全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 289 - 294
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 07 - 12; 修回日期 : 2007 - 12 - 04
基金项目 : 福建省自然科学基金项目 (B0410007)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: biohuang@fjnu1edu1cn)
建兰 38个品种的 RAPD分析
胡　薇 1 , 黄儒珠 13 , 潘晓华 1 , 李锦凤 2 , 孙　端 3
(1 福建师范大学生命科学学院 , 福州 350108; 2 中国兰协建兰样品园 , 福建上杭 364200; 3 福建省林业检查总站 ,
福州 350003)
摘 　要 : 应用 RAPD标记对建兰 38个品种的遗传多样性和亲缘关系进行分析。用筛选的 18个 10 bp随
机引物对其 DNA进行 PCR扩增 , 共扩增出 116个位点 , 其中多态位点 103个 , 多态位点比率占 88179% ,
表明建兰 38个品种具有丰富的遗传多样性。38个品种间的遗传距离为 010420～015385 (均值 012902)。基
于 RAPD标记的建兰 38个品种的 UPGMA聚类结果支持将建兰分为彩心和素心两个变种 , 以及素心多由彩
心变异而来的传统分类观点。研究发现 : 引物 S153 - 650 bp位点是 ‘闽西鱼魫 ’、‘鱼魫大贡 ’、‘鱼魫 ’
和 ‘银边鱼魫 ’的特异标记 , 引物 S38 - 1 200 bp位点是 ‘十六罗汉 ’和 ‘鱼魫 ’的特异标记 , 引物 S38
- 800 bp位点缺失是 ‘马耳四季 ’的特异标记。
关键词 : 建兰 ; 品种 ; 遗传多样性 ; 聚类分析 ; RAPD
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220289206
RAPD Ana lysis of Th irty2e ight C ym bidium ensifo lium Cultivars
HU W ei1 , HUANG Ru2zhu13 , PAN Xiao2hua1 , L I J in2feng2 , and SUN Duan3
(1 College of L ife Sciences, Fujian N orm al U niversity, Fuzhou 350108, China; 2 Cym bid ium ensifolium Garden, Chinese Cym bid i2
um A ssociation, Shanghang, Fu jian 364200, China; 3 The General Inspection S tation of Forestry of Fu jian Province, Fuzhou
350003, Ch ina)
Abstract: DNA from thirty2eight Cym bid ium ensifolium cultivars was exam ined using polymerase chain
reaction ( PCR) to determ ine the efficiency of random ly amp lified polymorphic DNA (RAPD ) markers in ge2
netic diversity and genetic relationship. A total of 116 RAPD markers, 88179% of which were polymorphic,
were p roduced from 18 arbitrary p rimers of 10 bp. Genetic distances among the cultivars were estimated based
on the amount of band sharing and ranged from 010420 - 015385 with an average of 012902. Unweighted pair2
group method with arithmetic averaging (UPGMA ) of genetic distances estimates grouped‘suxin’cultivars
and‘caixin’cultivars together with each other, and‘suxin’cultivars diverged from‘caixin’cultivars,
thereby agreeing with known traditional classification information. Four cultivars,‘M inxi Yuchen’, ‘Yuchen
Dagong’, ‘Yuchen’and‘Yinbian Yuchen’could be distinguished from all the rest based only on the S153
- 650 bp fragment, and‘Shiliu Luohan’and‘Yuchen’based only on the S38 - 1 200 bp fragment. ‘Mapier
Siji’could be differentiated from all the rest by lack of the S38 - 800 bp fragment.
Key words: Cym bid ium ensifolium ; cultivar; genetic diversity; cluster analysis; RAPD
中国兰花 (Chinese cymbidium) 通常是指兰科 (O rchidaceae) 兰属 (Cym bid ium ) 植物中的部分
地生种 , 如春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰等。建兰 (Cym bid ium ensifolium ) 有很高的观赏和经济价
值 , 是最早出口的国兰之一。由于自然群体杂交和人工栽培选育的结果 , 建兰存在着较大的遗传分化
和种间类型 , 遗传多样性高 , 传统的分类方法往往难以区分种及品种。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
国内外应用 RAPD标记对兰属植物种及品种的遗传多样性、亲缘关系以及品种鉴定等方面的研究
已有报道。例如 , 孙彩云等 (2005) 应用 RAPD标记对中国兰属的 28个原生种和部分种的不同品种
及杂交种的亲缘关系进行分析 ; 谢伟等 (2005) 对兰属 7个种的 9个品种进行 RAPD鉴定和亲缘关系
分析 ; 梁红健等 (1996) 用 RAPD标记对中国兰属的 5个种 19个品种的亲缘关系进行探讨 ; 王健等
(2006) 对 16种有香和无香春兰的基因组 DNA进行 RAPD标记 , 发现引物 BA0088对春兰的扩增产
物中有一特异条带 (370 bp ) 可能与春兰香味性状有关。Obara2Okeyo和 Kako (1998) 对 36个大花
蕙兰 (Cym bid ium hybrid ium ) 栽培品种的遗传多样性进行 RAPD分析。
作者集中对建兰 38个品种进行 RAPD标记 , 旨在为建兰遗传多样性研究、分类鉴定和亲缘关系
分析 , 以及资源的保护和开发利用提供依据。
1　材料与方法
111　材料
供试建兰 38个品种取自福建省龙岩市上杭县古田镇中国兰协建兰样品园 (1～24号 ) 和连城县
朋口镇福建兰花基地 (25～38号 ) , 其中 20～30号为彩心品种 , 其余为素心品种 (表 1)。建兰 38
个品种中除 21号 ‘娇鹤 ’、24号 ‘飞天 ’和 30号 ‘宝岛胭脂 ’引种自中国台湾省外 , 其余均为福建
地产兰。
表 1　供试 38个建兰品种
Table 1　Th irty2e ight Cym bidium ensifo lium cultivars
编号
Code
品种
Cultivar
编号
Code
品种
Cultivar
1 龙岩素 Longyansu 20 金边丫兰 J inbian Yalan
2 闽西鱼魫 M inxi Yuchen 21 娇鹤 J iaohe
3 铁骨素 Tiegusu 22 黄袍 Huangpao
4 古田如意素 Gutian Ruyisu 23 四季大青 Siji Daqing
5 长汀素 Changtingsu 24 飞天 Feitian
6 十六罗汉 Shiliu Luohan 25 十八学士 Shiba Xueshi
7 十三太保 Shisan Taibao 26 梅花山大荷 Meihuashan Dahe
8 龙岩十八开 Longyan Shibakai 27 立叶剑蕙 L iye J ianhui
9 武夷素 W uyisu 28 银边四季 Yinbian Siji
10 古蛟素 Gujiaosu 29 马耳四季 Mapier Siji
11 鱼魫大贡 Yuchen Dagong 30 宝岛胭脂 Baodao Yanzhi
12 尤溪素 Youxisu 31 连城素 L ianchengsu
13 永福素 Yongfusu 32 建荷素 J ianhesu
14 鱼魫 Yuchen 33 玉女素 Yunüsu
15 金丝马尾 J insiMawei 34 大叶铁骨素 Daye Tiegusu
16 金嘴龙岩素 J inzui Longyansu 35 荷花素 Hehuasu
17 银边大贡 Yinbian Dagong 36 麒麟四季 Q ilin Siji
18 伞斑龙岩素 Sanban Longyansu 37 永安素 Yongpiansu
19 铁骨银针 Tiegu Yinzhen 38 银边鱼魫 Yinbian Yuchen
112　方法
用手术剪剪取建兰嫩叶 012 g, 置研钵中 , 加 2 mL SDS高盐提取介质 [ 100 mmol·L - 1 Tris (pH
810) , 50 mmol·L - 1 EDTA (pH 810) , 500 mmol·L - 1 NaCl, 2% SDS, 2%β -巯基乙醇 ] 和少量石英
砂 , 迅速研磨 , 匀浆移至 2 mL的 Eppendorf管中 , 带回实验室 , 置 - 18 ℃冰箱保存。
DNA提取及质量检测按胡薇等 (2004) 的方法进行。
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　2期 胡 　薇等 : 建兰 38个品种的 RAPD分析 　
以提取的 DNA为模板 , 用 RAPD引物 (10 bp) 在 B IO2RAD GENE CYCLER PCR仪上进行 RAPD
扩增反应。
反应体系 : 总体积 20μL, 含 40 ng基因组 DNA, 115μmol·L - 1引物 , 2 mmol·L - 1MgCl2 , 50
μmol·L - 1 dNTP, 1 U Taq DNA聚合酶及其 Buffer。扩增程序 : 94 ℃预变性 200 s; 94 ℃变性 30 s,
37 ℃复性 60 s, 72 ℃延伸 120 s, 循环 42次 ; 最后 72 ℃延伸 5 m in。
取 10μL反应产物 , 上样于 112%琼脂糖凝胶 , 在 3 V·cm - 1电场中电泳 , 溴乙锭染色后在 WD2
9403C型紫外分析仪上检测并拍照记录。
试验所用 DNA Marker、MgCl2、dNTP、 Taq DNA聚合酶及其 Buffer购自大连宝生物工程有限公
司。引物及其余试剂购自上海生工生物工程技术有限公司。
113　数据处理
根据电泳结果 , 记录清晰可重复的 DNA电泳条带 , 对同一引物的扩增产物 , 迁移率相同的条带
记为一个位点 , 扩增阳性记为 1, 阴性记为 0。采集的数据输入 Excel 2000, 建立表征数据矩阵。计
算多态位点比率 (percentage of polymorphic loci, PPL)。运用 DPS v3101软件计算建兰 38个品种间的
Nei & L i (1979) 遗传距离 , 并进行 UPGMA聚类分析。
2　结果与分析
211　遗传多样性分析
用筛选的 18个 10 bp随机引物 (表 2 ) , 对
38个建兰品种的 DNA进行 PCR扩增。扩增产物
分子量介于 350～2 500 bp之间。
图 1为引物 S1408的扩增结果。18个引物共
扩增出 116个位点 , 其中多态位点 103个 , 多态
位点比率为 88179%。可见 , 建兰 38个品种间具
有丰富的遗传多样性。
表 2　用于建兰品种 RAPD分析的引物及其序列
Table 2　The pr im ers and the ir sequence
引物
Primer
序列 5′→3′
Sequence 5′→3′
引物
Primer
序列 5′→3′
Sequence 5′→3′
S21 CAGGCCCTTC S50 GGTCTACACC
S29 GGGTAACGCC S68 TGGACCGGTG
S31 CAATCGCCGT S114 ACCAGGTTGG
S32 TCGGCGATAG S153 CCCGATTCGG
S36 AGCCAGCGAA S156 GGTGACTGTG
S38 AGGTGACCGT S157 CTACTGCCGT
S39 CAAACGTCGG S158 GGACTGCAGA
S43 GTCGCCGTCA S159 ACGGCGTATG
S45 TGAGCGGACA S1408 GTTACGGACC
图 1　引物 S1408对建兰 38个品种总 D NA的 RAPD扩增结果
M. 100 bp DNA ladder; 1～38. 分别为 1～38号样本总 DNA的 RAPD扩增结果 ; CK. 对照。
F ig. 1　RAPD am plif ica tion products genera ted from pr im er S1408
M. 100 bp DNA ladder; 1 - 38. No. 1 - 38 C. ensifolium cultivar, respectively; CK. Control.
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212　品种间的亲缘关系
运用 DPS v3101 数据处理软件计算的建兰 38 个品种间的 Nei & L i ( 1979 ) 遗传距离值为
01042017～01538462 (均值 0129024) , 其中 11个彩心品种间的遗传距离为 01253012～016 (均值
01426506) , 27个素心品种间的遗传距离为 01051546～01454545 (均值 01253046)。建兰 38个品种
中 , 金丝马尾 (15号 ) 与金嘴龙岩素 (16号 ) 的遗传距离最小 (01042017) , 四季大青 (23号 ) 与
梅花山大荷 (26号 ) 的遗传距离最大 (01538462)。供试的建兰 38个品种间的遗传分化较大 , 且彩
心品种间的遗传分化大于素心品种间的遗传分化。
图 2　基于 RAPD标记的建兰 38个品种的 UPGM A树系图
F ig. 2　UPGM A dendrogram of the th irty2e ight C. ensifo lium cultivars ba sed on RAPD marker
图 2为基于 RAPD标记的建兰 38个品种的 UPGMA树系图。由图 2可知 , 在遗传距离 013072
(L1 ) 处 , 建兰 38个品种可聚为 9组。其中 A组为建兰素心品种 , 其余 8组均为彩心品种 , 且建兰
27个素心品种是先聚为 A组后再与其它 8组 11种彩心品种相聚 , 这与严楚江 (1964) 将建兰分为彩
心建兰 ( var. ensifolium ) 和素心建兰 ( var. susin) 2个变种 , 以及素心多由彩心变异而来的分类观点
相吻合。
素心建兰品种 A组中 , 在遗传距离 012450 (L2 ) 处 , 又可分为 a、b、 c、d和 e 5亚组 (图 2)。
由铁骨素 (3号 ) 和铁骨银针 (19号 ) 组成的 e亚组 , 是最早从彩心建兰分支出来的素心品种。且
铁骨素和铁骨银针与其余素心品种间的遗传距离均大于距离均值 (01253046) , 这表明 e亚组除色素
基因与彩心品种有本质上的区别外 , 同彩心品种的亲缘关系最近。其它 4亚组与彩心品种的亲缘关系
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　2期 胡 　薇等 : 建兰 38个品种的 RAPD分析 　
由近及远为 : 单独由十三太保 ( 7号 ) 组成的 d亚组 ; 其次是 c亚组的 4个品种 : 武夷素 ( 9号 )、
玉女素 (33号 )、银边鱼魫 ( 38号 ) 和建荷素 ( 32号 ) ; 再次是由十六罗汉 ( 6号 )、鱼魫 ( 14
号 )、永福素 (13号 )、鱼魫大贡 (11号 ) 和银边大贡 (17号 ) 组成的 b亚组 ; 余下的 15个素心品
种组成与彩心品种亲缘关系最远的 a亚组。
11个彩心建兰品种 , 在遗传距离 013072 (L1 ) 处聚为 8组 (图 2)。其中 , 原产于台湾的飞天
(24号 ) 单独聚为 B组在遗传距离 013072处与素心品种 A组相聚后 , 与同产于台湾的娇鹤 (21号 )
和宝岛胭脂 (30号 ) 组成的 C组相聚 , 这表明建兰素心品种与台湾地产的 3个彩心品种亲缘关系密
切 ; 其它除十八学士 (25号 ) 与梅花山大荷 (26号 )、黄袍 (22号 ) 与四季大青 ( 23号 ) 两两分
别聚为 D和 F组外 , 余下的 4种均独自归类 : 金边丫兰 ( 20号 ) 归 E组 , 立叶剑蕙 ( 27号 ) 归 G
组、银边四季 (28号 ) 归 H组、马耳四季 (29号 ) 归 I组。由此可见 , 建兰彩心品种较素心品种具
有更丰富的遗传多样性 , 这符合建兰的生态型和栽培表征 : 野生建兰多为彩心 , 栽培品种多为素心。
213　RAPD标记的特异性
研究发现 , 供试建兰 38个品种中 , 闽西鱼魫 (2号 )、鱼魫大贡 (11号 )、鱼魫 ( 14号 ) 和银
边鱼魫 (38号 ) 在引物 S153 - 650 bp位点有扩增产物 , 其余品种均无扩增 ; 十六罗汉 (6号 ) 和鱼
魫 (14号 ) 在引物 S38 - 1 200 bp位点有扩增产物 , 其余品种均无扩增 ; 马耳四季 (29号 ) 在引物
S38 - 800 bp位点无扩增产物 , 其余品种均有扩增。另外 , 在供试的建兰 11个彩心品种中 , 原产于台
湾的娇鹤 (21号 )、飞天 (24号 ) 和宝岛胭脂 (30号 ) 在引物 S157 - 900 bp位点有扩增产物 , 其余
8种均无扩增 ; 在供试的建兰 27个素心品种中 , a亚组的 15个素心品种 ( 1、5、8、15、16、18、
35、36、37、31、2、4、10、12、34号 ) 在引物 S38 - 1 100 bp位点有扩增产物 , 其余 12种均无扩
增。这些特异位点扩增产物的有无可以作为品种鉴定的依据和传统分类的补充。
3　讨论
筛选的 18个随机引物对建兰 38个品种的 RAPD标记结果说明 , 建兰品种间具有丰富的遗传多样
性 , 且彩心品种较素心品种遗传分化高。因此 , 在建兰种质资源保护和开发利用时 , 更应重视保护野
生彩心建兰品种。
基于 RAPD标记的建兰 38个品种的 UPGMA聚类结果 , 支持严楚江 (1964) 将建兰分为彩心和
素心两个变种 , 以及素心多由彩心变异而来的观点。然而 , 吴应祥 (1993) 认为素心建兰多由彩心
变异而来的观点是不合适的。迄今为止 , 有关建兰花色变化的研究尚未见详细的报道。L iew等
(1998) 从 B rom head ia finayson iana的 cDNA文库中克隆出 3个花青素生物合成的关键酶 ———查尔酮合
成酶 ( chalcone synthase, CHS) 基因 , 许华欣和黄鹏林 (1999) 研究发现白花红唇蝴蝶兰约有 11个
CHS基因 , 红花朵丽蝶兰约有 7个 CHS基因。建兰不仅有单色、复色花 , 还有斑点、线条花 , 其花
色变化十分丰富。那么 , 建兰花色是否也是多基因控制的 , 有哪些基因参与调控 , 机制如何等方面的
研究有待进一步深入。
RAPD标记特异位点扩增产物的有无可以作为品种鉴定的依据和传统分类的补充。Obara2Okeyo
和 Kako (1998) 应用 RAPD标记引物 OPA5 - 370 bp位点扩增产物的缺失可以把 ‘Green Meadom’从
所有 36个大花蕙兰 (C. hybrid ium ) 栽培品种中鉴别出来。梁红健等 ( 1996) 报道利用 RAPD特异
性条带的有无可以区分种和品种 , 如 Chl112 - 120 bp位点的扩增产物是建兰种的特异标记 , Chl19 -
700 bp和 Chl113 - 550 bp位点的扩增产物是台兰种的特异标记。位点 Chl19 - 560 bp、Chl13N - 1 900
bp和 Chl112 - 350 bp分别是广西春兰、四川春兰和双飞燕 3个春兰品种的特异标记。本研究中 , 位
点 S153 - 650 bp的扩增产物可作为闽西鱼魫 (2号 )、鱼魫大贡 (11号 )、鱼魫 (14号 ) 和银边鱼魫
(38号 ) 4个建兰珍品的特异标记 ; 位点 S38 - 1 200 bp的扩增产物可作为十六罗汉 (6号 ) 和鱼魫
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(14号 ) 的特异标记 ; 位点 S38 - 800 bp扩增产物的缺失可作为马耳四季 (29号 ) 的特异标记。
建兰分为彩心与素心两个变种的传统分类得到本研究的支持。然而 , 由于自然群体杂交和人工选
育的结果 , 建兰品种间的关系错综复杂 , 传统分类学有明确定论的为数甚少。建兰名品鱼魫 (14号 )
被认为是铁骨素 ( 3号 ) 的一种变异 (吴应祥 , 1993) , 两者亲缘关系应该十分密切。但在本研究
中 , 鱼魫与铁骨素的遗传距离 ( 01333333) 大于均值 ( 0129024) , 表明两者的亲缘关系并不密切 ;
再有鱼魫系列的 4个品种 : 闽西鱼魫 ( a亚组 )、鱼魫大贡 ( b亚组 )、鱼魫 ( b亚组 ) 和银边鱼魫
( c亚组 ) 虽处于不同的进化分支 , 但却有共同的特异标记位点 S153 - 650 bp。而鱼魫 (14号 ) 与十
六罗汉 (6号 ) 的遗传距离 (01099099) 较小 , 且有共同的特异标记位点 S38 - 1 200 bp; 供试的建
兰 11个彩心品种中 , 原产于台湾的娇鹤 (21号 )、飞天 (24号 ) 和宝岛胭脂 (30号 ) 亲缘关系密
切 , 且共有特异标记位点 S157 - 900 bp。这些结果还有待于建兰的经典分类方法和分子生物学的进一
步研究。
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