全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（7）：1073–1078
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–09–18；修回日期：2010–04–29
基金项目：农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence (E-mail：wangxw@mail.caas.net.cn)
黄瓜营养体苦味基因 Bi的定位
李 曼 1,2，龚义勤 1，苗 晗 2，武 剑 2，顾兴芳 2，张圣平 2，王晓武 2,*
（1南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
北京 100081）
摘 要：以黄瓜（Cucumis sativus L.）营养体无苦味的材料 9110Gt（bibi）与有苦味的材料 9930（BiBi）
为亲本，对以两亲本构建的 148个株系的 RILs群体进行 SSR标记的遗传连锁分析，对 Bi基因进行初步定
位，两侧翼标记 SSR19672和 SSR00004与 Bi基因的连锁距离分别为 4.4和 3.4 cM。利用两侧翼标记筛选
以相同亲本构建的 1 815株的 F2群体中的重组单株，结合黄瓜基因组测序的结果及生物信息学的知识，在
标记区域内开发了 31对SSR标记，最终将Bi基因定位在黄瓜的第6染色体上，最近的两侧翼标记SSR02309
和 SSR00004与苦味基因分别相距 1.7和 2.2 cM。
关键词：黄瓜；营养体；苦味；Bi基因；基因定位；SSR
中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）07-1073-06

Fine Mapping of the Foliage Bitterness Gene（Bi）in Cucumis sativus
LI Man1,2，GONG Yi-qin1，MIAO Han2，WU Jian2，GU Xing-fang2，ZHANG Sheng-ping 2，and WANG
Xiao-wu2,*
（1National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，College of Horticulture，Nanjing Agricultural
University，Nanjing 210095，China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Beijing 100081，China）
Abstract: A RILs population with 148 individuals derived from a cucumber line 9110 Gt（bibi）and
9930（BiBi）was used to analyze the location of Bi gene. Bi gene was mapped on the linkage group 6,
corresponding to chromosome 6 of cucumber. The flanking markers SSR19672 and SSR00004 were linked
to the Bi gene with distances of 4.4 and 3.4 cM. An F2 population with 1 815 individuals derived from the
same parents was used for screening recombinants for fine mapping of the gene. Recombinant plants were
identified by the flanking markers SSR19672 and SSR00004. Based on the whole genome sequence of
cucumber，thirty-one SSRs within the region between SSR19672 and SSR00004 were designed and
screened for polymorphism between the two parents, which revealed that one of them（SSR02309）was 1.7
cM to Bi gene. The distance between previously identified flanking marker SSR00004 and Bi were 2.2 cM.
Key words：cucumber；foliage；bitterness；Bi gene；gene mapping；SSR

近年来，随着国内保护地黄瓜的大面积推广和利用，黄瓜苦味的问题愈来愈突出，常造成极大
经济损失。因此，选育无苦味黄瓜，对于改善黄瓜品质，提高经济效益具有重要意义。

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前人的研究显示，在不同黄瓜材料中，营养体苦味分别受 bi 和 bi-2 两对隐性基因的控制
（Andeweg & De Bruyn，1959；Wenher & Liu，1998）。有关黄瓜营养体和果实苦味的关系已开展了
一些研究。黄瓜营养器官苦味表现为独立遗传，不受控制果实苦味基因 Bt 的影响，但纯合基因型
bibi对 Bt存在隐性上位作用，当处于杂合状态 Bibi时，无论 Bt存在与否，果实都会出现苦味（顾
兴芳 等，2004，2006）。因此，寻找与营养体苦味基因紧密连锁的分子标记和苦味基因的精细定位
对于无苦味黄瓜的育种工作将有很重要的意义。
关于黄瓜营养体苦味基因的分子标记的研究，池秀蓉等（2007）以黄瓜纯合自交系 9110Gt（bibi）
和 03828（BiBi）为双亲构建的 F2群体为试材，获得了与营养器官无苦味位点连锁距离为 6.43 cM
的 AFLP分子标记，并将其转化为 SCAR标记。但该标记与目标基因连锁距离较长，还不能直接用
于标记辅助选择中。
本研究中以黄瓜纯合自交系 9110Gt（bibi）和 9930（BiBi）构建的 RILs 和 F2群体为试材，开
展对黄瓜营养体苦味基因 Bi 的精细定位，以期获得能够直接用于标记辅助选择的 PCR 标记，以利
于苗期无苦味品系的选育，从而提高育种效率，缩短育种年限。
1 材料与方法
1.1 材料
试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所完成。RILs群体为自交9代的重组自交系，有148个株系；
F2群体包括1 815个单株。群体的母本9110Gt为欧洲温室型，营养器官不苦；父本9930为华北保护地
型，营养器官苦。RILs群体与F2群体分别于2007年8月和2008年3月种植于中国农业科学院蔬菜花卉
研究所日光温室。SSR引物来源于国际黄瓜全基因组测序项目。
1.2 方法
1.2.1 营养器官苦味的调查
采用感官品尝的方法调查营养器官苦味。品尝分2 ~ 3次，苗期品尝子叶1次，成株期品尝真叶或
卷须1 ~ 2次，以验证与苗期品尝结果的一致性, 若不一致增加品尝次数。
1.2.2 总DNA的提取
幼苗长出2 ~ 3片真叶时，取植株叶片放在冷冻真空干燥机中冷冻干燥 48 h，冷冻干燥的植物样
品研磨成粉末。基因组DNA的提取采用CTAB法（Murray & Thompson，1980）。
采用优化的 15 µL PCR反应体系：H2O 7.4 µL ，10 × buffer 1.5 µL，dNTPs（2.5 mmol · L-1）0.75
µL，每条引物（5 pmol · µL-1）0.6 µL，Taq DNA聚合酶（2.5 U · µL-1）0.15 µL，DNA（50 ng · µL-1）
4 µL；扩增程序为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 15 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 30 s，共循环 35
次，最后 72 ℃延伸 5 min。扩增反应在 9700PCR（Applied Biosystem公司）仪上进行。PCR扩增产
物的检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，用 8% 聚丙烯酰胺凝胶在六一仪器厂的垂直电泳槽上进行，160
V恒电压下电泳 2 h，电泳后参照乐晓萍等（2001）的方法银染。
1.2.3 结果统计
以亲本带型做为标准，与父本9930一致的带型记为a，与母本9110Gt一致的带型记为b，杂合型
的条带类型记为h，条带缺失记为u。
1.2.4 苦味基因的定位
利用JoinMap4.0软件（http://www.kyazma.nl）进行连锁分析与图谱构建。苦味基因定位的过
7期 李 曼等：黄瓜营养体苦味基因 Bi的定位 1075

程包括3步：1）首先调查RILs群体的苦味性状，用JoinMap4.0作图软件将苦味基因定位到连锁图谱
上，找到与Bi基因两侧连锁最近的标记；2）对F2群体进行侧翼标记多态性分析，再结合F2群体的苦
味性状调查，利用JoinMap4.0软件构建连锁群，得到局部连锁图，将Bi基因定位在连锁图上，并确
定重组单株；3）根据9930的基因组序列及Bi基因定位的连锁图，在界定的区域内开发新标记，利用
新标记对重组单株进行连锁分析，将苦味基因定位在更狭窄的范围内，完成Bi基因的定位。
2 结果与分析
2.1 苦味基因Bi的遗传分析
RILs群体共有148株，有85株表现不苦，63株表现苦，经卡方检测，符合1︰1的Mendel遗传分离
比例；F2群体共有1 815株，1 361株表现苦，454株表现不苦，经卡方检测，符合3︰1的Mendel遗传
分离比例。说明营养体苦味对不苦由单显性基因（Bi）控制，苦味性状可以按照质量性状进行分析
和基因定位。
2.2 侧翼标记筛选与初步定位
将苦味性状作为表型标记，将RILs群体苦味性状的调查数据转换为标记数据，结合已有的连锁
图谱，利用JoinMap4.0作图软件将Bi基因定位到已有连锁图谱的连锁群上，对应第 6 染色体（图1）。
Bi基因两侧最近的标记分别为SSR23471、SSR19672、SSR00004和SSR00019（表1），与Bi基因的距
离分别为 7.8、4.4、3.4和4.1 cM。
根据黄瓜全基因组测序的信息，确定标记 SSR19672 和 SSR00004 在基因组中的位置，在两个
标记之间的区域设计新的 SSR 引物，共 31 对。经过亲本间多态性检测，仅有一个标记 SSR02309
（表 1）在组配亲本中存在差异。
用 SSR02309 进一步对重组单株进行检测，并对这些标记与苦味基因的连锁距离进行了分析，
得到局部连锁图（图 1）。发现 SSR19672与 SSR02309位于一侧，与 Bi基因的距离分别为 3.7与 1.7
cM，SSR00019与 SSR00004位于另一侧，与 Bi基因的距离为 2.3与 2.2 cM。
表 1 Bi基因连锁的 SSR引物序列
Table 1 Primer sequence of SSRs linked to Bi gene
引物名称
Name
引物序列
Primer sequence（5′–3′）
引物长度/bp
Length
SSR23471-F TCATGGAAATCTCTACGCTATTTG 24
SSR23471-R TCACTGCTCCACGAAGCTAA 20
SSR19672-F AAGGCAGCAGAAAACTTGGA 20
SSR19672-R CCCTCACTCTCGCTCACTCT 20
SSR00019-F ATTCTCGTGAACCATCACCC 20
SSR00019-R ACTTTTGCCACTTGGCACTT 20
SSR00004-F TTCATTGCAAAGCACACACA 20
SSR00004-R TGAAAAGAGGGAACAAAAGCA 21
SSR02309-F TGAAATGCCTCTGCAATGAC 20
SSR02309-R TCATGACTAGACACGCCAGC 20
注：F：上游引物；R：下游引物。
Note：F：Forward primer；R：Reverse primer.
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图 1 Bi基因在RILs和F2群体中连锁图
Fig. 1 The linkage map of Bi gene in RILs and F2 populations
2.3 F2群体重组单株筛选
首先利用 RILs群体中找到的侧翼标记对 1 815个单株的 F2群体进行了重组单株的筛选。根据
RILs群体构建的连锁图，与 Bi基因最近的两侧翼标记为 SSR19672与 SSR00004。
使用上述两个侧翼标记对所有 1 815个单株进行检测，发现 156个重组单株。这些重组单株可
以分为 7种不同的重组形式（表 2），其中表现重组型 2的单株最多，有 49株。
表 2 重组单株的标记基因型和植株表现型
Table 2 SSR alleles and phenotypes in recombinant plants
标记位点 SSR allele 重组单株数 Number of recombinants
植株 Plant
SSR19672 SSR02309 SSR00004
SSR19672-
SSR00004
SSR02309-
SSR00004
苦味性状
Bitterness
9110Gt bb bb bb bibi
9930 aa aa aa BiBi
重组型 1 Recombinant 1 aa aa bb 2 1 Bibi
重组型 2 Recombinant 2 aa aa ab 49 30 Bibi
重组型 3 Recombinant 3 ab ab aa 35 24 Bibi
重组型 4 Recombinant 4 ab ab bb 12 9 Bibi
重组型 5 Recombinant 5 ab ab bb 25 13 bibi
重组型 6 Recombinant 6 bb bb ab 27 10 Bibi
重组型 7 Recombinant 7 bb bb ab 4 4 bibi
总计 Total 156 91
注：a：9930等位位点；b：9110Gt等位位点。
Note：a：9330 allele；b：9110Gt allele.
7期 李 曼等：黄瓜营养体苦味基因 Bi的定位 1077

根据重组单株计算SSR19672与SSR00004的连锁距离为5.9 cM，比RILs这两个标记间的遗传距
离7.8 cM略小。SSR00004与Bi基因之间在 F2群体的遗传距离为2.2 cM，SSR19672与Bi基因之间在
F2群体的遗传距离为3.7 cM，均比这两个标记与Bi基因在RILs群体的遗传距离稍小。
初步定位后，得到的一个与SSR19672位于同一侧，且距离Bi基因更近的标记SSR02309，重
新利用SSR02309与SSR00004两侧翼标记进行重组单株筛选，发现91株重组单株。这些重组单株
可以分为与之前相同的7种重组形式（表2）。其中表现重组型2的单株最多，有30株。与之前的
重组型相比，各种类型的数量除重组型7外均有所减少，共减少数量是65株，距离Bi基因的距离
也缩短了2.0 cM。
3 讨论
黄瓜苦味性状遗传和苦味基因的研究已有较多报道（Barham，1953；DaCosta & Jones，1971；
De Ponti，1980；Inggamer & De Ponti，1981；Lawrence & Wehner，1990；Kano et al.，1997），荷兰
育种家已于 1959年从美国改良长绿品种中筛选出完全无苦味的黄瓜品系，并报道它是由一个隐性基
因 bi控制的，现在荷兰所推广的温室黄瓜品种植株中均不含苦味素。池秀蓉等（2007）找到了与黄
瓜营养器官无苦味 bi基因连锁的距离为 6.43 cM的 AFLP标记，是国内外首次报道的与黄瓜无苦味
基因位点紧密连锁的分子标记，但精细定位及基因克隆方面的研究都未见报道。本研究利用 F2群体
和 SSR分子标记将营养体苦味基因 Bi定位在黄瓜第 6染色体的 3.9 cM的范围内，双侧翼标记的距
离分别为 1.7和 2.2 cM。
本研究在初始定位时，所用的是自交 9代、148个株系的 RILs群体，基于 RILs群体自身的特
点，这样一个群体用于构建遗传图谱，其所表达的信息量是足够的。但 Bi基因定位之后，其最近的
两侧翼标记 SSR00004与 SSR19672的距离为 7.8 cM，两标记之间发生交换的重组单株却只有十几
株，利用这些重组单株来进一步进行精细定位，其所包含的信息量是远远不够的。为了检测到更多
的交换事件就需要更大的分离群体，因此构建了 1 815株的 F2分离群体。利用 SSR00004与 SSR19672
对 F2群体进行 SSR分析后作图，在两个标记之间检测到重组单株 156株。而更近的标记 SSR02309
与 SSR00004之间，遗传距离缩短到 3.9 cM，两标记之间依然检测到重组单株 91株。这也是后续精
细定位工作的基础。
本试验亲本之一 9930 的全基因组进行了测序，基于基因组测序的结果开发了一大批的 SSR 分
子标记，SSR是一种非常好的锚定标记，由于其共显性的特征，可以检测出复等位基因的变异和区
分纯合杂合基因型。本研究中，为了进一步精细定位而构建了一个扩大的 F2群体，F2是分离的群体，
纯和株与杂合株共存。显性标记无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。本研究所用的 SSR分子标
记为共显性标记，可以识别杂合基因型，对重组单株的筛选起到了至关重要的作用。试验所确定的
重组类型共有 7 种，其中有 6 种是基于杂合基因型来分辨的。如果仅用显性标记来筛选，重组型 2
和重组型 3则无法分辨，对重组单株的筛选将会造成偏差。
黄瓜因其具有基因组小（约 370 Mb），染色体数少（n = 7），生长周期短等特点，使得其在分
子标记辅助育种上很有优势。本研究通过遗传连锁图法获得了 4 个与 Bi 基因紧密连锁的分子标记
SSR19672、SSR02309、SSR00004和 SSR00019，它们与 Bi基因的遗传距离小于 6 cM，利用这些标
记可以不受环境和发育时期的影响，在苗期就可以辅助选育无苦味品系，从而提高育种效率，缩短
育种年限。
SSR02309与 SSR00004是目前为止所报道的距离营养体苦味基因 Bi最近的两个标记，且为 SSR
标记，稳定性比较好，从而为该基因的进一步精细定位奠定了良好的基础。
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