全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1051～1054
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 12 - 19; 修回日期 : 2006 - 02 - 09
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370987) ; 江苏省应用基础项目 (BJ200018)3 通讯作者 Author for correspondence
苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性
叶　霞 1, 2 　陶建敏 1 　蔡斌华 1 　章　镇 13
(1 南京农业大学园艺学院 , 江苏南京 210095; 2 河南黄河园林绿化工程有限公司 , 河南郑州 450003)
摘 　要 : 根据已报道的植物铁结合蛋白基因 ( ferritin) 的保守区域设计引物 , 用 RT2PCR的方法从
‘嘎拉 ’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因 cDNA共有 1 043个碱基 , 其中编码区 834
bp, 编码 277个氨基酸残基的蛋白质 , 终止密码子后有 209 bp左右的 3’端尾随序列区。Southern杂交结果
显示 ferritin基因在 ‘嘎拉 ’苹果基因组中至少有 7个拷贝存在。015 mmol·L - 1的柠檬酸铁处理 ‘嘎拉 ’
苹果试管苗不同时间后的定量 RT2PCR分析表明 , ‘嘎拉 ’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达
量增加 , 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。
关键词 : 苹果 ; 铁结合蛋白基因 ; 克隆 ; 表达
中图分类号 : Q 789; S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521051204
C lon ing and Expression Character istics of the Ferr itin Gene from M a lus
dom estica Borkh.
Ye Xia1, 2 , Tao J ianm in1 , Cai B inhua1 , and Zhang Zhen13
(1 College of Horticulture, N anjing A gricultural U niversity, N anjing, J iangsu 210095, China; 2 Henan Yellow R iver Garden ing
L im ited Com pany, Zhengzhou, Henan 450003, Ch ina)
Abstract: A full2length cDNA sequence of app le ferritin ( iron2binding p rotein) gene was cloned from
the leaves ofM alus dom estica Borkh. by RT2PCR method. The gene was named asM dfer and its sequence was
deposited in the GenBank ( accession number DQ099429). The total length ofM dfer gene is 1 043 bp consis2
ting of a 834 bp open reading frame (ORF) coding for 277 am ino acids, and 209 bp non2coding 3’ region af2
ter the stop codon. Southern blotting analysis suggested that there were at least seven cop ies of ferritin gene in
the genome of M alus dom estica Borkh. W hen the seedlings of M a lus dom estica were treated with 015 mmol·
L - 1 iron2citrate from zero to six hours, a gradually increased exp ression level of the ferritin gene was observed.
This result suggested that the exp ression of M dfer gene was possibly regulated by iron at transcrip tional level.
Key words: App le; Ferritin gene; Cloning; Exp ression
1　目的、材料与方法
铁结合蛋白是一种广泛存在于植物、动物、真菌和细菌中 , 由 24个亚基组成的 450 kD巨大复合
体。它可以储藏结合 4 500个可溶、非毒性、可利用的铁原子 , 在生物体内铁的代谢方面起着关键作
用〔1〕。目前国内外已分别克隆出大豆、豇豆、拟南芥、烟草 、小金海棠、小麦、水稻、玉米、豌豆
等铁结合蛋白基因的完整 cDNA序列。本试验从 ‘嘎拉 ’苹果 (M a lus dom estica Borkh. ) 基因组中克
隆了铁结合蛋白基因的完整编码序列 , 并对其基因的诱导表达进行了初步的探讨。
取苹果试管苗幼叶 , 用王壮伟等的方法〔2〕提取基因组 RNA, 用陈大明等的方法〔3〕提取基因组
DNA。根据植物铁蛋白基因的保守序列设计特异引物 P1: AAGGAATCTAGTGAGGAAGA和简并引物
P2: TRAARTGCCANACNCCRTGNCCYTT, 以 TakaRa的 3pi2RACE试剂盒中的 O ligo dT2adap ter为引物反
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
转录苹果总 RNA, 获得第一链 cDNA, 用 P1和 M4 (试剂盒提供 ) 为引物进行 PCR扩增 , 然后回收
克隆测序。根据 3’2RACE测序结果设计特异引物 GSP: CTTGATGGCTTCCACCTGCTCGG, 巢式 PCR
引物 NGSP: CCACCTGCTCGGTCAAATACTCGC, 以 Clontech公司 5pi2RACE试剂盒中通用引物 UPM和
NUP进行第一轮、第二轮的 PCR扩增 , 电泳检测回收后克隆测序。
苹果基因组总 DNA分别用内切酶 B am HⅠ、 EcoRⅠ和 S acⅠ酶切后 , 采用 Roche公司的 “D IG
H igh Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit I”地高辛标记试剂盒进行 Southern杂交。苹果试管
苗分别经 015 mmol·L - 1柠檬酸铁处理 115、310、415、610 h, 未经处理的 (0 h) 为对照 , 然后提取
叶片基因组的 RNA , 用 DNA酶消化后 , 用 M 2MLV反转录酶进行反转录 , 根据序列信息设计上游引
物 P5: 5piAAGGAATCGAGTGAGGAAGA3’, 下游引物 P6: 5piTCTTTGTTCTTCTCAGCAAC3’, 然后以
cDNA为模板进行 PCR扩增 , 反应条件 : 94℃ 30 s, 51℃ 30 s, 72℃ 1 m in, 35个循环。
2　结果分析与讨论
211　全序列的分析
测序结果表明 , 克隆的苹果铁贮藏蛋白基因全长 1 043 bp, 1～834 bp构成了一个完整的开放阅
读框 , 编码 277个氨基酸残基的蛋白质 , 在终止密码子后有 209 bp左右的 3’端尾随序列区 (图 1)。
该基因在 GenBank数据库中的登录号为 DQ099429, 与 GenBank中已登录的烟草、拟南芥的铁蛋白基
因核苷酸序列的同源性最高 , 分别为 84%和 81%。因此 , 我们认为本研究所克隆的 cDNA序列为苹
果的铁结合蛋白 ( ferritin) 的 cDNA全序列。
图 1　‘嘎拉’苹果 ferr itin基因 cD NA核苷酸序列和推测的氨基酸序列
F ig. 1　The nucleotide sequences and the ir deduced am ino ac id sequences of ferr itin gene of M a lus dom estica Borkh.
212　基因组 D NA的 Southern分析
图 2显示 , 在铁蛋白基因保守片段 Southern杂交中出现多条带 , 试验所用的 3种内切酶 B am H
Ⅰ、EcoRⅠ和 SacⅠ在保守片段杂交区域并没有酶切位点 , 因此推断 ferritin基因在 ‘嘎拉 ’苹果基因
组内以多拷贝的形式存在。
2501
　5期 叶 　霞等 : 苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性 　
213　氨基酸序列的同源性分析
将推测的 ferritin基因氨基酸序列与已知的其
它植物的铁结合蛋白基因序列进行了比较 (图 3) ,
结果显示苹果 ferritin基因的氨基酸序列与大豆、
拟南芥、小金海棠、油菜、水稻、玉米 ferritin基
因氨基酸序列的同源性为 71% ～85% , 证实了 fer2
ritin基因的高保守性〔4〕。周志钦等〔5〕克隆的小金海
棠 ferritin基因编码的氨基酸序列与 Lescure等〔6〕报
道的大豆 ferritin基因编码的氨基酸序列除第 1和第
157位不同外 , 其余完全相同 , 二者的氨基酸序列
同源性达 99%。而本研究所用的材料 ‘嘎拉 ’苹
果与小金海棠同属苹果属植物 , 氨基酸的同源性却
图 2　‘嘎拉’苹果基因组 D NA Southern分析
F ig. 2　Southern blotting ana lysis of the genom ic D NA
of M a lus dom estica Borkh.
只有 75% , 由于缺乏其它苹果属植物 ferritin基因的报道 , 无法做进一步的比对分析。
图 3　‘嘎拉’苹果的 ferr itin基因推导的氨基酸序列与其它植物的 ferr itin基因的氨基酸序列比较
氨基酸序列完全相同的表示为黄色 , 序列保守的表示为蓝色 , 序列大块相似的表示为绿色 , 序列弱相似的为白色。
F ig. 3　Com par ison of the deduced am ino ac id sequences of M a lus dom estica Borkh. ferr itin (M dfer) gene
w ith those of other known ferr itin s in GenBank
Gm fer for Glycine m ax (Q948P6) ; A tfer for A rabidopsis thaliana (CAC85400) ; M xfer forM alus xiaojinensis (AAK83702. 1) ;
B nfer for B rassica napus (AAB5309911) ; O sfer for O ryza sativa (AAM7494311) ; Zm fer for Zea m ays (AA5814611) yellow
shows the mucletide is identical, blue shows the nucletide is conservative, green shows the mucletide is block of sim ilar,
white shows the nucletide is weaky sim ily.
3501
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
214　铁结合蛋白基因的表达特性
用 015 mmol·L - 1柠檬酸铁处理不同时间后 ,
对铁结合蛋白在叶片中的表达进行了定量 RT2
PCR分析 (图 4)。结果表明 , 铁结合蛋白基因随
着处理时间的延长 , 表达量逐渐增加 , 而未经铁
诱导表达时 , 几乎观察不到其表达 , 说明苹果铁
结合蛋白基因在转录水平上是受铁诱导表达的。
在铁的诱导条件下 , 烟草铁蛋白基因的 mRNA含
量能显著增加 , 且 N tFer1基因比 N tFer2对铁的诱
导更敏感。
本研究发现 M dfer基因在铁诱导的条件下
mRNA表达量增加 , 这与 Jean等〔7〕报道的结果一
图 4　ferr itin基因在铁诱导条件下的定量 RT2PCR分析
F ig. 4　Rea l tim e RT2PCR ana lysis of M dfer ferr itin
under iron2induc ing cond ition
致。Jean发现拟南芥的 A tFer1和 A tFer3基因的 mRNA含量在铁诱导下迅速增加 , 而 A tFer2对铁诱导
无任何反应 , 这是由于在 A tFer1的 5pi2UTR区有 15 bp的 cis2regulatory元件 , 而苹果是否存在其它类别
的铁蛋白基因 , 其 5pi非翻译区是否存在铁调控蛋白的结合位点有待进一步研究。
参考文献 :
1　Lobreaux S, Yewdall S J, B riat J F. Am ino acid sequence and p redicted three2dimensional structure of pea seed ( P isum sativum ) ferritin.
B iochem. J. , 1992, 288: 931～939
2　王壮伟 , 渠慎春 , 章　镇 , 张君毅. 苹果属 RNA高效快速提取新方法. 果树学报 , 2004, 21 (4) : 385～387
W ang ZW , Qu S C, Zhang Z, Zhang J Y. A fastmethod for total RNA extraction from the tissue culture material ofM alus sp. Journal of Fruit
Science, 2004, 21 (4) : 385～387 ( in Chinese)
3　陈大明 , 张上隆 , 金勇丰. 一种木本果树基因组 DNA提取方法研究. 浙江大学学报 , 1997, 23 (6) : 621～624
Chen D M, Zhang S L, J in Y F. A method for genom ic DNA p reparation of woody fruit crop s. Journal of Zhejiang Agricultural University,
1997, 23 (6) : 621～624 ( in Chinese)
4　Van W O, Savino g, B riat J F. Purification and characterization of recombinant pea seed ferritins exp ressed in Escherich ia coli: influence of a2
m ino term inus deletions on p rotein solubility and in vitro core formation. B iochem. J. , 1995, 305: 253～261
5　周志钦 , 成明昊 , 周泽扬 , 裴　炎 , 杨光伟. 苹果铁结合蛋白基因的克隆和序列分析. 生物工程学报 , 2001, 17 (3) : 342～344
Zhou Z Q, ChengM H, Zhou Z Y, Pei Y, Yang GW. The cloning of app le ferritin gene from M alus xiaojinensis Cheng et J iang and its struc2
ture analysis. Chinese Journal of B iotechlogy, 2001, 17 (3) : 342～344 ( in Chinese)
6　Lescure A M, Proudhon D, Pesey H. Ferritin gene transcrip tion is regulated by iron in soybean cell cultures. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A,
1991, 88 (18) : 8222～8226
7　Jean2M ichel Petit, Jean2Francois B riat, Stéphane. Structure and differential exp ression of the four members of the A rabidopsis thaliana ferritin
gene fam ily. B iochem. J. , 2001, 359: 575～582
4501