全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1179～1184
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 02 - 25; 修回日期 : 2006 - 04 - 24
基金项目 : 农业部 ‘948’项目 (20062G28) ; 西北农林科技大学 ‘拔尖人才支持计划’项目 (200522)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fwm64@ sina1com)
外源抗坏血酸对离体苹果叶片衰老的影响
马春花 1 　马锋旺 1, 23 　李明军 1 　韩明玉 1 　束怀瑞 1, 2
(1 西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 2 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018)
摘 　要 : 以苹果 (M alus dom estica Borkh. ) 品种 ‘嘎拉 ’秋梢成熟叶片为试材 , 在 5 mmol·L - 1抗坏血
酸 (A sA) 培养条件下 , 研究了外源 A sA对离体苹果叶片衰老过程 ( 0～72 h) 中抗坏血酸 —谷胱甘肽
(A sA - GSH) 循环各组分和 A sA合成关键酶 L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯脱氢酶 ( GalLDH) 的影响。结果表
明 , 外源 A sA部分抑制了离体苹果叶片衰老过程中膜脂过氧化 , 降低了 H2 O2含量 , 但对表示膜损伤的相
对膜透性影响不大。对 A sA - GSH循环各组分来说 , 外源 A sA维持了叶片衰老过程中抗坏血酸过氧化物酶
(APX) 和脱氢抗坏血酸还原酶 (DAHR) 的高活性 , 部分抑制了单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDHAR) 活性
的下降 , 同时降低了 GSH的氧化程度 , 从而提高了 A sA含量和再生能力。外源 A sA在衰老前期抑制了
GalLDH活性 , 降低了 A sA的合成能力 , 而后期维持了 GalLDH的高活性。
关键词 : 苹果 ; 抗坏血酸 ; 离体叶片 ; 衰老
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621179206
Effects of Exogenous A scorb ic Ac id on Senescence of D etached Apple L eaves
Ma Chunhua1 , Ma Fengwang1, 23 , L iM ingjun1 , Han M ingyu1 , and Shu Huairui1, 2
(1 College of Horticulture, N orthw est A & F U niversity, Yang ling, Shaanxi 712100, Ch ina; 2 College of Horticulture Science and
Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian, Shandong 271018, Ch ina)
Abstract: Effects of exogenous A sA on ascorbate glutathione cycle and activity of GalLDH - a key en2
zyme for ascorbic acid biosynthesiswere investigated during senescence of detached leaves of app le (M a lus do2
m estica Borkh. ‘Gala’) in this paper. The results showed that 5 mmol·L - 1 exogenous A sA inhibited par2
tially membrane lip id peroxidation and decreased H2 O2 content, but had little effect on relative membrane per2
meability. Exogenous A sA maintained high activities of ascorbate peroxidase (APX) and dehydroascorbate re2
ductase (DHAR) , but inhibited partially the activity decline of monodehydroascorbate reductase (MDHAR) ,
and decreased ratio of oxidized glutathione ( GSSG) , then increased A sA content and regeneration ability ac2
cordingly. However, exogenous A sA inhibited the activity of L2galactono21, 42lactone dehydrogenase ( GalL2
DH ) in the beginning of senescence and decreased ability of A sA synthesis, but latermaintained higher activi2
ty of GalLDH.
Key words: App le; Exogenous ascorbic acid; Detached leave; Senescence
抗坏血酸 (A sA) 是植物体内重要的抗氧化剂和许多与细胞代谢相关酶的辅因子〔1〕。近年 Barth
等对 A sA缺乏拟南芥突变体的研究发现 , A sA水平与植物衰老进程有关〔2〕。植物体内 A sA水平除了
生物合成外 , 还可以通过再生途径得以调节。抗坏血酸 —谷胱甘肽 (A sA - GSH ) 循环不仅是作为
A sA再生的主要途径 , 更是 A sA作为抗氧化剂清除活性氧 (ROS) 的方式之一。而植物体的衰老伴
随着生物自由基的大量产生 , 它的及时清除对延缓植物衰老极为重要〔3, 4〕。研究表明 , 外源 A sA可增
加植物对氧化胁迫的适应〔5, 6〕。但关于植物衰老过程中外源 A sA对 A sA - GSH循环及 A sA合成的影
响 , 至今尚未见到系统报道。
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作者以 ‘嘎拉 ’苹果叶片为试材 , 通过叶柄施加 5 mmol·L - 1 A sA, 研究了离体苹果叶片衰老过
程中 A sA - GSH循环及 A sA合成酶 L - 半乳糖酸 - 1, 4 - 内酯脱氢酶 ( GalLDH ) 活性的变化情况 ,
以探讨植物衰老与 A sA - GSH循环及 A sA合成的关系 , 为延缓植物衰老研究提供理论依据。
1　材料与方法
选择西北农林科技大学园艺场长势一致的 5年生 ‘嘎拉 ’苹果 (M alus dom estica Borkh.‘Gala’)
树 , 于 2005年 8月初对外围新生秋梢上的新叶进行标记并记时 , 9月 20日采摘标记过的正常叶片
(叶龄 45～50 d) 为材料。
通过叶柄施加 5 mmol·L - 1外源 A sA (将叶柄浸在液体中 , pH 610 ) , 以水为对照 , 在 HPG2
280HX气候植物箱 (光照 7 500 lx, 温度 22℃, 相对湿度 70% ) 中培养 , 分别在 0、6、12、24、36、
48和 72 h取样 , 投入液氮速冻 , - 70℃保存 , 用于测定相对膜透性和 MDA含量〔7〕, H2 O2含量〔8〕,
抗坏血酸过氧化物酶 (APX )〔9〕、脱氢抗坏血酸还原酶 ( DAHR ) 和单脱氢抗坏血酸还原酶
(MDHAR)〔10〕、L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯脱氢酶 ( GalLDH ) 活性〔11〕, 抗坏血酸 (A sA )、脱氢抗坏
血酸 (DHA )〔12〕、谷胱甘肽 ( GSH) 和氧化型谷胱甘肽 ( GSSG) 含量〔10〕。
APX、MDHAR和 DHAR酶的提取 : 称取 013 g苹果叶片 , 在含 011 mmol·L - 1 EDTA、013%
Triton X2100和 4% (W /V ) PVP的 50 mmol·L - 1磷酸缓冲液 ( pH 715) 中研磨成匀浆 , 定容至 6
mL, 16 000 ×g, 2℃离心 15 m in, 上清液即为酶液。
GalLDH活性测定 : 称取 110 g苹果叶片在含 014 mol·L - 1蔗糖、10%甘油、30 mmol·L - 1巯基乙
醇、1 mmol·L - 1 EDTA、1% (W /V) PVP的 011 mol·L - 1 PBS (pH 714) 中研磨成匀浆。匀浆液在
500 ×g, 2℃离心 15 m in, 收集上清液 , 然后于 22 000 ×g, 2℃离心 20 m in, 弃上清液。沉淀用 2 mL
含 10%甘油、5 mmol·L - 1 GSH的 50 mmol·L - 1 Tris2HCl (pH 815) 悬浮 , 即为酶液。3 mL反应体系
含 50 mol·L - 1 Tris2HCl (pH 810)、011% Triton X2100、011 mmol·L - 1 NaN3、0102 mmol·L - 1 Cytc、
415 mmol·L - 1 L2GL及 012 mL酶液。25℃下测定 525 nm处还原态 Cytc的生成。酶活力单位定义为 :
1 m in内氧化 1μmol的 L - 半乳糖酸 -γ - 内酯 (或生成 2μmol还原态 Cytc) 为 1个酶活力单位
(U)。
DHA、GR、NADH、NADPH、L2GL和 Cytc购自 Sigma公司 , 酶活性测定采用 UV22550分光光度
计 , 数据统计分析采用 DPS数据处理系统。
2　结果与分析
211　外源 A sA对离体苹果叶片相对膜透性、MDA和 H2 O2含量的影响
在离体苹果叶片衰老过程中 , 相对膜透性和 MDA 含量都显著上升 , 且在 72 h时分别增加了
79130%和 69140%。在外源 A sA作用下 , 与对照相比 , 相对膜透性虽有所下降 , 但变化不大 , 且 30
h后大于对照 ; 而 MDA含量明显降低。
H2 O2含量在衰老中也显著上升 , 在 72 h时增加了 51189% , 外源 A sA处理显著降低了其含量
(图 1)。
212　外源 A sA对离体苹果叶片 A sA - GSH循环系统相关酶活性的影响
由图 2可以看出 , 在离体叶片衰老过程中 , APX活性在 18 h前明显上升而后开始下降。在外源
A sA作用下 , APX活性在衰老前期低于对照 , 但 18 h后却明显高于对照 , 72 h时比对照高 10199%。
MDHAR活性随着衰老时间延长一直下降 , 在 72 h时下降了 65132%。外源 A sA处理使 MDHAR
活性的下降明显减缓 , 72 h时比对照高 49195%。
DAHR活性在 30 h时上升了 26158%而后开始下降。外源 A sA处理使 DHAR活性 30 h前明显低
于对照 , 之后显著高于对照 , 在 72 h时比对照高 38184%。
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　6期 马春花等 : 外源抗坏血酸对离体苹果叶片衰老的影响 　
图 1　外源 A sA对离体苹果叶片相对膜透性、MDA
和 H2O 2 含量的影响
不同的字母表示差异显著 ( P < 0105)。
F ig. 1　Effects of exogenous A sA on rela tive m em brane
perm eab ility and con ten ts of MDA and H2O 2 in
detached apple leaves
The different letters indicate the significance at level of 0105. 图 2　外源 A sA对离体苹果叶片 APX、MD HAR和D HAR活性的影响不同的字母表示差异显著 ( P < 0105)。F ig. 2　Effects of exogenous A sA on activ ity of APX, MD HARand D HAR in detached apple leavesThe different letters indicate the significance at level of 0105.
213　外源 A sA对离体苹果叶片 Ga lLD H活性的
影响
作为合成 A sA过程中最后 1个关键酶 , 在离
体叶片衰老过程中 , GalLDH活性在 6 h时上升了
67171%而后开始明显下降 , 这说明苹果叶片
GalLDH对衰老的反应相当迅速。
外源 A sA处理的叶片 GalLDH活性与对照变
化趋势一致 , 开始低于对照 , 在 6 h达到最高 ,
但 18 h时后高于对照 , 且在 72 h时比对照高
42183% (图 3)。
214　外源 A sA对离体苹果叶片 A sA和 D HA的
影响
图 4表明 , 在苹果离体叶片衰老过程中 , 对
图 3　外源 A sA对离体苹果叶片 Ga lLD H活性的影响
不同的字母表示差异显著 ( P < 0105)。
F ig. 3　Effects of exogenous A sA on activ ity of Ga lLD H
in detached apple leaves
The different letters indicate the significance at level of 0105.
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照 A sA库和 A sA含量变化趋势一致 , 在 12 h增长幅度最大 , 分别增长了 12153%和 15164% , 而后开
始下降。外源 A sA处理的叶片 A sA库和 A sA含量随时间延长一直处于上升状态 , 且高于对照。在此
过程中 , DHA含量均一直处于上升状态。反映抗坏血酸氧化还原状态的 A sA /DHA比值随时间的延长
基本呈下降状态。外源 A sA处理的叶片 A sA /DHA比值和对照变化趋势基本一致。
215　外源 A sA对离体苹果叶片 GSH和 GSSG的影响
GSH在叶片衰老过程中下降 , 在 72 h时下降了 49157% ; 而外源 A sA处理的叶片却先上升后下
降 , 但一直高于对照 , 在 18 h时比对照高 36194% (图 5)。GSSG在叶片衰老过程中上升 , 且在 72 h
时比 0 h上升了 2倍多 ; 外源 A sA处理也处于上升状态 , 但一直低于对照。在此过程中 , 表示谷胱甘
肽氧化还原势的 GSH /GSSG比值明显下降 , 而外源 A sA处理的叶片 GSH /GSSG比值却先上升后下降 ,
但一直高于对照。
3　讨论
离体苹果叶片在通过施加 5 mmol·L - 1外源 A sA的培养条件下 , 与对照相比 , MDA和 H2O2 含量
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　6期 马春花等 : 外源抗坏血酸对离体苹果叶片衰老的影响 　
明显下降 , 说明增加 A sA的水平能部分抑制膜脂过氧化 , 但对膜损伤的影响不大。这可能是由于外
源 A sA延缓衰老的效应与降低 ROS对植物一些必要蛋白和 /或核酸的破坏更为相关〔5〕。
离体苹果叶片衰老过程中 , 在 H2 O2含量和 A sA水平增加的诱导下〔13〕, 18 h前 APX活性明显上
升 ; 而后随 H2 O2的大量产生 , 还原态 A sA相对下降 , 使 APX部分失活。5 mmol·L - 1外源 A sA的存
在下 , 衰老前期低的 H2O2水平决定了比对照低的 APX活性 , 而后期高的 A sA水平又保持了明显高于
对照的 APX活性 (图 2)。APX清除 H2O2同时 , 氧化 A sA生成的 MDHA一部分可被 MDHAR还原为
A sA , 另一部分通过非酶岐化反应生成 DHA〔1〕。DHAR能利用 GSH为电子供体经 A sA - GSH循环将
DHA还原为 A sA。DHA若不能及时被还原 , 可能降解成酒石酸和 /或草酸〔3〕。因而 MDHAR和 DHAR
对 A sA的再生和保持胞内 A sA水平极其重要。离体苹果叶片衰老过程中 , MDHAR活性显著下降 ; 而
DHAR活性明显上升。这说明 MDHAR在衰老中受到了抑制 ; 而 DHAR对在衰老过程中保持胞内 A sA
水平及氧化还原状态的平衡 , 延缓植物衰老极为重要。外源 A sA的存在下 , MDHAR的下降速率减
慢 ; 而对于 DHAR, 在衰老前期低于对照 (图 2) , 但后期却保持了高的活性 , 这说明外源 A sA能提
高植物衰老过程中胞内 A sA的再生能力。
GSH作为 DHA的电子供体 , 其氧化还原态是通过 A sA - GSH循环来与 A sA联系的。GSH不仅
在加快 A sA再生上有重要作用且本身也是生物体内重要的抗氧化剂〔14〕。在离体苹果叶片衰老过程
中 , GSH库水平都先上升后下降 ; 这说明衰老开始时 , 叶片通过 GSH库水平的上升来增加抵御能
力 , 但随着衰老加剧 , GSH库含量开始下降 , 同时表示其氧化还原状态的 GSH /GSSG比值也明显
下降。在外源 A sA存在下 , 提高 GSH库水平 , 降低了 GSH氧化程度 (图 5)。这说明外源 A sA能
提高内源 GSH含量 , 进而一方面增强了 A sA的再生能力 , 另一方面提高了 GSH本身的抗氧化功
能。
A sA含量和氧化还原状态的变化反映了植物对环境变化的响应〔3〕。离体苹果叶片在衰老过程中 ,
A sA库和 A sA含量在衰老初期有所上升 , 而后基本没明显变化 ; DHA含量显著上升 , 使 A sA的氧化
程度加大。在叶柄施加 5 mmol·L - 1外源 A sA的作用下 , 胞内 A sA库和 A sA含量在衰老初期上升幅
度不大 , 但后期却显著上升 , 同时 DHA含量也明显高于对照 (图 4)。这可能是由于叶柄对 A sA的特
异吸收相当低或不存在 , 而在后期由于叶片吸水能力的加强 , 大量 A sA可能伴随水分进入叶肉细胞。
植物体内 A sA生物合成途径已逐渐揭示 , 无论是合成 A sA主要的 L - 半乳糖途径 , 还是交替的
糖醛酸途径 , 最后一步都是由 GalLDH催化 L -半乳糖 -γ -内酯 ( GL) 生成 A sA来影响体内 A sA水
平〔15〕。在离体苹果叶片衰老过程中 , GalLDH在 6 h时活性已达最高 , 但随着衰老时间的延长 , 开始
下降 (图 3)。说明在此过程中 , A sA的合成能力初期增加 , 而后随衰老的加剧又下降 ; 且 GalLDH
对衰老的反应相当迅速。外源 A sA的存在下 , GalLDH活性在衰老前期 , 相对于对照明显下降 , 而 18
h后明显高于对照 , 这表明外源 A sA抑制了 GalLDH活性〔15〕, 降低了 A sA的合成能力 ; 而后期由于
外源 A sA延缓了衰老 , 进而保持了 GalLDH的高活性。Davey等认为当植物处于特殊生理环境时 , 如
衰老、果实成熟或软化等过程中 , 糖醛酸途径可能是 A sA合成的一种交替途径〔3〕, 要清楚衰老过程
中糖醛酸转变途径的过程、生理作用以及与 L -半乳糖途径之间的关系 , 有待进一步研究。
本试验中 , 5 mmol·L - 1的外源 A sA部分抑制了离体苹果叶片衰老过程中膜脂过氧化 , 这与Barth
等通过对 A sA缺乏的拟南芥突变株 vtc1的研究发现外源 A sA能使某些衰老相关基因 (SAG s) 的表达
降到野生型水平 , 延缓衰老进程的报道〔2〕一致。E I2Shora的研究也表明外源 A sA可抑制铜胁迫引起的
植物加速衰老〔6〕。但他们的研究主要集中在外源 A sA与膜质过氧化上 , 而本试验在国内首次系统研
究了外源 A sA对离体苹果叶片衰老过程中 A sA - GSH循环及 GalLDH活性的影响 , 并报道了 A sA -
GSH循环各组分及 GalLDH活性在离体苹果叶片衰老过程中的变化趋势 , 为延缓植物衰老提供了理论
基础。
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