全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 747 - 752
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 11 - 06; 修回日期 : 2008 - 01 - 16
基金项目 : 科技部科技基础工作项目 (2005DKA21002220) ; 国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A170321)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qzliu@ sdip1cn)
部分板栗品种遗传多样性的 AFL P分析
艾呈祥 , 张力思 , 魏海蓉 , 刘庆忠 3
(山东省果树研究所 , 山东省果树生物技术育种重点实验室 , 山东泰安 271000)
摘 　要 : 利用荧光标记 AFLP技术 , 采用 7对 M + 3和 E + 3引物组合对 30份板栗和日本栗栽培品种进
行了总基因组 DNA水平上的多态性检测 , 共获得 962条可统计的条带 , 其中 852条呈多态性 , 多态性带百
分率达 89% , 揭示了板栗丰富的遗传多样性。7组引物在 30个品种中检测到数目不等的品种特异带型 , 对
供试板栗品种具有一定的鉴别价值。7对引物能将 30个板栗和日本栗品种完全区分开。聚类分析结果表
明 , 多数来源地相同的板栗品种资源表现出较为密切的亲缘关系。
关键词 : 板栗 ; 品种 ; 遗传多样性 ; AFLP
中图分类号 : S 66412　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520747206
Stud ies on the Genetic D iversity of Som e Chestnut ( C astanea ) Cultivars by
AFL P Ana lysis
A I Cheng2xiang, ZHANG L i2si, W E I Hai2rong, and L IU Q ing2zhong3
(Shandong Institu te of Pom ology, Key L abora tory for Fru it B iotechnology B reed ing of Shandong, Taipian, Shandong 271000,
China)
Abstract: Investigation of the genetic diversity of chestnut (Castanea) is significate in utilizing its germ2
p lasm resources and breeding new cultivars. The phylogenetic relationship s among 30 chestnut cultivars were
analyzed by using of AFLP technique to study the genetic diversity with seven AFLP p rimer combinations
(M + 3 and E + 3). Among the 962 bands detected, 852 bands were polymorphic and specific bands found in
all tested cultivars. The high ratio of polymorphic bands (89% ) observed indicated abundant genetic diversity
among chestnut cultivars. The results suggested that the seven pairs of p rimer combinations could be used to
distinguish all tested cultivars. Cluster analysis showed that the classification based on AFLP markers of most
cultivars was consistent with their origin.
Key words: chestnut; cultivar; genetic diversity; AFLP
板栗 (Castanea m ollissim a B lume) 是我国栗属特有种之一 , 遗传资源十分丰富 , 但由于对其遗传
背景、亲缘关系缺乏深入系统的研究 , 致使育种工作受到很大限制。近年来 RAPD、SSR、 ISSR技术
已被用于板栗品种鉴定和遗传多样性研究 (Casasoli et al. , 2001; 杨剑 等 , 2004; A i et al. , 2007) ,
但 RAPD标记的引物易受试验条件的影响 , 存在筛选结果不稳定、条带少等缺点 , SSR和 ISSR虽较
为稳定 , 但需要相当多的引物 , 需多次测定才能绘制较为有用的指纹图谱。AFLP具有稳定性高、重
复性好、多态性检测效率高的特点 , 已广泛应用于植物品种鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、
基因定位等方面。
本研究利用荧光 AFLP技术 , 对 30个来自不同地区的板栗和日本栗品种进行分析 , 旨在从分子水平
上探索板栗品种间的遗传差异 , 以期为板栗目标基因定位、核心种质的确立、品种改良等奠定基础。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
1　材料与方法
111　材料
供试板栗和日本栗品种共 30份 (表 1) , 均为当地常见或优良品种 , 其中山东品种 8份 , 江苏品
种、河北品种、辽宁品种各 4份 , 北京品种 3份 , 陕西品种 2份 , 安徽品种 1份 , 日本品种 4份。所
有材料均取自国家果树种质泰安板栗圃。
表 1　供试材料一览表
Table 1　The list of cultivars used in th is study
序号
No.
品种
Cultivar
来源
O rigin
序号
No.
品种
Cultivar
来源
O rigin
1 红栗 4号 Hongli 4 山东泰安 Taipian, Shandong 16 石丰 Shifeng 山东海阳 Haiyang, Shandong
2 短枝 3号 Duanzhi 3 山东泰安 Taipian, Shandong 17 炮车 2号 Paoche 2 江苏新沂 Xinyi, J iangsu
3 官厅 7号 Guanting 7 河北遵化 Zunhua, Hebei 18 银寄 Yinji 日本 Japan
4 中明栗 Zhongm ingli 山东泰安 Taipian, Shandong 19 焦刺 J iaoci 江苏宜兴 Yixing, J iangsu
5 短扎 Duanzha 江苏宜兴 Yixing, J iangsu 20 红栗 3号 Hongli 3 山东泰安 Taipian, Shandong
6 早丰 Zaofeng 辽宁凤城 Fengcheng, L iaoning 21 燕丰 Yanfeng 北京昌平 Changp ing, Beijing
7 短枝 1号 Duanzhi 1 山东泰安 Taipian, Shandong 22 郯城 023 Tancheng 023 山东郯城 Tancheng, Shandong
8 辽丹 58 L iaodan 58 辽宁宽甸 Kuandian, L iaoning 23 柞 11 Zha 11 陕西柞水 Zhashui, Shaanxi
9 官厅 10号 Guanting 10 河北遵化 Zunhua, Hebei 24 初云 Chuyun 日本 Japan
10 遵达栗 Zundali 河北遵化 Zunhua, Hebei 25 柞红栗 Zhahongli 陕西柞水 Zhashui, Shaanxi
11 野板栗 Yebanli 安徽广德 Guangde, Anhui 26 南甘林 Nanganlin 山东莒南 Jupinan, Shandong
12 东密坞无花 Dongm iwu W uhua 河北迁安 Q ianpian, Hebei 27 燕昌 Yanchang 北京昌平 Changp ing, Beijing
13 丹泽 Danze 日本 Japan 28 燕红 Yanhong 北京昌平 Changp ing, Beijing
14 筑波 Zhubo 日本 Japan 29 辽丹 61 L iaodan 61 辽宁宽甸 Kuandian, L iaoning
15 处暑红 Chushuhong 江苏宜兴 Yixing, J iangsu 30 大早熟 Dazaoshu 辽宁凤城 Fengcheng, L iaoning
112　方法
采用改进的 CTAB法 (艾呈祥 等 , 2006) 从硅胶干燥好的幼叶中提取总 DNA。
AFLP分析所用试剂盒从北京鼎国生物技术公司购买 , 按照说明书进行操作。各样品基因组 DNA
的酶切和接头的连接在同一反应中进行。在 15μL反应体系中含有 DNA模板 (100 ng·μL - 1 ) 2μL,
EcoRⅠ和 M seⅠ接头 1μL, EcoRⅠ ( 4 U·μL - 1 ) 和 M seⅠ ( 4 U·μL - 1 ) 2μL, 10 ×PCR buffer 2
μL, 10 mmol·L - 1ATP 2μL, T4 L igase (3 U·μL - 1 ) 1μL, 超纯水 5μL。将上述混合液均匀离心数
秒 , 37 ℃保温 4 h, 8 ℃保温 3 h, 4 ℃过夜。
用预扩增引物组合进行预扩增。反应体系为 20μL。含酶切 —连接产物 2μL, EcoRⅠ和 M seⅠ预
扩增引物 1μL, dNTPs 015μL, 10 ×PCR buffer 2μL, Taq DNA聚合酶 (5 U·μL - 1 ) 012μL, 超纯
水 1413μL。预扩增反应程序为 : 94 ℃变性 30 s, 55 ℃复性 30 s, 72 ℃延伸 60 s, 循环 35次。预扩
增产物稀释 20倍 , - 20 ℃保存备用。
用荧光标记的经过筛选的 7对引物 (表 2) 进行正式选择性扩增。其中 M seⅠ引物的 5′端用荧光
染料进行标记。反应体系为 20μL。含预扩增产物稀释后的 DNA样品 2μL, 10 ×PCR buffer 2μL,
dNTPs 015μL, EcoRⅠ引物 (5 ng·μL - 1 ) 1μL, M seⅠ引物 (5 ng·μL - 1 ) 1μL, Taq DNA聚合酶
(5 U·μL - 1 ) 012μL, 超纯水 1313μL。选择性扩增 PCR程序为 : 94 ℃ 30 s, 65 ℃ (以后每轮循环
温度递减 016 ℃) 30 s, 72 ℃ 60 s, 扩增 12轮 ; 然后 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 再进行 23
个循环。
电泳与数据处理取选择性扩增后的样品在 AB I 377自动测序仪上电泳分离检测 , 得到 AFLP的
DNA指纹图谱。
利用 GeneScan 311软件将 30个个体 7对荧光引物产生的电泳图转换为 0, 1矩阵。用 NTSYS
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2110版软件中的 D ICE法计算样品间的相似系数 , 并用 SAHN Clustering进行不加权成对算术平均法
(UPGMA ) 进行聚类分析。
2　结果与分析
211　不同引物组合扩增产物的多态性
利用从 49对引物中筛选出的 7对 AFLP引物对 30份板栗生物型的基因组 DNA进行片段长度多态
性扩增 , 获得了较好的扩增结果 (图 1, 表 2)。
图 1　用 E2AAC / M 2CGT引物组合对板栗扩增的 AFL P图谱
M: Marker; 1～30: 品种编号同表 1。
F ig. 1　AFL P f ingerpr in ting pa ttern s of chestnut cultivars using the pr im er com b ine of E2AAC / M 2CGT
M: Marker; 1 - 30: The cultivars serial number is the same as Table 1.
表 2　7对引物选择性扩增引物产生的条带多态性
Table 2　Polym orph ism of AFL P bands obta ined by selective am plif ica tion ba sed on 7 pr im er pa irs
序号
No.
引物组合
Primer combination
总带数
Total band number
多态性带数
Polymorphic band number
多态性位点百分率 /%
Polymorphic band percentage
1 E2AAC / M2CGT 129 113 8716
2 E2AAC / M2CAT 137 124 9015
3 E2AAC / M2CAA 142 126 8817
4 E2ACC / M2ACT 133 119 8915
5 E2ACC / M2CTG 141 127 9010
6 E2ACC / M2CAT 153 125 8117
7 E2ACG / M2CTT 127 118 9219
合计 Total 962 852
平均 Average 137 122 8910
947
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共扩增出 962条谱带 , 其中 852条具有多态性 , 占 89% , 平均每对引物扩增出 137条可统计的
带 , 122条具有多态性。可见 , AFLP检测板栗种质资源遗传多样性的效率很高。
212　聚类分析
30份板栗品种资源两两间的相似系数分布在 0154～0191之间 , 其中 24号 (初云 ) 与 27号 (燕
昌 ) 的相似系数最小 , 为 0154, 表明两品种间的亲缘关系最远。22号 (郯城 023) 与 26号 (南甘
林 ) 的相似系数最大 , 为 0191, 表明两品种间的亲缘关系最近。4个日本栗品种的平均相似系数在
0178～0189之间 , 品种间的相似系数普遍高于中国栗 (0154～0191) , 说明中国板栗遗传多样性水平
高于日本栗。
从图 2可以看出 , 以相似系数 0159为标准 , 30份板栗品种资源可分为两大类群。
第 1类包括 8个品种 , 分为 2个亚类 :
第 1亚类包括 4个品种 (13丹泽、14筑波、18银寄和 24初云 ) , 均为日本品种 , 这些品种果实
个大 , 产量高 , 质地粳 , 易于加工 , 可能是一些比较特殊的遗传材料 , 其遗传特性还有待于进一步研
究。
第 2亚类包括 29辽丹 61、8辽丹 58、30大早熟和 6早丰 4个品种 , 均为辽宁品种 , 属于丹东栗
系列。
第 2类包括 22个品种 , 又可分为 2个亚类 :
第 1亚类包括北京的 21燕丰、28燕红和 27燕昌 , 陕西的 25柞红栗 , 共 4个品种。
第 2亚类包括 18个品种 , 又可再分 4个组 : 第 1组包括 13个品种 (1红栗 4号、4中明栗、22
郯城 023、26南甘林、2短枝 3号、15处暑红、16石丰、19焦刺、3官厅 7号、20红栗 3号、11野
板栗、7短枝 1号、10遵达栗 ) , 其中 4个山东品种 ( 1红栗 4号、4中明栗、22郯城 023、26南甘
图 2　依据 AFL P标记的板栗品种资源聚类图
F ig. 2　D endrogram of cluster ana lysis for chestnut cultivars ba sed on AFL P markers
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林 ) 首先相聚在一起 ; 2个河北品种 (3官厅 7号、10遵达栗 ) 也首先相聚 , 2个江苏品种 (15处暑
红、19焦刺 ) 也首先聚在一起 ; 第 2组包括 2个江苏品种 (5短扎、17炮车 2号 ) ; 第 3组包括 2个
河北品种 (9官厅 10号、12东密坞无花 ) ; 第 4组包括 1个陕西品种 (23柞 11)。
由此结果可以看出 , 多数来源地相同的品种资源表现出较为密切的亲缘关系 , 但也有不同来源地
的品种聚在一起的情况 , 如陕西的柞红栗与北京的燕丰、燕红、燕昌聚在一起 ; 山东的短枝 3号与安
徽的野板栗聚在一起。
213　AFL P指纹图谱的特征和不同引物组合的检测效率
7组引物在 30个品种中检测到数目不等的品种特异带型 (表 3) , 可以根据这些品种的特异带型
来鉴别板栗品种。
7组引物品种间的检测效率最高达 84% , 最低为 61% , 平均为 72%。其中 , E2AAC / M 2CGT、
E2AAC / M 2CAA分别能区分其中的 18份种质 , E2AAC / M 2CAT、E2ACG / M 2CTT分别能区分其中的
20份种质 , E2ACC / M 2ACT、E2ACC / M 2CAT分别能区分其中的 23份种质 , E2ACC / M 2CTG能区分
其中的 25份种质。引物 E2AAC / M 2CGT分别和 E2AAC / M 2CAT、E2ACC / M 2ACT、E2ACC / M 2CTG
或 E2ACG / M 2CTT任意一组引物结合 , 或 E2AAC / M 2CAA与 E2ACC / M 2CAT结合等都能将 30个板
栗品种完全区分开。因此可以将这些引物组合作为参考来选择鉴别板栗品种。
表 3　品种的特异带型和引物组合的品种间鉴别效率
Table 3　Spec if ic bands and iden tif ica tion percen tage of pr im er com b ina tion for cultivars
序号
No.
引物组合
Primer combination
总带数
Total band number
多态性带数
Polymorphic band number
鉴别效率 /%
Polymorphic band percentage
1 E2AAC / M2CGT 41 4 61
2 E2AAC / M2CAT 37 6 84
3 E2AAC / M2CAA 43 6 81
4 E2ACC / M2ACT 35 5 76
5 E2ACC / M2CTG 31 7 68
6 E2ACC / M2CAT 32 7 73
7 E2ACG / M2CTT 35 4 62
平均 Average 36 5. 7 72
3　讨论
国内外学者关于板栗遗传多样性的研究主要是利用同工酶和 RAPD标记技术进行 , 且主要集中在
种间和群体间的研究 (Casasoli et al1, 2001; 暴朝霞和黄宏文 , 2002) , 而对板栗优良品种 (品系 )
的遗传多样性的研究较少 , 特别是利用 AFLP技术从 DNA水平上对板栗品种 (品系 ) 的研究报道则
更少。
Casasoli等 (2001) 利用 ISSR标记研究欧洲栗种质资源的遗传变异获得 8319%的多态性位点 ,
暴朝霞和黄宏文 (2002) 利用同工酶技术研究中国板栗品种群获得 8617%的多态性位点。本试验中
利用荧光标记引物 AFLP方法分析了 30份板栗和日本栗品种资源的遗传差异 , 获得了 89%的多态性
位点 , 并且中国板栗品种间的平均相似系数在 0154～0191之间 , 普遍低于日本栗品种 ( 0178～
0189) , 说明中国板栗遗传多样性水平高于日本栗。与同工酶、RAPD、 ISSR标记相比 , AFLP标记更
能揭示材料间丰富的遗传变异及其高水平的分化度 , 可能与板栗生境的多样性、风媒异交等因素造成
的基因漂变有关。
聚类图上多数来源地相同的品种资源表现出较为密切的亲缘关系。说明板栗品种间的亲缘关系与
原产地有很大的相关性。由于板栗为雌雄同株异花传粉植物 , 同一地区中相互授粉的机会多 , 基因交
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换频繁 , 品种的遗传基础趋于相似 , 因而起源地相同品种间具有较近的亲缘关系 , 品种间遗传一致性
较高。但也有不同来源地的品种聚在一起的情况 , 这种现象可能是因为地区间的引种交流导致了某些
基因在不同地区之间的渗入 (艾呈祥 等 , 2007) , 也可能是分子标记方法可反映基因组本质的差异
所致 (王志峰 等 , 2004) , 但仍需今后研究中进行更多的论证。
板栗种质在长期的自然选择和人工选择下积累了丰富的遗传变异 , 遗传组成异常复杂 , 使得某些
种类尽管分子标记结果相似系数较高 , 但植物学形态特征却有较大差异 , 也有的种类分子标记结果相
似系数较低 , 但仍有可能表现出相似的形态特征。因此 , 有必要结合形态与分子分类对板栗种质进行
更深入研究 , 以便为板栗种质资源利用及品种改良等提供科学依据。
此外 , 不同生态区板栗品种间遗传差异相对较大。在进行板栗杂交育种时 , 应尽可能选择生态类
型差异较大的育种材料 , 特别是日本的优良种质资源 , 以便杂交后代中有更多机会出现理想的性状组
合 , 培育更多更好的板栗新品种。
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