全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2010, 37 (1) : 1 - 8
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 28; 修回日期 : 2009 - 11 - 04
基金项目 : 国家自然科学基金青年基金项目 (30700549)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: haoyujin@ sdau1edu1cn; Tel: 053828246692)
苹果果实中苹果酸代谢关键酶与苹果酸和可溶性糖
积累的关系
姚玉新 1 , 李　明 1 , 由春香 1 , 刘　志 2 , 王冬梅 2 , 郝玉金 13
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 国家苹果工程技术研究中心 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018;
2 辽宁省果树科学研究所 , 辽宁熊岳 115009)
摘 　要 : 以 ‘东光 ’ ב富士 ’苹果杂交后代为试材 , 研究苹果果实中苹果酸代谢关键酶与苹果酸和
可溶性糖积累的关系。结果表明 , 负责苹果酸合成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( PEPC)、细胞质 NAD依赖
的苹果酸脱氢酶 ( cyMDH) 和负责苹果酸跨膜运输的 H + - 焦磷酸酶 (VHP) 在高、低酸苹果果实成熟过
程中活性没有明显差异 , 而负责苹果酸跨膜运输的 H + 2ATPase酶 (VHA) 在高酸果实中有较高的活性 , 负
责苹果酸降解的细胞质 NADP依赖的苹果酸酶 ( cyME) 和 ATP依赖的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 ( PEP2
CK) 则在低酸果实中有较高的活性。还从苹果酸向可溶性糖转化的角度探讨了苹果酸代谢关键酶对可溶性
糖积累的影响。
关键词 : 苹果 ; 苹果酸代谢关键酶 ; 糖、酸积累
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2010) 0120001208
Rela tion sh ip Between M a lic Ac id M etabolism 2rela ted Key Enzym es and
Accum ula tion of M a lic Ac id a sW ell a s the Soluble Sugars in Apple Fru it
YAO Yu2xin1 , L IM ing1 , YOU Chun2xiang1 , L IU Zhi2 , WANG Dong2mei2 , and HAO Yu2jin13
(1 College of Horticu ltura l Science and Engineering, Shandong A gricu ltura l U niversity, N a tional Research Center for A pple Eng i2
neering and Technology, S tate Key L abora tory of C rop B iology, Taipian, Shandong 271018, Ch ina; 2 L iaoning Institu te of F ruit
Tree Science, X iongyue, L iaoning 115009, Ch ina)
Abstract: The relationship between activity of malic acid metabolism 2related key enzymes and accumula2
tion of malic acid as well as the soluble sugars was investigated by the hybrid from the crossing between app le
cultivar‘Dongguang’ and ‘Fuji’. The results showed that cytosolic phosphoenolpyruvate carboxylase
( PEPC) and NAD2dependent malate dehydrogenase ( cyMDH) , imp licated in malic acid (MA ) synthesis in
the cytosol, and vacuolar H + 2pyrophosphatase (VHP) , imp licated in MA storage in the vacuole, exhibited no
significant difference between the high2 and low2acid app le fruits. W hereas, vacuolar H + 2ATPase (VHA ) ,
involved in MA storage in the vacuole, had much higher enzyme activity in the high2acid fruit, while MA deg2
radation2related cytosolic NADP2dependent malic enzyme ( cyME) and ATP2dependent phosphoenolpyruvate
carboxylase kinase ( PEPCK) exhibited high enzyme activities in the low2acid fruit. In addition, the effects of
these key enzymes on the accumulation of soluble sugars were discussed in term s of the transformation of malic
acid into sugars.
Key words: app le; key enzymes involved in malic acid metabolism; accumulations of malic acid and the
soluble sugars
苹果果实中最主要的有机酸是苹果酸 , 主要的可溶性糖是果糖、葡萄糖和蔗糖。许多研究认为苹
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果果实中苹果酸含量由一对主效基因控制 , 纯合个体表现为极端酸或甜 (Nybom, 1959; V isser et
al. , 1968; V isser, 1978) ; 低酸性状表现为隐性 (V isser, 1978; Maliepaard et al. , 1998)。苹果果
实酸度相关基因 M a被定位在 ‘Prima’בFiesta’的遗传图谱上 (Maliepaard et al. , 1998) ; AFLP
标记 E31M3820193、SSR标记 CH05e04z (L iebhard et al. , 2003) 和 SDY085 (姚玉新 等 , 2006) 被
证明与苹果的低酸性状连锁。
苹果果实中苹果酸的积累受苹果酸代谢关键酶的调控。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( PEPC) 和细
胞质 NAD依赖的苹果酸脱氢酶 ( cyMDH ) 主要负责苹果酸的合成 ( Chollet et al. , 1996; M iller et
al. , 1998) , 细胞质 NADP依赖的苹果酸酶 ( cyME) 和 ATP依赖的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶
( PEPCK) 负责苹果酸的降解 (Ruffner, 1984; Knee & Finger, 1992; Ahmad et al. , 2001) , 其中苹
果酸被 PEPCK催化生成 PEP后可以通过糖异生作用转化为糖。苹果酸液泡积累需要的能量主要来自
液泡膜上的两个质子泵 , 即 H + 2ATPase (VHA) 和 H + -焦磷酸酶 (VHP) (Maeshima, 2000; Ratajc2
zak, 2000) , 但具体的作用机制目前还不清楚。
作者拟通过测定苹果酸代谢关键酶的活性来分析其在苹果果实苹果酸积累过程中的作用 , 尤其是
对苹果酸积累差异形成的影响 , 并探讨这些酶是否与控制果实低酸性状的基因存在关系 ; 同时从苹果
酸向糖转化和碳源竞争的角度来分析这些酶对可溶性糖积累的影响。
1　材料与方法
111　植物材料及取样方法
试验材料来自 ‘东光 ’ב富士 ’苹果 (辽宁省果树科学研究所 ) 的杂交后代 , 共 91株 , 12年
树龄。
2004—2006连续 3年分别利用碱滴定法和蒽酮比色法测定果实可滴定酸 (姚玉新 等 , 2006) 和
总糖含量。从中选取 16株酸度不同的个体调查物候期 , 选择两株物候期相似 (5月中旬进入盛花期 ,
10月 8号左右果实成熟 ) 且在不同发育阶段具有相似单果质量的极端高酸和低酸个体 , 测定其在花
后 120和 150 d (成熟期 ) 时果肉中糖、酸和酶活性 ; 其余的 14株只测定成熟果实中的糖、酸和酶活
性。
各项指标均为每株取 4个果实 (重复 ) 进行测定 ; 取样时单果质量高于或低于平均值 5%的果实
被排除以减小取样误差。
112　苹果酸和可溶性糖分析
利用毛细管电泳仪 (Beckman P /ACE, USA ) 分别测定苹果酸和可溶性糖 (葡萄糖、果糖和蔗
糖 ) 含量。苹果酸的测试条件为 : 未涂层的毛细管 (50μm ×57 cm ) ; 应用电压为 10 kV; 压力进
样 3 s, 200 nm检测 ; 柱温 20 ℃; 缓冲体系为 100 mmol·L - 1磷酸氢二钾 + 015 mmol·L - 1十六烷基
三乙基溴化铵 (CTAB) , pH 7。糖的测试条件为 : 未涂层的毛细管 (50μm ×57 cm ) ; 应用电压为
20 kV; 压力进样 5 s, 214 nm检测 ; 柱温 20 ℃; 缓冲体系为 50 mmol·L - 1苯甲酸钠 + 1 mmol·L - 1
CTAB , pH 12。
113　酶活性测定
酶的提取和纯化主要参考 Terrier等 (2001) 和 L iu等 (2004) 的方法 : 取 10 g冷冻的果肉在冰
上加入 20 mL 预冷的提取缓冲液 〔250 mmol·L - 1山梨醇 , 125 mmol·L - 1氯化钾 , 5 mmol·L - 1乙二
醇二乙醚二胺四乙酸 , 215 mmol·L - 1偏重亚硫酸钾 , 2 mmol·L - 1苯甲基磺酰氟 , 15 g·L - 1聚乙烯
吡咯烷酮 , 1 g·L - 1牛血清蛋白 , 1 mmol·L - 1二硫苏糖醇和 50 mmol·L - 1 Hepes2Tris (pH 716) 〕研
磨成匀浆。匀浆通过 4层纱布过滤 , 4 ℃、1 000 g离心 10 m in, 取上清 , 4 ℃、50 000 g离心 1 h, 上
清液经过透析处理后分装、 - 80 ℃保存 , 作为细胞质总蛋白。沉淀重新悬浮于悬浮缓冲液 1中 〔50
2
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mmol·L - 1 Hepes2Tris, pH 716, 0125 mmol·L - 1甘露醇 , 10 mmol·L - 1氯化钾 , 1 mmol·L - 1乙二胺四
乙酸 , 1 mmol·L - 1二硫苏糖醇 〕, 然后利用 0% /30%不连续蔗糖梯度、100 000 g离心 40 m in。取界
面物质悬浮于悬浮缓冲液 2中 〔50 mmol·L - 1 Hepes2Tris, pH 716, 10 mmol·L - 1氯化钾 , 1 mmol·
L - 1乙二胺四乙酸 , 1 mmol·L - 1二硫苏糖醇和 20%甘油 〕, 分装、 - 80 ℃保存 , 作为液泡膜蛋白。
cyMDH和 cyME酶活性的测定参考 Beruter (1998) 的方法 , PEPCK的酶活性测定方法 W alker等
(2002) 的参考。PEPC活性测定参考 D iakou等 (2000) 的方法。质子泵 VHP和 VHA的活性测定根
据 L iu等 (2004) 的方法。蛋白质含量的测定利用考马斯亮蓝染色法 (B radford, 1976) , 以牛血清蛋
白作为参照。
114　统计分析
数据方差、显著性和相关性分析利用 SAS812, 其中显著性分析利用 Duncanpis新复极差法 , 1%水
平上测试。
2　结果与分析
211　高酸和低酸苹果果实成熟过程中苹果酸和可溶性糖的变化
如图 1所示 , 在成熟过程中 , 高酸果实的苹果酸含量上升了 1219% , 而低酸果实苹果酸含量下
降了 3617% , 最终导致二者成熟果实苹果酸含量差异近一倍。
成熟过程中果糖和蔗糖在两个基因型中与苹果酸积累趋势相反 , 最终成熟的低酸果实的果糖和蔗
糖含量分别比高酸果实高 0133和 214倍 ; 而葡萄糖在高酸和低酸果实中呈下降趋势 , 二者没有显著
差异。
图 1　高酸和低酸苹果果实成熟过程中苹果酸、果糖、蔗糖和葡萄糖含量的变化
F ig. 1　Changes of ma lic ac id, fructose, sucrose and glucose in fru its of
the h igh and low2ac id hybr ids a t d ifferen t developm en ta l stage
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212　不同酸度类型苹果成熟果实中可溶性糖的分布
为了检测在苹果果实中可溶性糖与苹果酸含量是否存在相关性 , 本试验分析了来自同一个杂交群
体的另外 14株后代成熟果实的葡萄糖、果糖、蔗糖和苹果酸含量。结果表明 , 苹果酸含量在 5105～
15141 mg·g- 1 FW之间 , 其中 4个后代个体果实苹果酸含量较低 , 低于 5169 mg·g- 1 FW。在不同酸
度的苹果果实中可溶性糖以果糖为主 , 且果糖在极端低酸的果实中含量相对较高 , 在极端高酸的果实
中相对较低 , 而在中酸度类型内呈单峰分布 ; 而葡萄糖和蔗糖没有明显的分布规律 (图 2, a)。
就可溶性糖之和与苹果酸含量的比值而言 , 酸度最低的 3个个体的糖酸比显著高于其它个体 , 这
3个个体内没有显著差异 ; 糖酸比总体上与苹果酸含量呈负相关 ( r = - 019023) , 并且该比值大体上
可以分为 3个差异显著的层次 , 即苹果酸含量 ≤5169 mg·g- 1 FW , 苹果酸含量从 8153到 10110 mg·
g- 1 FW , 苹果酸含量 ≥10138 mg·g- 1 FW , 尤其是低酸果实中该比值明显高于其它类型 , 说明低酸果
实中糖含量相对较高 (图 2, b)。
图 2　成熟的不同酸度苹果果实中可溶性糖的分布 ( a) 和可溶性糖与苹果酸的含量比 ( b)
F ig. 2　The soluble sugar con ten ts in apple fru its of d ifferen t ma lic ac id ( a) and
the ra tio of the soluble sugars to ma lic ac id ( b)
213　高酸和低酸苹果果实成熟过程中苹果酸代谢关键酶的活性变化
在高酸和低酸两个基因型苹果果实成熟过程中 , 负责苹果酸合成的 PEPC和 cyMDH酶的活性增
加 , 高酸基因型与低酸基因型没有显著差异 (图 3, a、b)。从 cyMDH /PEPC比值来看 , cyMDH的活
性在两个基因型果实成熟过程中所占比例都升高 , 表明 cyMDH在果实成熟过程中起到更加重要的作
用 (表 1)。
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与此类似 , 质子泵 VHP在两个基因型果实成熟过程中活性增加 , 高酸基因型与低酸基因型没有
显著差异 (图 3, c) ; 而另一个质子泵 VHA在两个基因型果实成熟过程中也都增加 , 但增加的幅度
不同最终导致 VHA活性在两个基因型间存在显著差异 , 在花后 120 d和 150 d高酸基因型比低酸基因
型分别高出 1121和 412倍 (图 3, d) ; 就 VHA /VHP活性比值而言 , 在低酸基因型成熟过程中几乎
没有变化 , 而在高酸基因型中比值升高了一倍以上 , 表明成熟过程中 VHA对苹果酸的积累起到更为
重要的作用 (表 1)。
苹果酸降解相关的 cyME和 PEPCK在两个基因型果实成熟过程中活性增加 , PEPCK在花后 120
和 150 d的低酸果实中表现出了明显高的活性 , 分别比高酸果实高出了 119和 112倍 (图 3, e) ;
cyME在成熟的低酸基因型果实中活性也显著高于高酸基因型 (图 3, f) ; 这表明在果实成熟过程中
低酸果实苹果酸降解多。
图 3　高酸和低酸苹果果实成熟过程中 PEPC ( a)、cyMD H ( b)、VHP ( c)、
VHA ( d)、PEPCK ( e) 和 cyM E ( f) 的活性变化
F ig. 3　Enzym e activ ities of PEPC ( a) , cyMD H ( b) , VHP ( c) , VHA ( d) , PEPCK ( e) and
cyM E ( f) dur ing fru it r ipen ing of the h igh2and low2ac id hybr ids
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表 1　苹果果实成熟过程中各种酶活性比值
Table 1　Ra tios of enzym e activ ities dur ing r ipen ing of apple fru it
果实
fruit
花后天数 / d
Day after anthesis cyMDH /PEPC VHA /VHP PEPCK/cyME
高酸 H igh2acid 120 0151 ±0103 B 1101 ±0106 B 0133 ±0103 A
150 1101 ±0107 A 2115 ±0113 A 0128 ±0102 A
低酸 Low2acid 120 0156 ±0103 B 0145 ±0102 A 0113 ±0102 A
150 0189 ±0111 A 0145 ±0103 A 0120 ±0102 A
214　不同酸度类型苹果成熟果实中 VHA、PEPCK和 cyM E的活性
为了检测 VHA、PEPCK和 cyME的活性在其它不同酸度类型苹果果实中是否存在差异 , 分别测
定了这 3种酶在来自同一个杂交后代的另外 14株个体中的活性。
结果表明 , 3种酶的活性在苹果酸含量最低的 4个低酸果实中明显不同于其它果实 , 其中 cyME
和 PEPCK活性明显高 , 且二者表现出相似的变化模式 ; 而 VHA在低酸果实中明显较低。在其它中酸
或高酸果实中 cyME和 VHA活性变化没有明显规律 , 而 PEPCK的活性整体上与苹果酸的含量呈负相
关 ( r = - 019451) , 表明更多的有机酸转化为糖 (图 4)。
图 4　成熟的不同酸度类型苹果果实中 VHA、PEPCK和 cyM E的活性变化
F ig. 4　Enzym e activ ities of VHA, PEPCK and cyM E in r ipened apple fru its of d ifferen t
con ten t of ma lic ac id
3　讨论
本试验利用同一苹果杂交群体的后代个体分析苹果酸代谢关键酶与苹果酸和可溶性糖积累的关
系 , 相似的遗传背景、差异显著的酸、糖含量既有利于比较又避免了遗传背景不同带来的差异。
尽管糖、酸是苹果的基本农艺性状 , 但糖、酸代谢的相互作用目前仍然不清楚。本试验结果显
示 , 蔗糖、葡萄糖和果糖之和与苹果酸的比值随着苹果酸含量的增加呈下降趋势 , 并且大体上可以分
为 3个差异显著的阶段 , 说明苹果酸和糖存在碳源上的竞争关系 , 尤其是在低酸度的果实中该比值明
显偏高 , 说明低酸果实中糖含量相对较高 ; 但就某种糖来看 , 仅果糖在低酸果实中表现出了相对较高
的含量 , 苹果酸和果糖之间是否存在相互转化还有待研究。我们前期研究表明在这个杂交群体内果实
酸度的低酸性状由一对主效基因控制 (姚玉新 等 , 2006) , 低酸中高糖是否与苹果酸的单基因控制模
式有关还需要深入研究。
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PEPC和 cyMDH是控制苹果酸合成的两个关键酶。本研究发现在果实成熟过程中不论苹果酸含
量升高还是下降 , 两种酶的活性都增加 , 表明合成是苹果酸积累的前提但不是唯一的因素 , 高的合成
不能直接导致高的积累。Beruter (2004) 研究也发现在高酸和低酸的 “U sterapfel”苹果成熟过程中
两种酶活性没有差异。葡萄 (D iakou et al. , 2000) 和桃 (Moing et al. , 1999) 也出现了类似的结果。
可见 , 苹果酸合成不是果实酸度差异形成的关键因素。
苹果果实成熟过程中苹果酸的降解主要归功于 cyME。本研究表明 cyME对苹果果实成熟过程中
苹果酸含量的下降起到至关重要的作用 , 与以前在苹果 ( Hulme & Rhodes, 1971)、梨 ( Frenkel et
al. , 1968)、葡萄 (Ruffer et al. , 1984) 上的研究结果一致。作为可选择的途径 , 苹果酸可以被 PEP2
CK催化形成 PEP, 进而通过糖异生生成糖 ( Knee & Finger, 1992)。本试验结果也表明该酶活性的升
高伴随着苹果酸含量的下降 ; 相似的结果在番茄上也被发现 (Ahmad et al. , 2001)。此外 , PEPCK与
cyME在成熟过程中的酶活变化趋势相似 , 且在多个后代中有着相似的分布 , 暗示了这两种酶可能存
在共调控机制。本研究中 PEPCK随着苹果酸含量的增加活性升高 , 但 3种糖却没有相似的变化 , 原
因可能是 PEPCK催化生成的 PEP部分转化为糖 , 而部分进入三羧酸循环 (R ichard & Robert, 2003) ,
并且糖的积累主要来自光合产物 (Beruter, 2004)。
有机酸跨膜运输需要的动力主要来自质子泵 VHA和 VHP提供的能量 ( Suzuki et al. , 1999)。
VHA是主要的质子泵 , 为代谢产物和离子的次级运输提供能量 (Luttge et al. , 2001)。VHP可以使果
实 pH最低达到 317 (Davies et al. , 1992) , 而 VHA可以使柠檬果实的 pH达到 215 (Muller et al. ,
1996) , 且在柠檬果实中缺乏 VHP, 可见 VHA比 VHP具有更强的酸化能力。本研究表明 VHA的活性
在苹果果实成熟过程中比例增加 ; 相似的研究在来檬 (B rune et al. , 2002)、葡萄 ( Terrier et al. ,
2001) 和梨 ( Suzuki et al. , 2000) 上也被发现。综上可知 , VHA在果实成熟过程中起到重要作用。
但迄今为止 , 仍然没有关于两个质子泵对果实酸度差异形成作用的报道。本研究发现 VHA的活性与
果实苹果酸含量存在相关性 , VHA对果实酸度差异的形成可能起作用。
总之 , 本研究表明在杂交后代群体中葡萄糖、果糖和蔗糖之和随着苹果酸含量的升高呈下降趋
势。苹果酸的合成是其积累的前提 , 但对果实酸度差异的形成不起主导作用 ; 而负责降解的 cyME、
PEPCK和负责运输的 VHA对果实酸度差异的形成具有重要作用。并且 cyME、PEPCK和 VHA在低酸
度的果实中表现出了显著高或低的酶活性 , 它们是否受控制苹果果实低酸性状基因的调控有待深入研
究。
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