全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 561 - 564
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 01; 修回日期 : 2007 - 04 - 18
基金项目 : 河北省自然科学基金项目 (C2004000192、C2006000451) ; 河北农业大学博士、回国人员科研资助项目3 E2mail: shixx@hebau1edu1cn
苹果离体新梢外植体继代培养次数对其再生的影响
师校欣 3 , 杜国强 , 王　晨 , 马宝　, 葛一楠
(河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001)
摘 　要 : 对不同继代培养次数的富士、金冠、乔纳金苹果 (M alus dom estica Borkh. ) 组培离体新梢外
植体分别进行新梢增殖倍数、生根和叶片不定芽再生能力研究。结果表明 , 3个品种无菌繁殖系建立后第 5
次继代培养的离体新梢外植体的增殖倍数、生根和叶片不定芽再生能力均较低 ; 随继代次数增加 , 以上各
种器官再生能力稳定在较高水平 , 继代 76、164代的富士及 76、84、116代的金冠和乔纳金新梢外植体间
均无明显差别。说明苹果新梢外植体达到离体培养状态后经 20年 100余次继代培养 , 其器官再生能力没有
显著变化。
关键词 : 苹果 ; 继代培养次数 ; 增殖 ; 生根 ; 不定芽再生
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320561204
Effects of Subculture T im es on O rganogenesis Character istics of Apple in
V itro Shoot Explan ts
SH I Xiao2xin3 , DU Guo2qiang, WANG Chen, MA Bao2kun, and GE Yi2nan
(College of Horticu lture, A gricu ltura l U niversity of Hebei, B aoding, Hebei 071001, China)
Abstract: The organogenesis characteristics of app le (M alus dom estica Borkh. ) shoot exp lants repeated2
ly subcultured in vitro were exam ined by analysis of the shoot multip lication, rooting, and adventitious bud re2
generation rate from leaves. The results showed low p ropagation ability for the shoot exp lants subcultured in
vitro for five times or less at the beginning of inoculation in term s of its shoot multip lication, rooting, and ad2
ventitious bud regeneration rate from leaves. W ith the increasing number of subculturing times, the regenera2
tion ability of the organs above enhanced and remaind at a high level. There were no significant differences a2
mong the shoot p lantlets being subcultured for 76 and 164 times in Fuji, and for 76, 84, and 116 times in
Golden Delicious and Jonagold in the aspects of above. It is concluded that the app le shoot p lantlets repeatedly
subcultured in vitro for more than one hundred times for twenty years retain the organogenesis characteristics as
usual and can still be used for the p lant m icrop ropagation and gene transformation.
Key words: App le; Subculture times; Shoot multip lication; Rooting; Adventitious bud regeneration
苹果茎尖离体培养技术已广泛用于苗木的快速繁殖和种质保存等领域。组培无菌繁殖系在培养基
中生长调节剂的刺激下 , 分生组织不断分化 , 可连续继代增殖。有些材料长期继代培养仍可保持原来
的繁殖能力 , 如葡萄离体培养 48～80代后增殖倍数并未降低 (曹孜义和刘国民 , 1996)。杜国强等
(2006) 对 9～90代的苹果组培离体新梢进行同工酶、超薄层等电聚胶电泳及 RAPD分析 , 未发现变
异。也有的材料随继代次数的增加 , 繁殖能力会逐渐衰退 , 如梨 S系矮化砧、毛叶枣、辣椒枣、杉木
等表现增殖系数和生根率下降 (苏秀城 , 2000; 续九如 等 , 2003; 及华 等 , 2004; 杨晓霞和杨琳 ,
2005) , 变异机率也急剧增加 (Rodrigues et al. , 1998)。朱靖杰 (1995) 提出香蕉离体培养代数应小
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
于 10代。作者以不同继代次数的苹果离体新梢外植体为试材 , 进行继代增殖、生根和叶片不定芽诱
导等特性研究 , 以期为苹果组培离体快繁和种质保存提供依据。
1　材料与方法
以苹果 (M alus dom estica Borkh. ) 品种富士、金冠、乔纳金为试材 , 分别于 1985、1995、1996、
2005年的 5月剪取同一母株新梢外植体进行接种建立无性繁殖系。继代培养基为 MS + BA 110 mg·
L - 1 +NAA 0105 mg·L - 1 +白砂糖 3510 g·L - 1 +琼脂 610 g·L - 1。灭菌前培养基 pH值调至 518～610
(下同 )。以每年平均继代 8次计算其继代培养次数。
将在培养基上培养 30～35 d的不同继代培养次数的离体新梢外植体分别进行继代增殖、生根和
离体叶片不定芽诱导。继代增殖培养基同上。每瓶接 8～10个新梢外植体 , 每个外植体大小相近 , 新
梢所含芽数基本相同。
生根培养 : 切取生长健壮 , 均匀一致 , 株高在 115 cm以上的新梢接入 1 /2MS + IAA 110 mg·L - 1
+ IBA 014 mg·L - 1 +白砂糖 2215 g·L - 1 +琼脂 610 g·L - 1的生根培养基中。每瓶接种 12个外植体。
叶片不定芽诱导 : 取新梢顶部刚展开的嫩叶 , 垂直叶片中脉横切两刀 , 接种到 MS +BA 510 mg·
L - 1 (或 TDZ 110 mg·L - 1 ) +NAA 012 mg·L - 1 +白砂糖 3010 g·L - 1 +琼脂 610 g·L - 1的不定芽诱
导培养基上。每瓶接 9个叶片外植体。接种后先暗培养 3周 , 再转到光下培养。
培养温度 (25 ±3) ℃, 光照强度 2 000 lx, 光周期 (昼 /夜 ) 14 /10 h。
试验采用完全随机试验设计 , 调查数据利用 DPS统计软件进行方差分析。
2　结果与分析
211　不同次数继代培养的外植体的新梢增殖效果
由表 1可以看出 , 无论接种新梢或茎段外植体 , 富士、金冠、乔纳金品种不同代数的增殖效果表
现相同趋势。外植体接种当年 (5代之内 ) , 新建立的无菌繁殖系还未达到正常继代苗的状态 , 表现
繁殖苗数少 , 节间短 , 叶片较大、颜色较浅 ; 长期继代繁殖的组培新梢叶片变小 , 颜色嫩绿 , 繁殖倍
数明显提高且趋于稳定。富士 76代与 164代组培新梢 , 金冠、乔纳金 76、84、116代组培新梢继代
增殖时芽苗数和有效新梢数 (高度 ≥115 cm、能用于生根的新梢数 ) 均无显著差异。说明苹果组培
新梢经过近 20年的继代繁殖保存后 , 仍能保持原有的增殖能力。
表 1　继代培养次数不同的苹果离体新梢外植体繁殖的芽苗数和有效新梢数
Table 1　Tota l shoots and effective shoots genera ted from the explan ts subcultured in vitro for d ifferen t tim es in apple
外植体
Exp lants
继代次数
Times
富士 Fuji
芽苗 Shoots 有效新梢Effective shoots
金冠 Golden Delicious
芽苗 Shoots 有效新梢Effective shoots
乔纳金 Jonagold
芽苗 Shoots 有效新梢Effective shoots
新梢 Shoots 164 6143 a 1165 a - - - --
116 - - 8111 a 4116 a 4184 a 2195 a
84 - - 7149 a 4181 a 3168 a 2147 a
76 6104 a 2101 a 7105 a 5122 a 3187 a 2167 a
　5 1167 b 0127 b 1132 b 1106 b 1126 b 0193 b
茎段 Stem s 164 4105 a 0175 a - - - -
116 - - 3164 a 2114 a 2147 a 1140 a
84 - - 3153 a 2118 a 2124 a 1184 a
76 3119 a 0133 ab 4169 a 2118 a 2175a 1150 a
　5 1116 b 0120 b 1118 b 0199 a 1118 b 1100 a
　　注 : 表中同列数值后标记不同字母表示差异达 0105显著水平 , 下同。
Note: D ifferent letters following the data within each column rep resent the significance at P = 0105 level, The same below.
265
　3期 师校欣等 : 苹果离体新梢外植体继代培养次数对其再生的影响 　
212　不同继代培养次数新梢外植体的生根特性
离体新梢外植体接种 10 d左右 , 基部膨大 , 并出现白色愈伤组织 ; 14 d左右可观察到不定根产
生 , 其中富士生根较早 , 乔纳金其次 , 金冠最晚。3个品种组培新梢除第 5代生根效果很差甚至不生
根外 , 其它代数间生根率均无显著差异 (表 2) , 表明继代培养多年的组培新梢生根能力没有下降。
只是乔纳金 76代组培新梢比 116代生根条数少 , 是代数之间的差别 , 还是误差组成 , 还需进一步研
究。
表 2　不同继代培养次数对苹果组培新梢外植体生根能力的影响
Table 2　Effect of subcultur ing tim es on in vitro rooting ab ility of apple shoot explan ts
继代次数
Times
富士 Fuji
生根率
Rooting rate ( % )
生根条数
Number of roots
per shoot
金冠 Golden Delicious
生根率
Rooting rate ( % )
生根条数
Number of roots
per shoot
乔纳金 Jonagold
生根率
Rooting rate ( % )
生根条数
Number of roots
per shoot
164 69112 a 4194 a - - - -
116 - - 8717 a 3187 a 9112 a 4174 a
84 - - 6518 a 3166 a 7319 a 3143 ab
76 57124 a 3177 a 7113 a 2129 ab 9411 a 3113 b
　5 0 b 0 b 2317 b 1146 b 311 b 0156 c
213　不同次数继代培养的离体新梢上的叶片外植体不定芽的再生能力
叶片外植体接种 10 d后膨大皱缩 , 伤口边缘均见少量白色致密的愈伤组织。两周后叶片多转为
黄色 , 少数有嫩黄绿色不定芽出现。3周后将叶片转到光下培养 , 不定芽转绿 , 大量叶片产生不定
芽。不同代数间叶片的形态变化没有差别。
叶片不定芽的再生情况与继代培养次数有关 , 也与培养基成分有关 , 附加 TDZ的培养基上叶片
不定芽再生率显著高于附加 BA的培养基 , 尤其对较难再生的富士品种差异更大。富士和乔纳金品种
继代 5次的组培新梢叶片外植体不定芽再生能力较差 , 74代后稳定在较高水平。金冠品种基本也符
合上述规律 , 只是部分试验中第 76代新梢叶片外植体再生率和出芽数偏低 (表 3)。
表 3　不同继代培养次数对苹果组培新梢离体叶片外植体不定芽再生的影响
Table 3　Effect of subcultur ing tim es on adven titious bud regenera tion from the leaf explan ts of in vitro shoots
继代次数
Times
植物生长调节剂
Regulators (mg·L - 1 )
BA TDZ NAA
富士 Fuji
再生率
Regeneration
rate ( % )
出芽数
Number of
buds
金冠 Golden Delicious
再生率
Regeneration
rate ( % )
出芽数
Number of
buds
乔纳金 Jonagold
再生率
Regeneration
rate ( % )
出芽数
Number of
buds
164 510 0 012 1615 a 1117 a - - - -
116 510 0 012 - - 6113 a 2199 a 9116 a 4105 a
84 510 0 012 - - 5119 a 3120 a 9816 a 4177 a
76 510 0 012 113 a 0133 a 3616 b 1180 ab 8610 a 4107 a
　5 510 0 012 0 a 0 a 1413 c 0135 b 4116 b 1194 b
164 0 110 012 8919 a 4147 a - - - -
116 0 110 012 - - 9711 a 8193 b 9516 a 11126 a
84 0 110 012 - - 8914 a 11119 a 9914 a 13102 a
76 0 110 012 8814 a 3192 ab 8914 a 7149 b 10010 a 11107 a
　5 0 110 012 3816 b 1107 b 3616 b 4123 c 4914 b 5167 b
3　讨论
据报道 , 多种植物离体新梢培养初期 , 继代增殖和生根能力较低 , 随继代次数增加 , 繁殖能力显
著增加 , 但增殖倍数不能随继代次数的增多无限扩大 , 而是在某一代或几代达到顶峰之后 , 又呈下降
365
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
趋势 , 如杜鹃离体新梢在继代 4～5代之后增殖倍数开始降低 (曹孜义和刘国民 , 1996) ; 梨 S系矮
化砧离体新梢在继代培养 17代以后增殖倍数开始下降 (及华 等 , 2004) ; 毛叶枣 6代时新梢增殖倍
数达到最高峰 (续九如 等 , 2003) ; 杉木无性系组织培养中 , 继代培养次数以 8～9代之内为宜 (苏
秀城 , 2000) ; 云南 　木前 6代新梢生根率极低 , 从 7代开始迅速提高 , 8～10代达到最高峰 , 之后
缓慢下降 (杨晓霞和杨琳 , 2005)。具体原因尚未有统一结论 , 推测与组培苗中的激素积累水平和对
植物生长调节剂的敏感程度有关。
不同代数苹果离体新梢的器官再生特性与上述植物表现不完全相同。常永键 ( 1988) 提出继代
不足 8代的富士、新红星品种组培新梢生根能力很差 , 12代后稳定在较高水平 ; 师校欣等 ( 1999)
对 16、24、56代乔纳金组培新梢进行叶片离体不定芽再生研究时发现 , 继代代数由 16代增加到 24
代 , 其再生能力明显提高 , 增至 56代 , 差异不显著。本试验结果表明 , 5代以内的苹果组培新梢继
代增殖倍数、生根和叶片不定芽再生能力均较低 , 不适合进行快速繁殖 , 也不适于叶盘法基因转化 ;
随继代次数增加 , 以上各种繁殖能力稳定在较高水平 , 继代次数为 76、164代的富士及 76、84、116
代的金冠和乔纳金组培新梢间均无明显差别。说明苹果离体新梢达到继代培养状态后经 20年 100余
次继代培养 , 其器官再生能力没有显著变化。目前本实验室仍用这些试材进行基因转化等研究。
References
Cao Zi2yi, L iu Guo2m in. 1996. A course in p ractical p lant tissue culture technology. Lanzhou: Gansu Science and Technology Press. ( in Chi2
nese)
曹孜义 , 刘国民. 1996. 实用植物组织培养技术教程. 兰州 : 甘肃科学技术出版社.
Chang Yong2jian. 1988. Studies on in vitro rooting and transp lanting of app le cultivar p lantlets [M1D1D issertation ]. Baoding: Agricultural Uni2
versity of Hebei. ( in Chinese)
常永键. 1988. 苹果试管苗生根及其移栽的研究 [硕士论文 ]. 保定 : 河北农业大学.
Du Guo2qiang, Shi Xiao2xin, ZhangQ ing2liang. 2006. Isozyme patterns and RAPD analysis of app le p lantlets repeatedly subcultured in vitro. Acta
Horticulturae Sinica, 33 (1) : 33 - 37. ( in Chinese)
杜国强 , 师校欣 , 张庆良. 2006. 苹果不同继代次数组培苗同工酶酶谱及 RAPD分析. 园艺学报 , 33 (1) : 33 - 37.
J i Hua, Zhang Hai2xin, Zhao Yu2fen. 2004. Influencing factors on multip lication coefficient and regeneration quality of adventitious shoots of the
S series dwarfing rootstock of pear. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 8 (2) : 40 - 44. ( in Chinese)
及　华 , 张海新 , 赵玉芬. 2004. 梨 S系矮化砧组培苗增殖系数和质量的影响因子. 河北农业科学 , 8 (2) : 40 - 44.
Rodrigues P H V, Tulmann Neto A, Cassieri N P. 1998. Influence of the number of subcultures on somaclonal variation in m icrop ropagated Nani2
cao (M usa spp, AAA group) . Acta Horticulture, 490: 469 - 473.
Shi Xiao2xin, Du Guo2qiang, Gao Yi. 1999. H igh adventitious shoot regeneration from leaves in vitro of app le cultivars. Journal of Fruit Science,
16 (4) : 255 - 258. ( in Chinese)
师校欣 , 杜国强 , 高　仪. 1999. 苹果离体叶片高效再生不定芽技术研究. 果树科学 , 16 (4) : 255 - 258.
Su Xiu2cheng. 2000. Study on the differences of the seedling of different generations from successive tissue culture of Chinese fir clone. Journal of
Fujian College of Forestry, 20 (4) : 353 - 356. ( in Chinese)
苏秀城. 2000. 杉木无性系不同继代代数组培苗差异研究. 福建林学院学报 , 20 (4) : 353 - 356.
Xu J iu2ru, L i Chun2li, Sun J ian2she. 2003. M icrop ropagation of ber ( Z iziphus m auritiana Lam. ) . Journal of Beijing Forestry University, 25
(3) : 28 - 32. ( in Chinese)
续九如 , 李春立 , 孙建设. 2003. 毛叶枣组培快繁技术研究. 北京林业大学学报 , 25 (3) : 28 - 32.
Yang Xiao2xia, Yang L in. 2005. Test on tissue culture of A ralia thom snii. Trop ical Agricultural Science Technology, 28 (3) : 21 - 23. ( in Chi2
nese)
杨晓霞 , 杨　琳. 2005. 云南　木组织培养快速繁殖试验. 热带农业科技 , 28 (3) : 21 - 23.
Zhu J ing2jie. 1995. Variation and its controlling during tissue culture in vitro in banana. Journal of Fruit Science, 12 (2) : 120 - 122. ( in Chi2
nese)
朱靖杰. 1995. 香蕉组织培养中变异的发生与控制途径. 果树科学 , 12 (2) : 120 - 122.
465