全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1538 - 1544
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 18; 修回日期 : 2009 - 07 - 06
基金项目 : 国家科技部基础研究重大项目 (2004ccc02900) ; 黑龙江省科技攻关重大项目 ( GA08B102) ; 黑龙江省青年基金项目
(Qc03c05)3 E2mail: smallpotatoes@1261com
马铃薯类病毒 cDNA双体探针的研制及其在检测上
的应用
吕典秋 3 , 邱彩玲 , 王绍鹏 , 李　勇 , 高云飞
(黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所 , 农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心 , 哈尔滨 150086)
摘 　要 : 在马铃薯纺锤块茎类病毒 ( Pota to spind le tuber viroid, PSTVd) 基因组中 B am H Ⅰ位点处
(87～92 nt) , 设计两对含有 B am HⅠ重叠区 (overlop) 的引物。将 PCR扩增获得的全长 PSTVd分别插入到
pGM 2T载体中。通过 B am HⅠ位点 , 将两个 PSTVd单体连接 , 构建了 PSTVd双体载体。以此载体为模板 ,
通过 PCR标记技术 , 制备了高灵敏高专化的 PSTVd双体 cDNA地高辛标记探针。以 CDP2Star为反应底物进
行化学发光反应结果判读 , 建立了 PSTVd的高效杂交检测体系。该体系可以对马铃薯薯块、叶片、芽等不
同组织样品进行检测 , 检测灵敏度达到 0105 pg。通过对 67份田间采集的样品和实验室保存的资源材料进
行检测 , 比较了 cDNA双体探针核酸斑点杂交技术 ( nucleic acid spot hybridization, NASH )、反转录聚合酶
链式反应 ( reverse2transcrip tional polymerase chain reaction, RT2PCR) 和往返 —聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( return2
polyacrylam ide gel electrophoresis, R2PAGE) 检测技术的阳性样品检出率 , 结果显示 , NASH技术阳性样品检
出率为 6717% , 与 RT2PCR相一致 , 高于 R2PAGE技术的阳性检测率 (5317% )。
关键词 : 马铃薯 ; 马铃薯纺锤块茎类病毒 ; 探针 ; 双体 ; 核酸斑点杂交
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021538207
D evelopm en t of cD NA D im er ic Probes and Its Applica tion in D iagnosis of
Pota to spindle tuber viro id
LüD ian2qiu3 , Q IU Cai2ling, WANG Shao2peng, L I Yong, and GAO Yun2fei
(V iruses2free Seed ling Research Institu te, Heilongjiang A cadem y of A gricultural Sciences, Supervision and Testing Cen ter for V irus2
free Potato Seeds of M in istry of A gricu lture, Harbin 150086, China)
Abstract: Two PCR amp lifying full2length PSTVd ( Potato spindle tuber viroid) with the B am HⅠ (87 -
92 nt) overlop were linked to pGM 2T to construct the recombinant vector containing dimeric PSTVd cDNA.
H ighly sensitive and specific dimeric p robe labeled with digoxin was p roduced with PCR amp lification. An ef2
ficient hybridization system was established by with the substrate of CDP2star in this study. The m inimum con2
centration of PSTVd detected by this p robe was 0105 pg. The samp les p repared from leaves, tubers and
sp routs could be detected successfully. Compared the positive samp le percentage detected from potato fields
and conserved potato resource of p lantlets in vitro with RT2PCR ( reverse2transcrip tional polymerase chain re2
action) and R2PAGE ( return2polyacrylam ide gel electrophoresis) , NASH ( nucleic acid spot hybridization)
could give the same positive samp le percentage as RT2PCR did ( 6717% ) , but was higher than R2PAGE
(5317% ).
Key words: potato; Pota to spind le tuber viroid; PSTVd; p robe; dimeric PSTVd; nucleic acid spot hy2
bridization (NASH)
　10期 吕典秋等 : 马铃薯类病毒 cDNA双体探针的研制及其在检测上的应用 　
类病毒 ( viroid) 是已知最小的 (246～475 nt) 能够在寄主体内进行自我复制的单链闭合环状
RNA。类病毒不编码蛋白 , 具有广泛的传播途径和寄主范围。马铃薯纺锤块茎类病毒 ( Pota to spind le
tuber viroid , PSTVd) 是发现最早的一种类病毒 , 严重危害我国及世界众多国家马铃薯的产量和品质。
目前尚无有效的脱毒方法将类病毒从植物体内汰除。在生产中 , 通常是通过对种薯的严格检测 , 筛选
健康无类病毒的种苗进行种薯生产 , 从而实现控制 PSTVd危害的目的。在我国 , PSTVd的检测主要
是利用往返 —聚丙烯酰胺凝胶电泳 (R2PAGE) 技术。但 R2PAGE操作复杂 , 检测灵敏度不高 , 很难
在种薯质量检验方面得到普及。随着分子生物学技术的发展 , RT2PCR 已应用于 PSTVd检测中
(Ragozzino et al. , 2004; Bernad & Duran2V ila, 2006; Ryoji & Masaaki, 2006; Singh et al. , 2006 )。
Owens等 (1981) 利用放射性 cDNA探针在硝酸纤维素膜上进行类病毒检测。Salazar等 (1988) 利用
切口平移、M13引物扩增和 RNA转录标记等方法制备了 32 P放射性 sscDNA ( + )、 sscDNA ( - )、
dsDNA和 ssRNA探针 , 在硝酸纤维素膜上进行 PSTVd检测 , 比较了不同探针的检测灵敏度。但放射
性标记探针存在对人体的危害 , 操作不方便等问题 , 限制了该技术在日常检测工作中的应用。不同的
非放射性标记得到越来越广泛的应用 , 其中最多的为生物素、地高辛和荧光素标记探针 (Hoppe et
al. , 1988; Podleckis et al. , 1993; Maria et al. , 1996; Du et al. , 2007)。由于 RNA探针通常比 DNA探
针灵敏度更高 , 因此国外种薯类病毒检测主要利用 RNA探针。但 RNA探针存在易降解的缺点 , 在操
作中带来诸多不便。
本研究的目的是为了利用 DNA探针稳定性好的优点 , 通过适当延长探针长度 , 制备 PSTVd双体
cDNA探针 , 提高探针的检测灵敏度 , 以期建立准确、高效的核酸杂交反应体系 , 应用于日常检测工
作中。
1　材料与方法
111　材料及引物设计
马铃薯 PSTVd阳性和阴性对照样品保存于农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心 (哈尔
滨 ) 试验温室。待测的马铃薯样品分别采自黑龙江省克山农场、讷河第四良种场和巴彦红光乡、泰
康宏伟乡、哈尔滨红旗乡马铃薯商品薯田。试管苗资源材料来自黑龙江省马铃薯工程技术研究中心品
种资源库。
试剂 D ig2dUTP、CDP2Star, 购自 Roche公司 ; Taq酶、pGM 2T载体、M 2MLV 反转录酶 , 购自
Tiangen公司 ; T4 DNA连接酶、限制性内切酶 , 购自大连宝生物公司 ; 引物由北京三博公司合成 ; 尼
龙膜 , 购自北京美莱博公司 ; 常规试剂为进口分析纯。
根据已发表的 PSTVd序列 (Lu et al. , 2005) 设计引物。以 PSTVd序列中 87～92位置上的
B am HⅠ酶切位点向两侧设计两对引物 ( PC0054 /PC0055和 PC0056 /PC0057) (引物序列见表 1) , 分
别向两侧扩增。两对引物扩增产物均含有一个共同的 B am HⅠ的重叠区 (overlop ) , 通过此区域进行
连接 , 构成类病毒双体。根据插入类病毒双体的 pGM 2T载体两侧的序列设计引物 PSTVd2D (L ) 和
PSTVd2D (R) (引物序列见表 1)。利用 PCR扩增 , 制备 PSTVd双体 cDNA探针。
112　载体构建
以类病毒阳性样品的总核酸样品为模板 , 利用 PC0054、PH0055两对引物 , 通过 RT2PCR反应进
行扩增 , 扩增产物特异性带进行回收 , 连接到 pGM 2T载体中 , 然后利用 B am HⅠ /SacⅠ双酶切鉴定插
入情况 , 重组载体命名为 pGM 2T2PSTVd2M1。以 PC0056、PH0057两对引物进行 RT2PCR扩增 , 产物
回收后连接到 pGM 2T载体中 , 进行 X baⅠ /B am HⅠ双酶切鉴定 , 筛选反向插入的阳性克隆并命名为 :
pGM 2T2PSTVd2M2。用 B am HⅠ /S acⅠ双酶切 pGM 2T2PSTVd2M2 重组质粒 , 将特异的酶切片段连接到
B am HⅠ /SacⅠ双酶切的 pGM 2T2PSTVd2M1载体上 , 构建 PSTVd双体载体。通过 X baⅠ /SacⅠ双酶切
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鉴定筛选 PSTVd双体载体。重组载体命名为 pGM 2T2PSTVd2Md。
表 1　构建 PSTVd双体载体及制备探针 PCR引物
Table 1　The PCR pr im ers for d im e ic cD NA recom b inan t vector and probe
引物名称
Primer
引物序列
Sequence
极性
Polarity
碱基数 / bp
Number of
bases
扩增产物
/ bp
Fragment
引物位置
Position in
genome /vector
PC0054 5′GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG 3′(B am HⅠ) Antisense 27 359 PSTVd (92～66 nt)
PH0055 5′gagctCCCGGGAAACCTGGAG CGA ACT GG 3′(SacⅠ) Sense 31 PSTVd (93～116 nt)
PC0056 5′tctaGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG 3′(X baⅠ) Antisense 29 364 PSTVd (91～66 nt)
PH0057 5′GGATCCCCCGGGAAACCTGGAGCGAAC 3′(B am HⅠ) Sense 27 PSTVd (87～113 nt)
PSTVd2D (L) 5′GCCGCGGGAATTCGAT3′ Sense 16 757 pGM2T
PSTVd2D (R) 5′TCCAACGCGTTGGGAGC3′ Antisense 17 pGM2T
113　探针标记
利用 PCR方法 , 以 pGM 2T2PSTVd2Md载体为模板 , 标记制备探针。标记体系为 10 ×PCR缓冲液 2
μL, PSTVd2D (L) 和 PSTVd2D (R ) 引物各 1μL, D ig2dUTP混合物 1μL, Taq DNA聚合酶 1μL,
含 PSTVd双体载体 DNA模板 1μL, ddH2 O 13μL。扩增程序为 : 94 ℃ 2 m in; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,
72 ℃ 30 s, 30个循环后 72 ℃延伸 10 m in。
114　核酸提取
为了研究不同样品提取方法对检测结果的影响 , 采取 3种不同核酸提取方法。所有离心步骤均在
115 mL Eppendorf管中进行。
(1) 试剂盒提取 : 使用市售的 RNAVzol进行提取 , 按照产品说明书进行。
(2) 酚 ∶氯仿提取 : 取 015 g样品 , 放于灭菌冷冻的小研钵中 , 分别加入 1 mL样品提取缓冲液
(含有 1%巯基乙醇 , 011 mol·L - 1 NaAc, pH 910, 011 mol·L - 1 Tris2HCl, pH 810)、1 mL水饱和酚和
1 mL三氯甲烷 , 充分研磨 , 倒入 115 mL Eppendorf管中。10 000 r·m in - 1 , 4 ℃离心 15 m in。用移液
器小心将上层含 RNA的水相移入新管中。加入 3倍体积的无水冷乙醇 , 1 /10体积的 3 mol·L - 1醋酸
钠溶液 (pH 410) , 混匀。 - 20 ℃沉淀 115 h以上。然后 , 10 000 r·m in - 1 , 4 ℃离心 15 m in, 弃掉上
清液 , 用 1 mL 70%乙醇洗沉淀 , 离心后再用吸头彻底吸弃遗留在管中的上清液 , 在自然条件下干燥
沉淀。最后 , 溶于 50μL DEPC处理的水中。 - 20 ℃贮存 , 备用。
(3) 核酸粗提取 : 将提取缓冲液 (含有 1%巯基乙醇 , 011 mol·L - 1 NaAc, pH 910, 011 mol·
L - 1 Tris2HCl, pH 810) 与植物样品加入到 Eppendorf管或取样袋中 , 两者比例为 10∶1。利用研磨棒研
磨 , 10 000 r·m in - 1离心 1 m in, 取上清液用于杂交反应。
115　杂交反应
将样品点在预湿的尼龙膜上。将膜在 UVP 1000紫外交联仪中交联 1 m in。然后 , 将膜放入 10 mL
含有预杂交液 (50%去离子甲酰胺 , 5 ×SSC, 50 mmol·L - 1磷酸钠 , pH 615, 5 mmol·L - 1 EDTA ,
012% SDS, 012 mg·mL - 1牛血清白蛋白、Ficoll 400和 PVP, 0125 mg·mL - 1变性硅鱼精 DNA ) 的可
热封的杂交袋中 , 在 65 ℃下 , 预杂交 3～6 h。倒出预杂交液 , 再加入 10 mL杂交液 (含有 011μg·
mL - 1 cDNA探针的杂交液 ) , 65℃杂交过夜。
在杂交洗涤后 , 在洗涤缓冲液 (2 ×SSC /011% SDS) 中浸润 1～5 m in; 在 20～30 mL阻断液 (1
mol·L - 1 Tris2HCl pH 715, 0115 mol·L - 1 NaCl) 中孵育 30 m in; 在 10 mL抗体液 (抗 D ig2AP) 中孵
育 30 m in; 在 20～30 mL洗涤液中洗涤 2次 , 每次 15 m in。沿尼龙膜的左边加入 015～110 mL新鲜配
制的发光底物液。在暗室中用 X光片压片并进行曝光、显影、定影。一般压 15～30 m in。
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　10期 吕典秋等 : 马铃薯类病毒 cDNA双体探针的研制及其在检测上的应用 　
116　探针灵敏性测试
利 Nano drop核酸测定仪 , 对提取的 PSTVd阳性样品总核酸浓度进行测定。利用 DEPC水 , 将提
取的核酸样品浓度调整到 215 ng·μL - 1 , 然后 , 采取 10倍稀释法 , 进行稀释。核酸浓度分别调整为
215 ng·μL - 1、250 pg·μL - 1、25 pg·μL - 1、215 pg·μL - 1、0125 pg·μL - 1、01025 pg·μL - 1和
010025 pg·μL - 1。取 2μL核酸样品点在膜上 , 点在膜上样品核酸量分别为 5 ng、500 pg、50 pg、5
pg、015 pg、0105 pg和 01005 pg。利用所制备的探针进行杂交 , 通过化学发光反应 , 进行结果判读。
观察双体探针检测 PSTVd灵敏度。
117　探针专化性测试
利用酚 ∶氯仿提取方法 , 分别对阴阳性样品的薯块、叶片和芽组织提取核酸。取 2μL提取的核
酸 , 点在膜上利用该 PSTVd双体探针进行杂交反应 , 比较不同组织部位样品在杂交结果及杂交特异
性上是否有差异。
118　对接种 PSTVd番茄植株的检测
取温室内接种 2周后的番茄植株叶片样品 , 利用提取缓冲液进行粗提的方法提取叶片中的汁液 ,
取 2μL点在尼龙膜上 , 利用 PSTVd双体探针进行杂交检测。以没接种的健康番茄叶片样品做为阴性
对照 , 以已知的马铃薯阳性样品为阳性对照 , 对接种番茄植株进行 PSTVd检测。
119　对马铃薯田间样品和保存品种资源试管苗材料的检测
对采自田间 , 类似 PSTVd症状的植株或薯块样品及我单位保存的马铃薯资源材料 , 共计 67份 ,
分别进行 NASH、RT2PCR和 R2PAGE检测。RT2PCR和 R2PAGE检测技术分别按照 Ryoji等 ( 2006)
和 Singh等 (1988) 的方法进行。其中 , 在 NASH检测方法中 , 样品核酸提取 , 分别采用酚 ∶氯仿抽
提和对组织样品粗提的方法进行。比较不同检测方法的阳性样品检出率。
2　结果与分析
211　探针灵敏性
对提取核酸样品 10倍稀释后 , 点在尼龙膜上。当核酸样品稀释到 0105 pg时 , Kodark胶片上显
示有黑色曝光斑点 , 当核酸样品稀释到 01005 pg时 , 没有产生黑色斑点 (图 1)。说明利用 PSTVd双
体探针检测 PSTVd灵敏度达到 0105 pg。
图 1　PSTVd cD NA双体探针灵敏度测试
1～7: 点取核酸量分别为 5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、015 pg、0105 pg和 01005 pg。
F ig. 1　Sen sitiv ity of d im er ic PSTVd cD NA probe
1 - 7: Total RNA 5 ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg, 015 pg, 0105 pg and 01005 pg, respectively.
212　探针专化性
阳性样品的薯块、叶片和芽 (A1、A2和 A3) 的杂交结果在 Kodark胶片上均产生黑色斑点 , 而
阴性样品的薯块、叶片和芽 (B1、B2和 B3) 的杂交结果在 Kodark胶片上均没有产生黑色斑点 (图
2) , 说明所制备的 cDNA双体探针特异性较好 , 且对样品的不同部位均可以得到一致的检测结果。
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图 2　PSTVd cD NA双体探针专化性测试
A. 阳性样品 ; B. 阴性样品 ; 1. 薯块 ; 2. 叶片 ; 3. 芽。
F ig. 2　Spec if ic ity of d im er ic PSTVd cD NA probe
A. Positive samp le; B. Negative samp le; 1. Tuber; 2. Leaf; 3. Sp rout.
213　对接种 PSTVd番茄植株的检测
如图 3所示 , 所接种的 19株番茄中有 18株有阳性斑点反应 , 有 1株 (B3) 没有产生斑点。其
中 , A2、A3、A4、A5和 B5样品阳性斑点反应较明显。对于 B2和 B3产生阳性斑点较弱的反应和没
有产生斑点反应的样品 , 又利用酚 ∶氯仿抽提的方法重新提取 RNA, 以 A6为阳性对照样品 , A7为阴
性对照样品 , 再进行杂交反应。结果 (图 4) 显示 , B2、A6产生阳性斑点 , 而 B3仍然没有产生阳性
斑点。说明 B3番茄植株 , 没有接种上 PSTVd。
214　对马铃薯田间样品和保存品种资源试管苗材料的检测
结果显示 , 在 67份被测样品中 , NASH技术 PSTVd阳性检出率分别为 6112% (粗提 ) 和 6517%
(酚 ∶氯仿抽提 )。利用酚 ∶氯仿抽提的核酸样品 , 通过 NASH技术检测结果与 RT2PCR检测结果相一
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致 , 而 R2PAGE的阳性样品检测率仅为 5317% , 低于 NASH和 RT2PCR检测方法 (表 2)。
表 2　来自黑龙江省不同地区田间侵染 PSTVd样品和品种资源材料的 NASH、RT2PCR和 R2PAGE检测结果
Table 2　NASH, RT2PCR and R2PAGE a ssay of PSTVd2infected f ield sam ples and
pota to resources from var ious reg ion s of He ilongjiang
来源
O rigin
材料类型
Type of
samp les
样品数量
Number of
samp les
核酸杂交技术 3 NASH
Crude RNA Purified RNA
反转录聚合酶
链式反应 3
RT2PCR 往返电泳技术 3R2PAGE
克山 Keshan Tubers 15 12 /15 14 /15 14 /15 11 /15
讷河 Nehe Tubers 15 10 /15 11 /15 11 /15 10 /15
巴彦 Bayan Plants 13 7 /13 7 /13 7 /13 6 /13
泰康 Taikang Tubers 6 4 /6 4 /6 4 /6 3 /6
哈尔滨 Harbin Plants 14 7 /14 7 /14 7 /14 5 /14
哈尔滨 Harbin Plantlets in vitro 4 1 /4 1 /4 1 /4 1 /4
总计 Total 67 41 /67 44 /67 44 /67 36 /67
阳性检出率 /% 6112 6517 6517 5317
Positive samp le detected percentage
　　3 : 检出样品数 /待测样品总数。3 : Number of positive p lants/number of analyzed p lants.
3　讨论
本研究利用基因克隆技术 , 构建了 PSTVd双体载体 , 并以此载体为模板 , 利用地高辛作为标记
物 , 通过 PCR技术 , 制备了 PSTVd双体 cDNA探针 , 并建立了 PSTVd的 NASH杂交体系。该体系检
测 PSTVd的灵敏度可以达到 0105 pg (图 1) , 是利用生物素标记的 cDNA单体探针检测灵敏度的 100
倍 (Nakahara et al. , 1998; 吕典秋 等 , 2005a, 2005b)。地高辛作为标记物具有信号稳定、安全、
灵敏度高等特点 ( Podleckis et al. , 1993; Maria et al. , 1996)。同时 , PSTVd双体探针由于比单体探
针长 , 因此可随机掺入的 D ig2dUTP数量多于单体探针 , 检测信号增强 , 灵敏度也就随之增高。
在样品组织部位对检测结果差异性方面也进行了研究。对马铃薯不同部位 , 叶片、薯块及芽方面
均可以检测到 PSTVd, 而且没有出现假阳性反应 (图 2)。Salazar等 (1988) 报道利用切口平移技术 ,
以 32 P做标记物进行 PSTVd检测 , 检测结果的灵敏度达到 0133 pg。Du等 (2007) 利用荧光素标记的
探针检测 RNA病毒和 PSTVd, 对于病毒 ( TMV RNA ) 的检测灵敏度达到 1171 pg。相比 , 我们通过
PCR方法制备的 PSTVd双体探针的检测灵敏度更高。
目前 , 一些新的类病毒及病毒检测技术已得到研究 , 如实时定量 RT2PCR技术 (Boonham et al. ,
2004)、一步 RT2PCR技术检测 PSTVd ( Ragozzino et al. , 2004)、RT2PCR探针捕获杂交技术 ( RT2
PCR p robe cap ture hybridization, RT2PCR2EL ISA) ( Sham loul & Hadidi, 1999; Sham loul et al. , 2002) 等
新型的 PCR技术已应用在类病毒检测上。NASH技术与其相比 , 在检测结果稳定性、检测样品数量
等方面更具有优势。另外 , 我们通过基因重组技术构建的 PSTVd双体探针在以往 NASH技术基础上 ,
进一步提高了检测灵敏度。
通过对采自田间的马铃薯植株叶片、块茎及保存的试管苗资源样品 67份 , 进行 RT2PCR、NASH
和 R2PAGE检测结果比较分析 , 利用酚 ∶氯仿进行核酸提取后的 NASH技术与 RT2PCR技术具有同样
的检测结果 , 阳性样品检出率相同 (6517% ) , 而对于粗提的植株组织样品的 NASH技术的阳性检出
率仅为 6112% , 低于 RT2PCR技术的阳性样品检出率 (6517% ) , 但高于 R2PAGE技术 (5317% )。
NASH技术的关键是探针的制备和高效杂交体系的建立 , 如果能进一步简化杂交反应程序 , 形成
商业化的杂交检测试剂盒 , 降低检测成本 , 该技术一定会在马铃薯生产及科研工作中得到更广泛的普
及和应用。
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