 在氨基酸水平上与 A tFT高度同源。遗传转化的结果
进一步表明 , 两个基因在转基因番茄植株中都得到了表达 , 转基因番茄均表现出早花性状 , 相比之
下 , 拟南芥 A tFT比苹果 M dFT的转基因效果更明显。转化模式植物番茄 , 有利于同时对苹果 M dFT
和拟南芥 A tFT两个不同来源的同源基因进行比较 , 然而 , 要充分理解 M dFT基因在苹果发育中 (尤
其是开花结果方面 ) 的功能 , 证明其 “成化素 ”的本质 , 还需要通过苹果遗传转化来获得更直接的
结果和证据 , 相关研究正在进行当中。
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