全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 111～114
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 05 - 08; 修回日期 : 2004 - 07 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30100123)
外源 Ca2 + 和 ABA 对高温下黄瓜花药中 Ca2 + 、
ABA及蛋白质合成的影响
缪 珉 1 　朱月林 2 　张玉华 1
(1 扬州大学农学院园艺系 , 扬州 225009; 2 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 外源 Ca2 +能降低高温下黄瓜单核期花药的胞内 Ca2 +水平并提高花粉萌发率 , 而 ABA的作用
与此相反。外源 Ca2 +和 ABA处理能显著提高高温下黄瓜花药内源 ABA的水平 , 并产生新的蛋白质。以上
结果表明 , 高温下外源 Ca2 +可影响黄瓜花药内 ABA信号系统 , 继而可能改变基因表达 , 并获得耐热性 ;
外源 ABA亦能影响黄瓜花药内 Ca2 +信号系统。
关键词 : 黄瓜 ; 高温 ; 花药 ; 钙 ; ABA; 蛋白质双向电泳
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120111204
Effect of Exogenous Ca2 + and ABA on Ca2 + D istr ibution, ABA Con ten ts and
Prote in s Syn thesis in Cucum ber An thers under Hea t Stress
M iao M inm in1 , Zhu Yuelin2 , and Zhang Yuhua1
(1D epartm en t of Horticu lture, College of A griculture, Yangzhou U niversity, Yangzhou 225009, China; 2 College of Horticulture,
N anjing A gricu lture U niversity, N an jing 210095, China)
Abstract: Exogenous Ca2 + reduce the intercellular Ca2 + of cucumber anthers and increase pollen germ i2
nation percentage at high temperature, while the exogenous ABA have a reverse effect. Endogenous ABA con2
tents in two line anthers ascend significantly linked with new p rotein formation after exogenous Ca2 + and ABA
treatment under 45℃. The results indicated that Ca2 + and ABA signals can interact each other in cucumber
uninucleate pollen stage anthers under high stress.
Key words: Cucumber; H igh temperature; Anther; Ca2 + ; ABA; 2D PAGE
1　目的、材料与方法
Ca2 +和 ABA信号系统被认为是植物高温逆境反应中的重要胞内信号转导途径 , 且这两类信号之间
存在着相互调节关系。本文研究了外源 Ca2 +和 ABA处理对高温下黄瓜花药中 Ca2 +分布、ABA含量及蛋
白质合成的影响 , 以期为进一步深入研究植物生殖系统高温逆境反应中的信号转导机制提供依据。
供试黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 为耐热品系 ‘JY24’和敏热品系 ‘新泰密刺 ’, 于 2003年 3月、
8月两次播种在上口径 ×高为 21 cm ×21 cm的营养钵内 , 常规栽培管理。根据黄瓜雄花的大小判断
其花粉的发育状态〔1〕。当温室中黄瓜植株上出现大量雄花、花粉发育处于单核期时 , 于晴天上午 7时
对黄瓜的雄花喷施 115 mmol·L - 1的 CaCl2溶液及 110μmol·L - 1的 ABA溶液 (以喷清水为对照 ) , 将
植株于中午 12: 00移入人工气候室进行 45℃高温处理 , 处理 4 h后恢复 28℃常温 , 以一直处于 28℃
为对照。一部分雄花挂牌标记后任其继续生长至开花 , 用于统计 28℃下培养 4 h后花粉萌发率 (培养
基的成分 : 硼酸 80 mg·kg- 1 +蔗糖 100 g·kg- 1 )。其余雄花在处理后 0、1、2、3、4 h以及恢复常
温后 1、2 h剥取花药 (即图 1中时间点 5, 6) , 其中一部分用于超薄切片电镜观察 , 一部分迅速投
入液氮冷冻后再转入 - 35℃保存 , 用于检测 ABA和蛋白质。所有测定均重复 3次。花药中 Ca2 +分布
的电镜观察参照焦锑酸钾沉淀技术〔2〕, 测定 ABA含量〔1〕, 进行蛋白质提取和电泳〔3〕。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
2　结果分析与讨论
211　花粉萌发率
Ca2 +处理对常温下的花粉萌发率无显著影响 , 但能显著提高高温处理后的花粉萌发率。ABA处
理后无论是常温下还是高温下生长的花粉 , 其萌发率与喷水对照相比均显著降低 (表 1)。此外 , 经
高温处理后 , 热敏品种新泰密刺花粉在外源 Ca2 +和 ABA处理后其花粉萌发率仍低于 JY24 (图 1)。
图 1　外源 Ca2 +、ABA处理对高温胁迫下黄瓜单核花粉期花药内源 ABA含量的影响
Fig. 1　Effect of Ca2 + , ABA pretreatment on endogenous ABA levels in un inucleate pollen stage anthers of cucumber under heat2stress
212　花药中 Ca2 +分布的电镜观察
常温下 , 经 CaCl2处理后 , JY24和新泰密刺
处于单核花粉期的花药中 Ca2 +的分布情况与未经
CaCl2 处理的基本相同 , 主要分布在花粉的外壁、
绒毡层和中层细胞的细胞壁中 , 细胞质中极少
(图版 , 1、2)。高温胁迫 1 h后 , 经 CaCl2 处理
后 JY24绒毡层及中层细胞中的 Ca2 +沉淀颗粒增
多 , 细胞质中未观察到 Ca2 + 沉淀颗粒 (图版 ,
3) ; 新泰密刺绒毡层开始解体 , 花粉粒营养细胞
的胞质中零星分布有 Ca2 +沉淀颗粒 (图略 )。高
温胁迫 2 h后 , JY24花粉粒中观察到细胞核内有 表 1　外源 Ca2 + 、ABA对 45℃高温处理 4 h后黄瓜花粉 28℃下 4 h萌发率的影响Table 1　Effect of Ca2 + and ABA pretrea tm en t on pollengerm ina tion of cucum ber under 28℃ after hea t trea tm en t处理 温度Temperature (℃) 新泰密刺Xintaim ici JY24对照 Control 28 9317 a 9415 a45 3616 g 6013 dCaCl2 115 mmol·L - 1 28 9215 a 9413 a45 4210 f 7210 cABA 110μmol·L - 1 28 7713 c 8518 b45 2513 h 5316 e注 :数字后字母表示差异达 0105显著水平。Note: The letters after data indicate the significance at 0105 level.
少量 Ca2 +沉淀颗粒 , 绒毡层开始解体 , 周原质团中有较多的 Ca2 +沉淀物 (图版 , 4) ; 新泰密刺沿花
粉壁外壁排列了一层致密的 Ca2 +沉淀颗粒 , 花粉粒营养细胞的细胞核及萌发孔口区域的生殖核中分
布有大量 Ca2 +沉淀颗粒 (图版 , 5)。经 CaCl2处理高温 1、2 h后黄瓜花药的电镜图与未经 CaCl2处理
的相比 , 可以发现 CaCl2处理后的 JY24花药中 Ca2 +分布情况变化不大 , 但新泰密刺花药胞质中的
Ca2 +沉淀显著减少。高温胁迫 3～4 h, JY24和新泰密刺花粉营养细胞的细胞核中及萌发孔口区域的
Ca2 +沉淀颗粒均增多 (图版 , 6、7)。此时可发现经 CaCl2处理后 JY24花药的胞质中的 Ca2 +沉淀物要
少于未处理对照。常温下经 ABA处理后 , JY24和新泰密刺单核花粉期的花药中 Ca2 +主要分布在周原
质团、中层细胞及药室内壁细胞的细胞壁上 , 细胞核中未见 Ca2 +沉淀物 , 细胞质中分布有少量 Ca2 +
沉淀颗粒 (图版 , 8、9)。高温胁迫 1～2 h, JY24花粉粒的细胞质中出现少量 Ca2 +沉淀颗粒 , 周原质
团中的 Ca2 +沉淀物增多 (图版 , 10)。新泰密刺花粉粒中沿着花粉的内外壁以及靠近萌发孔口区域的
生殖细胞中出现大量 Ca2 +沉淀物 (图版 , 11)。高温胁迫 3～4 h, JY24和新泰密刺的细胞核及花粉外
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　1期 缪 珉等 : 外源 Ca2 +和 ABA对高温下黄瓜花药中 Ca2 + 、ABA及蛋白质合成的影响 　
壁均分布有大量 Ca2 +颗粒 , 且新泰密刺细胞质中的 Ca2 +沉淀多于 JY24 (图版 , 12、13)。本试验的
研究结果显示 , Ca2 +预处理使高温胁迫下黄瓜花药细胞质及细胞核中 Ca2 +沉淀增加的比未经外源
Ca2 +预处理的少 , 花药的耐热性也随之增强 , 这与前人的结论基本吻合 , 即外源 Ca2 +预处理通过改
变胞质内外的 Ca2 +分布 , 减轻高温胁迫对植物细胞的伤害。
213　花药中内源脱落酸 ( ABA) 的含量
常温下 Ca2 +和 ABA处理对黄瓜花药内源 ABA的含量无显著影响 ; 高温下 Ca2 +能显著提高花药
内源 ABA的水平 , 但在恢复 28℃后又逐渐回落到常温水平 , 这表明高温下黄瓜花药内 Ca2 +信号系统
可对 ABA信号系统发生影响 ; 高温下经 ABA处理过的黄瓜花药其内源 ABA含量大幅度上升 (比施
用外源 Ca2 +的还高 ) , 在恢复常温 2 h后仍能维持较高水平 (图 1)。
214　花药中蛋白质的双向电泳图谱
温度对新泰密刺蛋白的表达与否以及表达量影响很小 , 而对 JY24的影响相对较大。热激 2 h JY24
花药电泳图谱中蛋白点 1 〔MW 7110 kD, p I 515 ( p I表示等电点 , 下同 ) 〕、2 (MW 5510 kD, p I
515) 和 3 (MW 5710 kD, p I 610) 的表达量均增加。与未经外源 Ca2 +处理的电泳图相比 , 新泰密刺
和 JY24花药中均新增蛋白点 4 〔图 2, C、D、 I、J (MW 5610 kD , p I 511) 〕, 新泰密刺花药中新增 5
〔图 2, C、D (MW 9215 kD, p I 512) 〕; JY24花药中新增 6 〔图 2, I、J (MW 5810 kD, p I 513) 〕和 7
(MW 9215, p I 515)。比较经外源 ABA处理后的新泰密刺、JY24单核至双核花粉期花药蛋白质双向电泳
图谱 (图 2, E、F、K、L) , 可以发现 45℃条件下未见有新蛋白质合成 , 但一些蛋白质点的表达量有所
增加 , 如热激 2 h时 , 新泰密刺蛋白点 3 〔图 2, A、B、E、F (MW 5710 kD, p I 610) 〕、11 〔图 2, E、
F (MW 5510 kD, p I 512) 〕和 8 〔图 2, E、F (MW 4810 kD, p I 517) 〕的表达量均增加 ; JY24中蛋白
点 1 (MW 7110 kD, p I 515) 和 9 (MW 6710 kD, p I 419) 的表达量增加。与未经外源 ABA处理的相
比 , 外源 ABA处理后黄瓜花药电泳图谱中蛋白点增多 , 如新泰密刺新增蛋白点 10 (MW 4610, p I 610) ;
JY24中新增蛋白点 4 (MW 5610 kD, p I 511)。根据本文结果 , 外源 Ca2 +和 ABA的施用都造成了黄瓜花
药中新蛋白质的合成 , 这些新产生的蛋白质与 HSPs有无关系 , 需要用免疫学等手段进行深入研究。
图 2　经外源 Ca2 + 、ABA处理后新泰密刺 ( A～F)、JY 24 ( G～L ) 单核花粉期花药可溶性蛋白质双向电泳图
(A, G) 28℃; (B, H) 45℃ 2 h; (C, I) Ca2 + 28℃; (D, J) Ca2 + 45℃ 2 h; ( E, K) ABA 28℃; ( F, L) ABA 45℃ 2 h
Fig. 2　2D PAGE patterns of Xinta im ici ( A - F) and JY24 ( G - L) un inucleate pollen stage anther proteins after Ca2 + , ABA pretreatment
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参考文献 :
1　缪 珉. 黄瓜热伤害与热适应生理机制及耐热栽培技术研究 : 〔博士学位论文〕. 南京 : 南京农业大学 , 2000. 94页
M iao M M. Studies on the mechanism of heat injury and heat adap tation and summer cultivation techniques of cucumber: 〔Paper of doctor de2
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nique. The Journal of H istochem istry and Cytochem istry, 1982, 30 (7) : 617～629
3　OpiFarrel P H. H igh2resolution two2dinesional electrophoresis of p rotein. Journal of B iology Chem istry, 1975, 250: 4007～4021
图版说明 : 1～7. 经外源 Ca2 +处理后 JY24、新泰密刺花药中 Ca2 +的分布. 1, 2. 常温下 , JY24、新泰密刺药壁 , ×1850, ×2850;
3. 高温胁迫 1 h时 , JY24药壁 , ×3900; 4, 5. 高温胁迫 2 h时 , JY24药壁、新泰密刺花粉 , ×2850, ×5800; 6, 7. 高温胁迫 3～4 h
时 , JY24、新泰密刺花粉 , ×5800, ×3900; 8～13. 经外源 ABA处理后 JY24、新泰密刺花药中 Ca2 +的分布 (8, 9. 常温下 , JY24药
壁、新泰密刺花粉 , ×2850, ×2400; 10, 11. 高温胁迫 1～2 h时 , JY24药壁、新泰密刺花粉 , ×3900, ×5800; 12, 13. 高温胁迫
3～4 h时 , JY24、新泰密刺花粉中 Ca2 +的分布 , ×5800, ×3900) ; 14. 对照 , 切片经 EGTA处理 , 示螯合 Ca2 +后的空洞 , ×23000。
CT. 药隔组织 ; EN. 药室内壁 ; ER. 内质网 ; GA. 萌发孔 ; L. 脂质体 ; m. 线粒体 ; M. 中层 ; N. 细胞核 ; P. 花粉 ; Pla. 周原质
团 ; T. 绒毡层 ; V. 液泡 ; Va. 液泡化 ; →示 Ca2 +沉淀颗粒。
Explana tion of pla tes: 1 - 7. Calcium p recip itates distribution in JY24 and Xintaim ici anther after Ca2 + p retreatment. 1, 2. In normal tempera2
ture, JY24 and Xintaim ici anther wall, ×1850, ×2850; 3. In 1h heat2stress, JY24 anther wall, ×3900; 4, 5. In 2 h heat2stress, JY24 an2
ther wall and Xintaim ici pollen, ×2850, ×5800; 6, 7. In 3 - 4 h heat2stress, JY24 and Xintaim ici pollen, ×5800, ×3900; 8 - 13. Calci2
um p recip itates distribution in JY24 and Xintaim ici anther after ABA p retreatment (8, 9. In normal temperature, JY24 anther wall and Xintaim ici
pollen, ×2850, ×2400; 10, 11. In 1 - 2 h heat2stress, JY24 anther wall and Xintaim ici pollen, ×3900, ×5800; 12, 13. In 3 - 4 h heat2
stress, JY24 and Xintaim ici pollen, ×5800, ×3900) ; 14. Calcium2free control section incubated in a solution of EDTA, ×23000.
CT. Connective tissue; EN. Endothecium cell; ER. Endop lasm ic reticulum; GA. Germ inal aperture; L. L ip id body; m. M itochondrium; M.
M iddle layer; N. Nucleus; P. Pollen; Pla. Plasmodium; T. Tapetum; V. Vacuole; Va. Vacuolation; A rrows indicate calcium p recip itates.
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