全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (4) : 583 - 586
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 17; 修回日期 : 2009 - 03 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30871713) ; 河北省自然科学基金项目 (C2005000222)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shensx@hebau1edu1cn)
结球甘蓝 —大白菜异源三倍体小孢子培养的研究
张巍巍 , 申书兴 3 , 王彦华 , 陈雪平 , 轩淑欣 , 罗双霞 , 李晓峰
(河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001)
摘 要 : 为创建结球甘蓝 —大白菜异附加系 , 以大白菜二倍体 (AA, 2n = 2x = 20) 与结球甘蓝四倍体
(CCCC, 2n = 4x = 36) 杂交获得的 8个异源三倍体 (ACC, 2n = 3x = 28) 单株系为试材 , 进行游离小孢子
培养研究 , 获得再生植株 , 并对其进行了染色体数目鉴定和性状调查。结果表明 , 异源三倍体 (ACC) 的
小孢子诱导成胚的能力低于双亲 ; 在 NLN中添加 15%的蔗糖和 011 mg·L - 1 62BA、012 mg·L - 1 2, 42D、
0105 mg·L - 1 KT的培养基上小孢子胚胎发生最高为 010250个 ·蕾 - 1 , 8个株系间有差异 , 平均为 010100
个 ·蕾 - 1 ; 胚胎再生率只有 3313%。小孢子再生植株染色体数在 14～27条之间 , 田间性状表现多样。
关键词 : 结球甘蓝 ; 大白菜 ; 小孢子培养 ; 胚状体 ; 异附加系
中图分类号 : S 63511; S 63411; Q 813 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0420583204
Stud ies on Isola ted M icrospore Culture of the A llotr iplo id Hybr ids Between
Cabbage and Ch inese Cabbage
ZHANG W ei2wei, SHEN Shu2xing3 , WANG Yan2hua, CHEN Xue2p ing, XUAN Shu2xin, LUO Shuang2xia,
and L I Xiao2feng
(College of Horticulture, A gricultural U niversity of Hebei, B aod ing, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: M icrospore culture of 8 allotrip loid hybrids between dip loid Chinese cabbage (AA , 2n = 2x =
20) and autotetrap loid cabbage (CCCC, 2n = 4x = 36) was performed in order to create the alien addition
lines. The results showed that embryo p roduction frequency of the allotrip loid hybrids (ACC) was lower than
their parents. In liquid medium NLN with 15% sucrose and 011 mg·L - 1 62BA, 012 mg·L - 1 2, 42D, 0105
mg·L - 1 KT, the 8 lines were different, the highest of embryo p roduction was 010250 embryos per bud, the
average was 010100 embryos per bud. The p lant regeneration frequency of embryoids was only 3313%. The
chromosome number of p lantlets derived from m icrospore culture varied from 14 to 27. The morphological
characters were diverse among the different p lants.
Key words: cabbage; Chinese cabbage; m icrospore culture; embryo; alien addition lines
异附加系是利用外源基因进行基因组研究的重要遗传材料 , 也是实现品种改良及创制易位系和代
换系的重要桥梁材料。结球甘蓝 (B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) 和大白菜 [B rassica com pestris
L. ssp. pek inensis (Lour. ) O lsson ] 同为十字花科 (Cruciferae) 芸薹属 (B rassica) , 是国际芸薹属基
因组研究计划的重要对象 , 因此 , 创建结球甘蓝附加大白菜染色体的异附加系对结球甘蓝基因组研究
和品种改良具有重大意义。本研究针对结球甘蓝大白菜异源三倍体 (ACC) 回交不易成功、结籽率
极低 (Metz et al. , 1997; 张玉成 , 2008) , 不能满足创建异附加系要求的难题 , 利用异源三倍体减数
分裂不规则的特点 , 开展了结球甘蓝 —大白菜异源三倍体 (ACC) 的小孢子培养 , 旨在为创建 CC染
色体组附加 A染色体组的单体或双体异附加系提供可行的途径。
园 艺 学 报 36卷
1 材料与方法
试验材料为结球甘蓝 —大白菜异源三倍体 (ACC, 2n = 3x = 28) , 由本课题组以二倍体大白菜
(05258, AA, 2n = 2x = 20) 为母本 , 四倍体结球甘蓝 (9502, CCCC, 2n = 4x = 36) 为父本进行杂
交 , 经幼胚离体培养挽救获得。
将结球甘蓝 —大白菜异源三倍体组培苗于 2006年 10月份进行扩繁 , 11月中旬由 MS培养基转接
到 1 /2MS培养基上进行生根培养 ; 12月份移栽到阳畦 , 翌年四月初定植到田间 , 常规管理。
取材和小孢子培养时期的确定、小孢子分离和培养参考赵玉靖等 (2007)、王汉中等 (2004) 的
方法 , 并稍做改进。以 NLN为基本培养基 , 设 10%、13%和 15%蔗糖浓度 , 其中 13%和 15%蔗糖添
加 012 mg·L - 1 2, 42D; 15%蔗糖添加 011 mg·L - 1 62BA、012 mg·L - 1 2, 42D和 0105 mg·L - 1 KT,
共 6个处理。每皿 2 mL, 小孢子密度约 105个 ·mL - 1。接种后先置 33 ℃暗培养 48 h, 然后置 25 ℃继
续暗培养。此期间对小孢子的生长发育过程定期观察和照相 , 2周后统计胚状体数 , 计算每花蕾出胚
数。当小孢子胚胎发育到子叶胚时 , 转到光照培养箱培养 48～72 h, 待子叶胚变绿时 , 在无菌条件
下 , 将其接种于 MS固体培养基上 , 25 ℃下进行植株再生。
将获得的小孢子植株移接到 1 /2MS培养基上 , 待根长约 1 cm时 , 切取根尖 , 置 01002 mol·L - 1
的 8 - 羟基喹啉溶液中处理 2 h, 卡诺固定液固定。常规根尖压片法进行染色体制片 , 丙酸 —铁 —苏
木精 —水合三氯乙醛染色液 ( P IHCH) 染色 , O lympusBH22光学显微镜观察 , 鉴定染色体数。
对小孢子植株生殖生长时期的长势、株高、叶形、叶色、叶表面特征、花形、花色、花大小、始
花期、育性等性状进行调查并照相。
2 结果与分析
211 不同蔗糖浓度对小孢子胚胎发生的影响
蔗糖作为小孢子培养的碳源和渗透压调节剂 ,
其浓度高低对培养成功与否至关重要。本试验结
果 (表 1) 表明 , 基本培养基 NLN添加 10%的蔗
糖未诱导出胚状体 , 添加蔗糖浓度为 15%时的小
孢子产胚率显著高于其他蔗糖浓度的产胚率。说
明较高的蔗糖浓度对结球甘蓝—大白菜异源三倍
体小孢子胚的发生和生长是有利的。
212 不同植物生长调节剂处理对小孢子胚胎发生
的影响
由表 2可见 , 与不添加植物生长调节剂的对
照 (表 1) 相比 , 基本培养基 NLN 中分别添加
13%、15%蔗糖的基础上 , 添加生长素 2, 42D对
小孢子胚的发生没有影响 ; 但在基本培养基 NLN
添加 15%蔗糖和生长素 2, 42D 的基础上再添加
细胞分裂素 62BA和 KT, 则明显促进了小孢子胚
的发生 , 出胚率较前者提高了 1倍 , 差异达到显
著水平。这表明生长素与细胞分裂素相互作用是
小孢子胚发生的一个关键因素。
表 1 蔗糖浓度对小孢子胚胎诱导的影响
Table 1 Effect of sugar concen tra tion on
forma tion of m icrospores em bryos
蔗糖浓度 /%
Sugar
concentration
花蕾数
Number of
flower buds
出胚数
Number of
embryos
每花蕾出胚数
Embryos
per bud
10 600 0 0 b
13 600 2 010033 b
15 600 8 010133 a
注 : 基本培养基 NLN。表中不同字母表示处理间存在 0105
水平显著差异。下同。
Note: Basic medium isNLN. D ifferent letters in the Table indicate
significant differences at P = 0105. The same below.
表 2 植物生长调节剂对小孢子胚胎发生的影响
Table 2 Effect of plan t growth regula tors
on forma tion of m icrospores em bryos
蔗糖
/%
Sugar
2, 42D /
(mg·
L - 1 )
62BA /
(mg·
L - 1 )
KT/
(mg·
L - 1 )
蕾数
Number
of flower
buds
出胚数
Number
of
embryos
每花蕾
出胚数
Embryos
per bud
13 012 0 0 300 1 010033 b
15 012 0 0 300 3 010100 b
15 012 011 0105 600 15 010250 a
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4期 张巍巍等 : 结球甘蓝 —大白菜异源三倍体小孢子培养的研究
213 小孢子胚胎的发育过程
对小孢子的胚胎发生及发育过程进行了观察。结果表明 , 培养 3～4 d后大多数小孢子能够生长
膨大 , 但仅有个别小孢子能够继续生长 , 约 6～7 d开始进行第 1次分裂 (图版 , 1) , 13 d左右形成
肉眼可见的球型胚 (图版 , 2) , 进而形成心型胚 , 约 20 d后开始出现子叶型胚 , 子叶型胚有短胚轴
(图版 , 3) 和喇叭口状 (图版 , 4) 等类型。
本试验共取花蕾 3 000个 , 诱导出小孢子胚 30个 , 平均每花蕾出胚仅 0101个。将 30个小孢子胚
接种到 MS固体培养基上 , 其中只有 1个直接成苗 , 9个经愈伤成苗 (图版 , 5) , 其它 20个则褐化死
亡。
214 小孢子植株的染色体数
对获得的 10个小孢子植株染色体数目进行了鉴定 , 染色体数从 14～27条不等 (图版 , 6～11) ,
其中 14、20、27条的各 1株 , 17、19条的各 2株 , 18条的最多 , 3株。
215 小孢子植株的生殖性状调查
小孢子植株性状在田间表现多样 , 多数株系间在植株长势、株高、叶形、叶色、花色、花形、花
的大小、始花期和育性上均存在着较大差异。在育性方面 , 绝大部分小孢子株系花药空瘪 , 花粉很
少 , 少数小孢子株系的育性较好。在叶片特征方面 , 基生叶形状多种多样 , 叶片颜色有浅绿、绿、深
绿、墨绿不等 , 叶片质地也不相同 (图版 , 12～16)。但不同株系性状表现又存在一些相似之处 , 如
基生叶多有 1～2对翅状小叶 , 叶表面有毛 , 多具蜡质。不同植株间花期不一致 , 盛花期花的直径大
小变异范围在 116～215 cm之间 , 株高的变异范围在 0125～1113 m之间。
图版说明 : 1. 小孢子第 1次分裂 ; 2. 球形胚 ; 3. 短胚轴胚 ; 4. 喇叭口状胚 ; 5. 愈伤成苗 ; 6～11. 染色体数 14、17、18、19、20和
27; 12～16. 小孢子植株 (染色体数 17、18、19、20和 27)。
Explana tion of pla tes: 1. First diverse m icrospore; 2. Globular embryo; 3. Short2hypocotyls embryo; 4. Hydraulic embryo; 5. Sp rout from cal2
lus; 6 - 11. 14, 17, 18, 19, 20, 27 chromosomes; 12 - 16. Plant (17, 18, 19, 20, 27 chromosomes) .
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3 讨论
异源三倍体植株在生产上一般没有直接的利用价值 , 但它却是用于基因效应研究、特别是异附加
系选育的重要遗传材料。异附加系的选育通常是以异源三倍体作母本与二倍体亲本回交 , 通过细胞学
鉴定等方法从回交子代中逐一进行筛选 , 如大白菜附加甘蓝 (刘炜 等 , 2008 ) 及菜薹附加芥蓝
(W ang et al. , 2008) 等芸薹属植物的单体异附加系都是采用这种方法获得的 , 但该方法的应用需获
得较多的回交子代。芸薹属植物中基因组为 AAC的异源三倍体与 AA基因组的二倍体亲本回交比较
容易成功 , 然而基因组为 ACC的异源三倍体与 CC基因组的二倍体亲本回交则难以成功 (Metz et al. ,
1997) ; 结籽率极低 (张玉成 , 2008) , 这给 C基因组背景下的异附加系选育增添了困难。本研究中
利用异源三倍体 (ACC) 减数分裂不规则能产生各种非整倍体配子的特点 , 直接对其小孢子进行离
体培养 , 试图获得附加一条或两条染色体植株 , 但实际获得了附加 5～18条染色体植株。这可能是由
于 C、A基因组染色体具有较高的同源性 , 在减数分裂过程中 A、C染色体组异源联会 , A基因组染
色体不易丢失造成的 ; 也有可能是获得的植株太少 , n = 10～11的配子未能充分体现出来。
蔗糖浓度和植物生长调节剂是影响小孢子培养的两个重要因素。本研究中在基本培养基 NLN中
添加 13%蔗糖 , 对结球甘蓝 —大白菜异源三倍体 (ACC) 小孢子进行诱导 , 其诱导率仅为 010033
个 ·蕾 - 1 ; 当提高蔗糖浓度和附加一定浓度的生长素和细胞分裂素时 , 明显促进了小孢子胚的发生 ,
但从总的培养效果看 , 诱导频率还是很低 , 为 010250个 ·蕾 - 1。分析其原因 , 是三倍体减数分裂不
规则 , 产生的小孢子数量少、生活力低 , 严重影响了小孢子诱导成胚的能力。
以结球甘蓝 —大白菜异源三倍体 (ACC) 为母本与二倍体甘蓝 (CC) 进行回交 , 结籽率极低 ,
通过小孢子培养 , 产胚率也低 , 这就为创建结球甘蓝 —大白菜异附加系造成了困难。为了提高其结籽
率 , 作者正在尝试以二倍体甘蓝 (CC) 为母本与结球甘蓝 —大白菜异源三倍体 (ACC) 进行反交 ,
以期得到较多的种子 , 为创建结球甘蓝 —大白菜异附加系提供材料。
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