全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 1003 - 1006
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 31; 修回日期 : 2007 - 05 - 28
基金项目 : 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目 [ 2004 ( 527 ) ] ; 山东省人事厅留学回国人员科技活动择优资助项目
[ 2003 (10) 14 ]3 E2mail: yuankj@ vip1sina1com
苹果α -法尼烯合酶基因组结构和序列的多态性分析
苑克俊 3 , 刘庆忠 , 李　勃 , 张力思
(山东省果树研究所 , 山东泰安 271000)
摘 　要 : 通过设计引物进行 PCR扩增、测序、拼接序列 , 以及与 GenBank中的 cDNA序列 (登录号
AY182241) 进行比对 , 获得α -法尼烯合酶基因 (A FS ) 的基因组序列和内含子 /外显子结构。获得的 A FS
基因序列已在 GenBank注册 (登录号 DQ901739) , 它有 6个内含子和 7个外显子 , 编码一个大小为 576个
氨基酸的蛋白质。间隔外显子的 6个内含子相位分别是 0、1、2、2、0、0, 其大小分别是 108、113、 >
1 000、125、220和 88 bp, 7个外显子的推导氨基酸序列大小分别是 57、89、127、73、48、83和 99。编码
的蛋白质中有 3个序列模式 (motif) , RR (X8) W 模式的编码基因序列在基因 5′端的外显子 1上 , RxR 模
式和 DDxxD 模式的编码基因序列在外显子 4上。将获得的 A FS基因序列与 GenBank中的 cDNA序列 (登录
号 AY523409) 进行比对 , 结果发现两序列间有 6个单核苷酸多态性 , 其中 4个引起氨基酸突变。有意义的
是 , 1个氨基酸突变 (291R→G) 发生在 RxR模式上 , 此氨基酸突变以及其它突变是否与苹果α - 法尼烯
合成能力和虎皮病发生能力有关 , 值得进一步探讨。
关键词 : 苹果 ; α -法尼烯合酶 ; 基因组 DNA; 多态性 ; 虎皮病
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0421003204
Genom ic O rgan iza tion and Sequence Polym orph ism of E, E2a lpha Far2
nesene Syn tha se Gene in Apples (M a lus dom estica Borkh. )
YUAN Ke2jun3 , L IU Q ing2zhong, L IBo, and ZHANG L i2si
(Shandong Institu te of Pom ology, Taipian, Shandong 271000, China)
Abstract: Primer pairs were designed to amp lify the genom ic DNA of alpha2farnesene synthase gene
(A FS ) by PCR, the PCR p roducts were sequenced, the sequences were sp liced and compared to cDNA ( ac2
cession No. AY182241) in the GenBank, then the genom ic sequence and intron2exon organization of A FS
gene were obtained. The A FS genom ic sequence has been registered in GenBank ( accession No.
DQ901739) , it had 6 introns and 7 exons, encoded a p rotein with 576 am ino acids. The sizes of 6 introns
were 108 bp, 113 bp , > 1 000 bp, 125 bp, 220 bp and 88 bp, and their phase were 0, 1, 2, 2, 0, 0, re2
spectively. The sizes of deduced am ino acids of 7 exons were 57, 89, 127, 73, 48, 83 and 99, respectively.
The AFS p rotein contained three motifs, the RR (X8) W motif was encoded by a sequence in exon 1, the
RxR motif and DDxxD motif were encoded by two sequences in exon 4. The A FS genom ic sequence ( accession
No. DQ901739) was compared to cDNA ( accession No. AY523409) in the GenBank, it was found that there
were 6 single2nucleotide polymorphism s between the two sequences, four of which caused mutations at the am i2
no acid level. Interestingly, one am ino acid mutation (291R→G) was found in RxR motif, it deserves further
investigation whether the alpha2farnesene synthesis ability and superficial scald suscep tibility of app leswere in2
fluenced by this am ino acid mutation and other mutations.
Key words: App le; A lpha2farnesene synthase; Genom ic DNA; Polymorphism; Superficial scald
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苹果α -法尼烯与虎皮病的发生有密切关系 (胡小松 等 , 2002) , 其合成涉及 HMG2CoA还原酶
(HMGR)、FPP合酶 ( FPPS) 和α -法尼烯合酶 (AFS) 等酶基因 (Rupasinghe et al. , 1998)。采用
HMG2CoA还原酶的竞争性抑制剂洛伐他汀 (Lovastatin) 处理果实 , 几乎完全抑制α - 法尼烯和虎皮
病发生 (Ju & Curry, 2000)。这说明 , 控制α -法尼烯合成的相关酶基因是有可能控制虎皮病的。
α -法尼烯合酶是直接参与α - 法尼烯合成的酶。目前人们已获得苹果α - 法尼烯合酶 cDNA克
隆 , 研究了该基因表达与果皮中 α - 法尼烯含量的关系 ( Pechous et al. , 2004, 2005; 李萌 等 ,
2006) 。在玉米和动物上的研究结果表明 , 玉米品种间倍半萜烯的差异是由于两个萜烯酶基因
( TPS4、TPS5) 的单核苷酸差异引起 ( Kollner et al. , 2004) , 内含子序列差异与性状间存在相关性
( Kuhnlein et al. , 1997)。这说明有必要从基因组 DNA及其序列差异方面研究 A FS基因 , 探讨其与虎
皮病发生的关系 , 为采用基因工程方法控制虎皮病提供理论依据。
1　材料与方法
111　基因组 D NA提取
以 ‘国光 ’苹果嫩叶为试材提取 DNA (陈昆松 等 , 2004; 苑克俊 , 2005)。将盛叶片的试管置
于冰块上用研磨棒研磨 , 研磨后立即加入预热至 65℃的 016 mL 2% CTAB提取缓冲液 [ 2% CTAB , 100
mmol/L Tris2HCl (pH 810) , 20 mmol/L EDTA, 114 mol/L NaCl, 2% PVP240, 2%β -巯基乙醇 ] , 此后
提取过程同已报道方法 (苑克俊 , 2005)。将样品 65℃水浴提取 30 m in, 期间轻轻倒置样品试管 3次。
加入 016 mL氯仿 ∶异戊醇 (24∶1) , 混匀 , 离心后将上清液 (约 420μL) 转入新试管 , 加入等体积经
- 20℃预冷的异丙醇 , 轻轻摇匀 , 离心后将上清液移去。所得 DNA球用 500μL经 - 20℃预冷的 70%
乙醇漂洗 2次 , 置于室温下晾干 , 加入 30～50μL 灭菌无离子水或 012 ×的 TE, 加入不含 DNA se的
RNA se在 37℃下处理 10 m in除去 RNA, 在 4℃冰箱中保存备用 , 或冷冻保存。
112　引物设计、PCR扩增和基因组 D NA测序
利用 GenBank中长度最大的 A FS基因 cDNA序列 (登录号 AY182241) 设计引物 P1、P2R、P3、
P4R、P5和 P6R (18～22 bp) 进行 PCR扩增 (表 1)。表 1中的 P3f、P4fR和 P4gR是第一轮 PCR扩
增测序后为完成序列拼接设计的引物。PCR反应液 (50μL ) 含有 1μL ( 50 ng) 基因组 DNA和 49
μL反应混合物。一份反应混合物由 1μL dNTPs ( 10 mmol/L )、5μL Taq缓冲液、115μL正向引物
(10μmol/L)、115μL反向引物 (10μmol/L)、015μL (1 U) 的 Taq DNA聚合酶和 3915μL水组成。
PCR反应 35个循环 , 每一循环 94℃变性 30 s, 55℃退火 1 m in和 72℃延伸 2 m in。将 2μL PCR产物、
8μL水和 2μL Loading dye混合 , 溴化乙锭染色 , 在 80 V电压、115% 琼脂胶上电泳检查 PCR产物质
量 (苑克俊 , 2005)。委托生物技术公司进行纯化和测序。
表 1　PCR产物及相关引物
Table 1　PCR products and rela ted pr im ers
PCR产物 PCR p roduct 正向引物 Forward p rimer 反向引物 Reverse p rimer
P1 - 2R P1: TATCCCAAACATCTCgAgC P2R: TAgCgTCAAggAAgCTTTC
P3 - 4R P3: CCTCAAACCTgggTTTCg P4R: ATTCTCCTCCTCAATTTCAcg
P5 - 6R P5: TgAgCAgCTTCCAgAgTgTATg P6R: TTCATAATCTTTggCAACAACg
P3f - 4fR P3f: gggCACATTAgAgAACCAC P4fR: CgAATgCTACTCCCACAg
P3 - 4gR P3: CCTCAAACCTgggTTTCg P4gR: CATTATgAgggTCgTTgg
P3 - 4fR P3: CCTCAAACCTgggTTTCg P4fR: CgAATgCTACTCCCACAg
113　基因组 D NA分析
将测出的 DNA序列进行拼接获得 A FS基因的基因组序列 , 利用 B lastn将其与 GenBank中 AFS1
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　4期 苑克俊等 : 苹果α -法尼烯合酶基因组结构和序列的多态性分析 　
的 cDNA序列 (登录号 AY182241) 进行比对 , 找出 A FS基因组序列中的内含子 /外显子接合位点 ;
将其与 GenBank中抗虎皮病品种 ‘艾达红 ’苹果 A FS基因的 cDNA序列 (登录号 AY523409) 进行比
对 , 找出两序列间的单核苷酸多态性位点。利用 Sequin软件编制 A FS基因组序列的 GenBank注册文
件 , 找出两个苹果品种的氨基酸序列差异位点。
2　结果与分析
211　基因组序列和结构
目前获得的 ‘国光 ’苹果的 A FS基因组序列长度为 3 009 bp, 中间尚有一缺口未测序。通过比
较其基因组 DNA和 GenBank中 A FS1的 cDNA确定了其基因组结构。A FS基因有 6个内含子和 7个外
显子 , 编码一个大小为 576个氨基酸的蛋白质。7个外显子的推导氨基酸序列大小分别是 57、89、
127、73、48、83和 99, 间隔外显子的 6个内含子皆符合 “GT - - - AG”规则 , 其相位分别是 0、
1、2、2、0、0, 其大小分别是 108、113、 > 1 000、125、220和 88 bp (图 1)。另外 , 在起始密码子
上游有 5 bp, 在终止密码子下游有 69 bp, 未测序缺口位于内含子 3。内含子 3特别大 , 目前仅测出
550 bp, 根据电泳图谱上 PCR扩增产物条带的大小推算还有大约 519 bp的序列未测出。测出的苹果
α -法尼烯合酶的基因组序列已在 GenBank注册 , 登录号 DQ901739。
对推导氨基酸序列的分析结果表明 , 编码的蛋白质中有 3个模式 , RR (X8) W 模式的编码序列
在基因 5′端的外显子 1上 , RxR模式和 DDxxD 模式的编码序列在外显子 4上。
图 1　苹果α -法尼烯合酶基因的基因组结构
F ig. 1　Genom ic organ iza tion of apple a lpha2farnesene syn tha se gene
212　序列多态性
将获得的 AFS基因序列与 GenBank中抗虎皮病品种 ‘艾达红’苹果 AFS基因的 cDNA序列 (登录
号 AY523409) 进行比对。发现有 6个单核苷酸变异 (图 2, 数字代表 ‘国光’苹果 AFS基因序列中相
应核苷酸的位置 ) , 其中 426 G→A, 501 A→G, 1 747 A→G和 2 573 G→A, 这 4个单核苷酸变异引起氨
基酸突变 , 另外 2个单核苷酸变异 1 875 T→C和 2 625 C→T是同义突变 , 无论是否变异皆编码 333G
(甘氨酸 ) 和 468R (精氨酸 )。有意义的是 , 1个氨基酸突变 (291 R→G) 发生在 RxR模式上。
从图 2还可看出 , 426 G→A和 501 A→G单核苷酸变异在外显子 2上 , 1 747 A→G和 1 875 T→C
单核苷酸变异在外显子 4上 , 2 573 G→A和 2 625 C→T单核苷酸变异在外显子 6上。
图 2　A FS基因序列和推导氨基酸序列的突变位点
F ig. 2　The m uta tion s in the sequences of A FS gene and deduced am ino ac id
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3　讨论
有研究表明 , 易发虎皮病品种 ‘Law Rome’A FS基因的转录表达水平、α -法尼烯和共轭三烯醇
含量分别比抗病品种 ‘艾达红 ’高 215倍、4倍和 33倍 ( Pechous et al1, 2005) , 但尚未见造成二者
差异的原因报道。我们从 AFS基因序列差异着手进行了探讨 , 通过测定易发虎皮病品种 ‘国光 ’的
AFS基因序列 , 并与 GenBank中抗病品种 ‘艾达红 ’的 cDNA序列进行比对 , 发现两序列间有 6个单
核苷酸多态性 , 其中 4个引起氨基酸突变。有意义的是 , 1个氨基酸突变 (291R→G) 发生在 RxR模
式上 , 抗虎皮病品种 ‘艾达红 ’在此处的氨基酸残基是 G, 易发病品种 ‘Law Rome’和 ‘国光 ’在
此处的氨基酸残基都是 R。鉴于 RxR模式和 DDxxD模式的氨基酸残基在萜烯形成过程中起作用一起
负责引导二磷酸根离子离开碳阳离子中间产物 (Davis & Croteau, 2000) , 前面提到的 ‘艾达红 ’α -
法尼烯含量低 ( Pechous et al1, 2005) , 很可能是 RxR模式氨基酸突变 (291R→G) 引起。当然 , 是
氨基酸突变 (291R→G) 还是其它突变引起 ‘艾达红 ’A FS基因的转录表达水平和α - 法尼烯含量
低 , 需通过进一步试验进行探讨。
水稻 O sB P273基因的启动子序列驱动基因表达时 , 需要基因内含子的参与 (陈俊和王宗阳 ,
2004)。本研究发现苹果 A FS基因有一个特别大的内含子 3, 因没有 ‘艾达红 ’苹果试材 , 未能研究
其内含子是否存在序列差异以及是否与基因的表达调控有关 , 值得今后进一步探讨。
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