全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 469 - 474
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 14; 修回日期 : 2009 - 04 - 01
基金项目 : 山东省中青年科学家奖励基金项目 (2005BS02012) ; 山西省自然科学基金项目 (20051068)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hrshu@ sdau1edu1cn)
水分胁迫诱导八棱海棠和平邑甜茶细胞程序性死亡
的研究
曹　慧 1, 2, 3 , 李春霞 3, 4 , 王孝威 2 , 邹岩梅 1 , 束怀瑞 13
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018 ; 2 潍坊学院 , 山东潍坊 261061; 3 山西农业大学 , 山西太谷
030801; 4 延安职业技术学院 , 陕西延安 716000)
摘 　要 : 以苹果属抗旱能力较强的八棱海棠 (M alus robusta Rehd. ) 和较弱的平邑甜茶 [M alus hupe2
hensis ( Pamp. ) Rehd. ] 水培幼苗为试验材料 , 利用细胞形态学、DNA ladder等技术 , 用 20% PEG 6000模
拟水分胁迫进行诱导细胞程序性死亡研究。经 DAP I染色后荧光显微镜观察发现两个苹果属材料均呈现细
胞染色质凝集、细胞核缩小、变形、解体等细胞程序性死亡的形态学特征 ; 同时 , DNA琼脂糖凝胶电泳可
观察到明显的 “梯状 ”DNA条带 (DNA ladder)。由此表明 , 水分胁迫诱导苹果属植物具有明显的细胞程
序性死亡的典型形态及生化特征 , 是一种主动的细胞死亡过程 , 八棱海棠细胞程序性死亡持续的时间长于
平邑甜茶。
关键词 : 苹果属 ; 水分胁迫 ; 程序性死亡 ; DAP I; DNA ladder
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420469206
Research of Programm ed Cell D ea th Under W a ter Stress in M a lus robusta
Rehd. and M a lus hupehensis ( Pam p. ) Rehd.
CAO Hui1, 2, 3 , L I Chun2xia3, 4 , WANG Xiao2wei2 , ZOU Yan2mei1 , and SHU Huai2rui13
( 1 Institu te of Horticultural Science and Engineering, Shandong A gricultura l U niversity, Ta ipian, Shandong 271018, China;
2W eifang U niversity, W eifang, Shandong 261061, Ch ina; 3 Shanxi A gricultural U niversity, Ta igu, Shanxi 030801, China;
4 Yanan V ocationa l and Techn ica l College, Yanan, Shaanxi 716000, China)
Abstract: The seedling ofM a lus robusta Rehd. and M a lus hupehensis ( Pamp. ) Rehd. were treated with
20% PEG 6000. The study was to observe p rogrammed cell death under water stress through morphocytology
and DNA ladder. The nuclear morphology was observed after DAP I staining. And the results showed that the
characteristic morphological changes of chromatin / chromosome and nuclear such as chromatin condensed, kar2
yon shinked, distorted and degraduated were found with stress time. Meantime, DNA ladder was found in
cells after agarose gel electrophoresis. Cell death induced by water stress showed typ ical morphological and bi2
ochem ical p roperties of p rogrammed cell death, and thiswas an active cell death. Additionally, PCD in M a lus
robusta Rehd. was longer than in M alus hupehensis ( Pamp. ) Rehd. seedlings.
Key words: M a lus; water stress; p rogrammed cell death; DAP I; DNA ladder
细胞程序性死亡 ( Programmed Cell Death, PCD ) 是指由基因控制的细胞主动、有序地死亡 , 是
一种生命现象。PCD普遍存在于植物组织分化、生长和发育过程中。环境胁迫也能引起植物的 PCD ,
如冷胁迫 ( Koukalova et al. , 1997)、水分胁迫和盐胁迫 ( Katsuhara, 1997; 马怀宇 , 2006; 谭冬梅
等 , 2007)、热激 (Ryerson & Heath, 1996)、紫外辐射 (Danon & Gallois, 1998)、低氧 (McCabe et
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al. , 1997)、A l3 +胁迫 (李荣峰 等 , 2008)、药物诱导 (宁顺斌 等 , 2000) 等。PCD一般具有比较
典型的形态和生化特征 , 通常是细胞收缩 , 核浓缩 , 染色质边缘化 , 核被剪切成寡聚核小体大小的片
段并最终被膜包围形成凋亡小体。发生 PCD的细胞表现为诱导产生核酸内切酶 , 核从核小体间降解
断裂 , 产生带有 3′2OH末端大小不同的寡聚核小体片段。这些片段在凝胶电泳上可见到以 180～200
bp倍增的 “梯形 ”DNA (DNA ladder) , DNA ladder被认为是细胞发生 PCD的典型生化特征 ( Gu2
nawardena et al. , 2001; Lam et al. , 2003)。
植物细胞凋亡与细胞分裂一样 , 是植物体正常发育必不可少的组成部分 , 也是植物体抵御病原体
侵染、适应逆境胁迫的重要手段。由于 PCD的研究对于揭示高等植物生长发育及与环境相互作用机
制和指导育种实践等方面有着重要而广泛的意义 , 因此 , 高等植物细胞 PCD研究已成为分子生物学
研究的热点之一。与医学和动物 PCD研究相比 , 植物 PCD研究仍处于起步阶段。本试验以苹果属植
物为试材 , 从细胞形态学和 DNA水平上对水分胁迫诱导细胞程序性死亡进行检测 , 以鉴定水分胁迫
是否能诱导苹果属植物发生 PCD, 为进一步探讨 PCD发生与苹果属植物之间抗逆性的关系 , 及水分
胁迫诱导苹果属植物 PCD的机理提供依据。
1　材料与方法
111　试验材料与处理
以苹果属抗旱性较强的八棱海棠 (M alus robusta Rehd. ) 和抗旱性较弱的平邑甜茶 [M alus hupe2
hensis ( Pamp. ) Rehd. ] 一年生实生幼苗为试验材料。
试验于 2005年 3月 —2008年 10月在潍坊学院温室和重点实验室进行。种子经 4 ℃层积处理发芽
后 , 选生长一致的播入蛭石中 , 于温室内培养 , 待幼苗长到 4片真叶时移至 1 /2 Hoagland营养液培养
一周后改用全剂量的 Hoagland营养液培养。营养液的初始 pH值用 KOH调至 610, 每周更换 1次营养
液 , 每天定时通气 , 人工恒定日光灯光源 , 14 h光照 , 光照强度 400μmol·m - 2 ·s- 1 , 白天 /夜间温
度为 22～28 ℃ /17～21 ℃ (谭冬梅 等 , 2007)。
当长到 13～14片真叶时选择生长相对一致的幼苗进行水分胁迫处理 , 每处理的幼苗分成两等份
(每份 50株 ) , 一份在正常营养液中培养作为对照 ; 另一份移入含有 20% PEG 6000的营养液 (相当
于 - 0163 MPa, 属中度胁迫 ) 中进行水分胁迫处理 (林久生和王根轩 , 2001)。从处理开始起 , 每天
(24 h) 进行取样测定 , 直到植株完全死亡为止。每个处理随机取样 , 每种鉴定方法均重复 3次。
112　分析方法
11211　DAP I染色观察细胞核形态学特征 　
DAP I荧光染色参照郭晓军 ( 2003) 和孙晓丽等 ( 2006) 的方法进行。采取枝条中部的成熟叶
片 , 快速切成 2～3 mm ×1～2 mm小块 , 放入盛有 5%戊二醛的小瓶 , 置于 4 ℃冰箱固定 2 h以上。
固定液用 011 mmol·L - 1 PBS (pH 710) 反复冲洗 3次。将冲洗后的切片移到载玻片上 (每片约放置
5～10横纵切片 ) , 在小叶条上滴加浓度为 10μg·mL - 1的 DAP I染色液 10～20μL, 并盖好盖玻片 ,
于黑暗处染色 10～15 m in。将做好的镜片放置于荧光倒置摄影显微镜 (日本 N ikon) 下在激发波长为
UV 330～380 nm下观察和拍照。
11212　DNA的提取与 DNA ladder分析 　
叶片总 DNA的提取采用 CTAB法 ( Tada et al. , 2001)。
将纯化后的 DNA用 115%的琼脂糖凝胶 (稍微冷却的琼脂糖溶液中按 1μL ∶20 mL加入 gold2
view) , 015 ×TBE电泳缓冲液进行电泳 , 用英国 Syngene公司生产的凝胶成像分析系统 ( G2BOX2HR)
观察、拍照。
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2　结果与分析
211　水分胁迫下不同苹果属植物 DAP I荧光染色细胞核形态学变化
DAP I (4′, 6 -二脒基 - 2 - 苯基吲哚 , 4′, 62diam idino222phenylindole) 是一种能够与 DNA强力
结合的细胞核荧光染料。从图 1可观察到两个苹果属植物对照的细胞核为完整圆形 , 并发出均匀明亮
的蓝色荧光 , 未出现染色质浓缩等变化。
八棱海棠水分胁迫处理 1 d后 , 大部分细胞核仍保持圆形 , 但细胞质开始浓缩 ; 胁迫 2 d时大部
分细胞细胞核出现不规则形状 ; 处理 3～4 d时许多细胞核发出亮蓝色荧光 , 并表现染色质的不均一
化 , 并形成核小体 ; 从 5 d起 DNA开始大量降解 , 6 d细胞核中仅剩少量 DNA残余。
图 1　水分胁迫下苹果属植物叶片 DAP I荧光染色细胞核形态学变化
F ig. 1　The changes of karyom orph ism in leaves of M a lus under fluorescence by sta ined w ith DAP I
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平邑甜茶水分胁迫处理下细胞核的变化较八棱海棠明显 , 在胁迫处理 1 d时大多数细胞核仍呈圆
形 ; 但处理后 2 d细胞核明显变小 , 形成 “棒状 ”; 4 d、5 d时细胞核中只有少量 DNA残余 ; 胁迫 6
d时所有细胞 DNA全部降解 , 形成只有细胞壁的空腔。
因此 , 两个苹果属植物在正常培养情况下细胞核为完整圆形 , DAP I染色发出均匀明亮的蓝色荧
光 , 水分胁迫处理后八棱海棠和平邑甜茶的细胞核都不同程度和不同时间发生了染色质凝聚、固缩及
染色质逐渐趋边化、细胞核逐渐解体形成凋亡小体。
212　水分胁迫下不同苹果属植物发生 PCD细胞的 “D NA ladder”观察分析
细胞在凋亡过程中 , 内源性核酸内切酶被激活 , 在核小体之间切割形成电泳可见的 DNA Ladder
是细胞凋亡的重要生化指标之一。电泳检测结果 (图 2) 表明 , 不论是平邑甜茶还是八棱海棠 , 对照
叶片细胞的总 DNA都表现为一条完整的带 , 当加入 20% PEG 6000处理 1 d后 , 两种植物在电泳图谱
上可以看到 DNA降解为均匀间隔 180～200 bp大小的 DNA片段 , 电泳呈现清晰的 DNA Ladder, 说明
它们都发生了细胞程序性死亡。
八棱海棠处理的 2～4 d仍能看到 DNA ladder梯形条带 , 但比第 1天模糊 ; 胁迫 5 d时 DNA梯形
条带消失 , 电泳表现出 “弥散 ”现象 , DNA基本完全降解。
平邑甜茶在胁迫处理后 2 d仍可看到 DNA ladder梯形条带 ; 但到 3 d时 DNA梯形条带消失 , 电
泳表现出 “弥散 ”现象 , DNA基本完全降解 , 细胞表现为坏死。
图 2　水分胁迫下苹果属植物叶片 D NA的琼脂糖电泳图
F ig. 2　D NA band pa ttern s in leaves of M a lus under wa ter stress
DNA ladder结果表明 , 两种苹果属植物都能诱导叶片细胞 DNA断裂 , 并可检出 ladder, 只是出
现的时间不同。八棱海棠和平邑甜茶分别在胁迫处理后的 1～4 d和 1～2 d DNA电泳均出现 DNA
ladder现象 , 表明八棱海棠比平邑甜茶细胞程序性死亡持续的时间较长 , 八棱海棠耐干旱能力较强。
3　讨论
生物体细胞的死亡可分为两种类型 , 即细胞程序性死亡 ( PCD ) 或细胞凋亡和细胞坏死 (Necro2
sis)。DAP I作为特异性的荧光探针已广泛地应用于细胞分子生物学等各个领域 , 用于检测细胞程序
性死亡 (纪睿 等 , 2005; 王荣 等 , 2008)。本试验利用 DAP I荧光染色 , 观察经 20% PEG处理的两
个苹果属植物叶片细胞核形态变化发现 , 无论是八棱海棠还是平邑甜茶细胞核均发生染色质凝聚、固
缩、逐渐趋边化、细胞核逐渐解体等变化 , 这些变化均具有 PCD的典型形态特征。
当细胞发生 PCD时 , DNA “梯形 ”条带 (DNA ladder) 的存在与否是区分 PCD与坏死的标准之
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一 ( Young et al. , 1997; L iljeroth & B ryngelsson, 2001)。渗透胁迫诱导的小麦叶片 (林久生和王根
轩 , 2001)、羟自由基诱导的烟草细胞 (夏慧莉 等 , 1999) 等逆境诱发 PCD时均检测到 DNA“梯
状 ”条带。本试验两个苹果属植物对照叶片细胞的总 DNA都表现为一条完整的带 , 当加入 20% PEG
24 h后 , 在电泳图谱上可以看到出现均匀间隔 200 bp整数倍的 DNA片段 , 即出现清晰的 DNA “梯
形 ”条带 , 说明水分胁迫 1 d时出现了 PCD的典型生化特征 , 发生了细胞程序性死亡。
从电泳图谱上还可以看到 , 八棱海棠在 1～4 d呈现有 DNA “梯形 ”条带 , 只是在第 2～4天没有
第 1天时清晰 , 说明随着胁迫时间的延长 , 发生 PCD的细胞数量减少。而平邑甜茶在第 1天、第 2
天能看到 DNA “梯形 ”条带 , 从第 3天开始 DNA大量降解、DNA “梯形 ”条带基本消失。反映了八
棱海棠的细胞程序性死亡持续时间比平邑甜茶长 , 抗干旱能力更强。
细胞凋亡是生物发育与抵抗逆境的最重要的机制之一 , 通过这些细胞的主动死亡 , 植物抵御了不
良的环境条件。本试验通过不同的细胞形态学观察和 DNA 凝胶电泳分析表明 , 水分胁迫诱导的苹果
属植物细胞呈现出细胞凋亡的形态学特征 , 具有染色质浓缩和 DNA ladder现象 , 表明水分胁迫诱发
的细胞死亡是一种细胞凋亡。八棱海棠和平邑甜茶分别在水分胁迫前 4 d、前 2 d均发生细胞程序性
死亡 , 分别于胁迫 5 d、3 d后 DNA大量降解 , 细胞转向死亡。由此 , 从细胞程序性死亡机理方面证
明了八棱海棠的抗旱能力大于平邑甜茶 , 且进一步证实易发生细胞程序性死亡且持续时间长的植物 ,
对外界的不良逆境反应越快 , 其抵抗和适应能力也越强。
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