全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 371 - 376
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 08 - 06; 修回日期 : 2007 - 12 - 05
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA100108) ; 黑龙江省自然科学基金项目 (C200526)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zwqin727@1631com)
黄瓜抗霜霉病相关基因 cDNA片段的克隆与分析
李金鑫 1 , 秦智伟 13 , 丁国华 1, 2 , 周秀艳 1
(1 东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 150030; 2 哈尔滨师范大学生命科学学院 , 哈尔滨 150080)
摘 　要 : 以抗霜霉病黄瓜 ‘东农 129’为试材 , 利用基因差异显示技术 (DDRT2PCR) 研究了黄瓜接
种霜霉病菌前后基因表达的差异。共分离出 4个接菌后在叶片中特异表达的 cDNA片段 , 分别命名为 4922、
5025、5027和 52214。同源性比对发现 , 5027号片段与黄瓜脂氧合酶基因部分同源 , 其余为未知新基因序
列。表达分析显示 , 所筛选的 4个差异表达基因片段与黄瓜感染霜霉病菌有密切关系。4922号片段在所检
测的整个感染过程都有很强的表达 ; 5025号片段与病菌侵染也有较密切的关系 , 但相对 4922表达延迟 ;
5027和 52214仅在接种 24 h有一定表达 , 显示出与病菌诱导之间的特殊关系。
关键词 : 黄瓜 ; 霜霉病 ; 抗病相关基因 ; mRNA差异显示
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320371206
C lon ing and Ana lysis of Resistance2rela ted Genes for D owny M ildew in
Cucum ber
L I J in2xin1 , Q IN Zhi2wei13 , D ING Guo2hua1, 2 , and ZHOU Xiu2yan1
(1 Horticu lture College, N ortheast A gricultural U niversity, Harbin 150030, Ch ina; 2L ife Science College, Harbin N orm al U niversi2
ty, Harbin 150080, China)
Abstract: D ifferential disp lay reverse transcrip tase PCR (DDRT - PCR) method was used to exp lore the
differential gene exp ression in cucumber resistant cultivar‘Dongnong 129’before and after inoculated with
Pseudoperonospora cubensis. Four special exp ressed cDNA segments were obtained in the inoculated cucumber
leaves, which were named as 4922, 5025, 5027 and 52214. BLAST analysis revealed that the nucleotide se2
quence of 5027 was homologous partly to the lipoxygenase29 in cucumber, and the otherswere the unknown se2
quences of novel genes. Further analysis on exp ression showed that the 4 fragments were closely related with
the infection of P. cubensis. The fragment of 4922 exp ressed intensely during the total time of infection; the
fragment of 5025 also had a close relationship with pathogen infection and its exp ression was delayed than that
of 4922; the fragments of 5027 and 52214 only exp ressed at 24 h after inoculation, which showed the special
relation with the pathogen inoculation. This study p rovided some useful information for further understanding of
the mechanism of resistance to downy m ildew in cucumber and isolating the resistance gene for app lication of
molecular breeding.
Key words: cucumber; downy m ildew; disease resistance2related genes; mRNA differential disp lay
黄瓜霜霉病是一种流行性很强的叶部病害 , 也是保护地栽培黄瓜的主要病害 (曹清河 等 ,
2007) , 由真菌 Pseudoperonospora cubensis (Berk. &M. A. Curtis) Rostovzev引起 , 每年给黄瓜生产造
成很大损失。黄瓜基因资源中存在对霜霉病的抗性基因 , 多数研究者认为该基因为隐性基因 ( van
V liet & Meysing, 1974; Fanourakis & Simon, 1987; Pierce &W ehner, 1990) , 但至今还未被分离出来 ,
有关黄瓜抗霜霉病分子机制尚不清楚。因此克隆抗病黄瓜品种受病菌诱导表达的基因 , 从中筛选抗病
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相关基因 , 有助于揭示黄瓜抗病的分子机理 , 也为寻找抗病基因的分子标记从而获得抗病基因开辟新
途径。
mRNA差异显示技术是一个研究基因差异表达调控和基因克隆的有效工具 (L iang & Pardee,
1992)。该方法操作简便 , 工作量小 , 被广泛应用于植物抗病相关基因研究领域 (Lang et al. ,
2005)。本研究以抗霜霉病黄瓜品种 ‘东农 129’作为试验材料 , 利用 mRNA差异显示技术 , 研究黄
瓜叶片经霜霉病病原菌侵染后基因表达的差异 , 从中筛选与黄瓜霜霉病抗性相关的基因 , 鉴定所得差
异表达基因的功能 , 辅助黄瓜抗病育种工作。
1　材料与方法
111　材料
对抗霜霉病黄瓜品种 ‘东农 129’4～5片真叶期的无菌幼苗进行霜霉病病原菌接种。接种方法
参照陈海平等 (2005) 的方法略有改进。用毛笔洗下黄瓜叶片感病组织上的霜状霉层 , 调整溶液内
孢子囊浓度为 150倍显微镜下每视野 5～12个孢子囊 , 用毛笔涂刷接种 4～5片真叶期无菌苗 , 共接
种 10株 , 套袋保湿 , 放置于 24 ℃环境中。对照组同时涂刷蒸馏水。接种 24 h后用毛笔蘸取纯净水
轻刷叶片 , 叶片一些区域不能聚合成水珠 , 说明霜霉病病原菌已侵染植株叶片 , 接种 72 h后植株叶
片出现霉斑。分别于接种后 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、4 d和 5 d取植株叶片 (对照组同时取
样 ) , 置于 - 70 ℃冰箱保存待用。
112　方法
11211　总 RNA的制备及 cDNA第一链的合成 　
使用普利来公司植物 RNA提取试剂盒提取样品总 RNA, 使用基因组 DNA污染清除剂清除 RNA
中的 DNA污染 , 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA完整性 , 紫外分光光度计测量 RNA浓度 , 总 RNA存
于 - 70 ℃冰箱保存。分别将每组各时期总 RNA等量混合 , 建立对照组 RNA池和诱导组 RNA池 , 用
于逆转录。
逆转录参照 TaKaRa公司 RT2PCR试剂盒 , 分别取对照组和诱导组总 RNA (1μg·μL - 1 ) 1μL,
Anchor p rimer (5μmol·L - 1 ) 8μL进行逆转录 , 所用 3′端锚定引物 olig ( dT) 为 T17 A、T17 G和 T17 C。
11212　DDRT - PCR分析 　
上述 3种 3′端锚定引物与 29种随机引物 (B0301, B0302, ⋯⋯B0329) 组成 87种引物组合 ,
分别以对照组和诱导组 cDNA为模板进行 PCR扩增。锚定引物和随机引物均购自上海生工生物工程
公司。
25μL PCR反应体系中含有 cDNA 1μL, 锚定引物 ( 5μmol·L - 1 ) 2μL, 随机引物 (5μmol·
L - 1 ) 2μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 2μL, PCR缓冲液 ( 10 ×) 215μL, dNTP ( 2 mmol·L - 1 ) 2
μL, Taq酶 (1 U·μL - 1 ) 1μL (其中 Taq DNA聚合酶为 MB I公司产品 )。反应条件为 : 94 ℃变性 5
m in, 94 ℃ 30 s, 40 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 40个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。反应结束后取 5μL产物
进行 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分析 , 银染法显色。
11213　差异条带的回收和再扩增 　
将胶板上的差异片段用刀片小心切割回收放入 115 mL离心管 , 编号 , 注明其表达情况和扩增所
用引物。每管加 40μL ddH2 O, 沸水浴 5 m in, 于 4 ℃冰箱冷却 , 取 5μL作为模板进行再扩增 , 扩增
体系和条件同前 , 扩增产物采用 115%琼脂糖凝胶检测 , 再扩增产物为单一条带的进行回收纯化 (使
用上海华舜生物工程有限公司胶回收试剂盒 )。
11214　反向 Northern杂交鉴定 　
按照张宇伟和来茂德 (2004) 方法进行反向 Northern杂交。取 10μL胶回收产物点样于尼龙膜
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　3期 李金鑫等 : 黄瓜抗霜霉病相关基因 cDNA片段的克隆与分析 　
上 , 分别以对照组和诱导组 cDNA为探针与其进行杂交。探针标记、洗膜和显色方法参照 Roche公司
的 D IG Labeling Kit说明书进行。与对照组探针无杂交信号、与诱导组探针有杂交信号的差异片段为
阳性差异片段。
11215　阳性片段的克隆与鉴定 　
将阳性差异片段与 pGEM 2T easy载体 ( Promega公司产品 ) 连接 , 转化 DH5α感受态大肠杆菌 ,
蓝白斑筛选 , 每平板挑 15个白斑 (即克隆 ) , 菌液培养 , 菌液 PCR扩增验证 , 扩增体系和条件同前。
11216　测序及序列分析 　将上述通过 PCR验证的阳性克隆送上海生工生物工程公司测序 , 测序结果
用美国国家生物技术信息中心 NCB I网站 (www1ncbi1nlm1nih1gov) 的 BLAST进行 DNA序列的相似
性分析。
11217　阳性片段的特异性表达鉴定 　
使用 Primer Prem ier 510软件为每个阳性片段设计 1对特异引物 (表 1) , 模板分别为 ‘东农 129’
基因组 DNA (CK + )、无菌幼苗子叶 cDNA (CK - )、霜霉病菌接种 0、6、12、18、24、48和 72 h
的叶片 cDNA、以及雄花、雌花、幼嫩果实、衰老果实和成熟 ‘东农 129’植株感病 20 d后叶片组织
的 cDNA。PCR反应体系同前 , 反应条件为 : 94 ℃变性 5 m in, 94 ℃ 30 s, 退火温度 (表 1) 1 m in,
72 ℃ 1 m in, 40个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。扩增产物采用 115%琼脂糖凝胶检测。
表 1　用于阳性片段特异性表达鉴定的引物序列
Table 1　Pr im er sequences used for iden tif ica tion of spec ia l expression of positive D NA fragm en ts
引物
Primers
序列 Sequence
(5′- 3′)
扩增片段长度 / bp
Product size
退火温度 /℃
Annealing temperature
5027F TCTTTTGTAGTGTCAGATTG 158 4219
5027R ACAGAAGAACACATAGCAG
5025F GATTGTGGAAAACTTGTATG 167 4217
5025R GTCCATTAGAACATTAGG
4922F GAAAGAAACAGAAGGTGC 212 4616
4922R TAGACAAAGGTGAGGAATC
52214F CCAATGCACACACTTTCC 391 4619
52214R GGATTTAGACTATTTGGGATG
2　结果与分析
211　差异表达片段的显示
使用 87种引物组合进行 RT2PCR, 扩增产物
在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 银染后可以显现
出较清晰的条带。由图 1可以看出 , 4泳道上有
两条上调表达基因 , 6泳道上有一条上调表达基
因 , 5和 7泳道上分别有一条下调表达基因。
212　差异表达片段的反向 Northern鉴定
将所得差异表达片段进行反向 Northern杂交
鉴定 , 验证其真实性。在所获得的 31个差异表达
基因片段中 , 经杂交鉴定 , 5个基因片段具有杂
交信号。由图 2可以看出 , 第 36和 38号基因片
段在对照组和诱导组 cDNA 探针杂交均有信号 ,
为杂交验证的阳性基因片段 , 但不是差异表达基
图 1　 RT2PCR产物的 PAGE显示
1、3、5、7: 对照组 ; 2、4、6、8: 诱导组 ; 箭头表示差异片段。
F ig. 1　D isplay of the RT2PCR products using PAGE
1, 3, 5 and 7: control group; 2, 4, 6 and 8: treatment group;
A rrows indicate the band exp ressed differentially.
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因片段 ; 第 49、50和 51号基因片段与对照组 cDNA探针杂交无信号 , 但与诱导组 cDNA探针杂交有
信号 , 只在诱导组中表达。这 3个基因片段在电泳结果中也表现为上调表达 , 杂交结果与电泳结果相
符 , 可证明其为阳性差异表达基因片段 , 由此计算出本试验所得差异表达基因的假阳性率高达 90%。
图 2　差异表达基因片段与对照组 ( A) 和诱导组 ( B) cD NA探针 Northern杂交
标号为待检测差异片段编号。
F ig. 2　Northern blot hybr id iza tion of d ifferen tia l d isplay genes, the probes were cD NA
of con trol group ( A) and trea tm en t group ( B)
Tabs are the number of segments needed to check.
213　差异表达片段的序列分析
采用 NCB I的 BLAST程序进行序列同源性搜索与相似性比对 , 结果 (表 2) 表明所得 4个克隆基
因片段中的 3个与已知序列无同源性 , 5027号基因片段的 298个核苷酸中有 109个核苷酸与黄瓜脂氧
合酶基因 100%同源 , 氨基酸序列同源性达到 90%。
表 2　差异表达基因片段的 D NA序列
Table 2　D NA sequences of fragm en ts of d ifferen tia l d isplay genes
编号 No. 大小 / bp Size 序列 Sequences
4922 298 TGATCTAAGG CCGAGAAGGA AGCACGAAAG AAACAGAAGG TGCAAGCATT TCAGCAAGCG
AAAGCGAAAG CCAAATCAAA AGGGCTAAAG AATGCGAAGA GATGGAATTG AATGAGACAT
ATTTTTTTAA AAAAACTCTC ATCAAGAACG TTATTTATTG AAACTAATGT TACTGATAGG
AATTAGAAAG CCTAGGAGGT GTAGCACATT GTGAGCCGGA TTCCTCACCT TTGTCTATAA
TGTATAAATA GAATCCTAAG CTCTTTATTT AGATATCTGT AATGGAAAAT CTTATCCA
5025 248 TAAGCTTTTT TTTTTGTAGA GGAGACTTAT GTAGCTGAAA TTTTGATTGT GGAAAACTTG
TATGTTTAAA GAAAGTGATG GAGCATTACT TGTTTGTCCA TAGAGAGAAA CAATGAGATG
ATTAGATCAT TTGTAAGCTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTCTACACA GAACGAGTAC
CTTAAATTAG AGACCTAATG TTCTAATGGA CTATTCAACA ATTTCTTTTT CCCAAAAAAA
AAAGCTTA
5027 298 TAAGCTTTTT TTTTTGGTAG CAGATTTTTG TCTTTTGTAG TGTCAGATTG TTATTGTTGT
CTTTGTTTTA TATATACATA AGCTTTTTTT TTTTTTTTTA CGGTTGTCGT TTAAGGAGAT
GAATGAAGTA TATTCATTAC CTGATCAATA GTGAGTCCAT TCAAATGTTC TGCTATGTGT
TCTTCTGTTA TGGAACTATT TTGCTTTCCA TATGTTTTAG GATCCAACTT GCTGACTGGA
GGGAACTCCT ACAAAGGAAC ATTTTGAAGT GAATTATGGA TGCAAAAAAA AAAGCTTA
52214 437 TCGATTGATC ATAGCGTCCC AATGCACACA CTTTCCCACC AACATATCCA CGTTGGGCAT
TATGAAACGA TGTGGGTCCT CTCTTTTAAA CTGAACAAAA ATATTAAACT TTTTTTTTTT
TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTACAAGGGA AAAAAGGGAA
AAAACATAAG TTTCTCCAAA ATGATGGAAA TTATAACTTA CAAAAAAAAA TCCCTATCTA
TAAATGACAA AGGGGCCTTT ATTCTTTGTA AAAGGGGGCC TATCTCTTAT ATTTTCCTTT
GTTTCATATT CAGGCAGGGT AATTTGGCCA ACCAACGCTT TACCTTCCCT TTGATGCGTT
TGTTTTATTC TCCCATTTGA TATGTATGCA TCCCAAATAG TCTAAATCCC TGATCCAAAA
AGTCTGCGCT ATGATCA
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　3期 李金鑫等 : 黄瓜抗霜霉病相关基因 cDNA片段的克隆与分析 　
214　差异表达基因片段的表达分析
由图 3可以看出 , 4922号基因片段在抗霜霉病黄瓜品种 ‘东农 129’基因组 DNA中存在 , 在其
未接菌的子叶中不表达 , 霜霉病侵染后 6 h至 72 h (最后一次取样 ) , 该基因片段始终有很强烈的表
达 , 可能伴随了整个侵染过程。在成熟植株感病 20 d后 , 该基因片段在病叶中仍有表达。该基因在
雌花和雄花中均无表达 , 但在幼嫩和衰老的果实中有微弱表达 , 这可能是由于植株果实被霜霉病菌侵
染引起。
5025号基因片段与 4922号有很大不同 , 表现为 : 开始表达的时间延迟到接菌诱导后 24 h, 至 48
h和 72 h时表达量有所下降 ; 该基因在植株感病后期的叶片中也有一定量的表达 , 在黄瓜幼嫩果实中
可表达 , 但在衰老的黄瓜果实中不表达。
5027号基因片段的表达特异性很强 , 仅在霜霉病菌诱导后 24 h的叶片中特异表达 , 在其他病诱
导时期及非叶片部位都不表达。
52214号基因片段的表达特异性较强 , 只在霜霉病菌诱导后 24 h和 48 h两个时期的叶片中特异表
达 , 在其他时期和部位不表达。
图 3　差异表达基因片段的 RT2PCR结果
1: 幼果 ; 2: 老果 ; 3: 病叶。
F ig. 3　RT2PCR results of the fragm en ts of d ifferen tia lly expressed genes
1: Young fruit; 2: Mellow fruit; 3: Infected leaves.
3　讨论
本研究所获得的差异表达基因片段在无菌植株的子叶期和霜霉菌诱导前的真叶内均不表达 , 反映
出这些基因片段与黄瓜霜霉病菌的感染密切相关。4922号基因片段的表达持续时间最长 , 几乎伴随
整个病菌感染阶段 , 显示出植物抗病防卫基因的作用特点 (Abramovitch & Martin, 2004) , 但其反应
迅速 (接种病菌 6 h即开始表达 ) 符合抗病信号传导的特点 ( Zhu et al. , 1996)。其余 3个基因片段
的表达均较 4922号延迟 18 h, 其中 5027号基因片段与黄瓜脂氧合酶基因部分同源 , 应当也属于植物
防卫基因。
植物受到伤害和病虫害危害时 , 脂氧合酶活性和代谢产物剧增 , 氢过氧化物、氧化自由基及挥发
性醛类化合物都不利于病虫生长 , 能够促进伤口愈合 , 也能抵御微生物的侵染 , 表现为抗病植株的脂
氧合酶活性较敏感植株的高很多 ( Siedow, 1991; 葛云侠 等 , 2007)。脂氧合酶可能在伤害及病虫害
防御中扮演着重要的角色 , 它可能是通过其作用的产物如茉莉酸的信号作用 , 使植物体构建起防御体
系 ( Siedow, 1991; Bell et al. , 1995; R ickauer et al. , 1997)。
本试验表达分析过程使用的霜霉病菌采自东北农业大学园艺试验站 , 未涉及其他霜霉病生理小
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种 , 因此仍需对其他生理小种诱导后各片段表达情况进行分析。此外还需进一步研究以得到这些基因
片段的全长 , 并确认各个片段与黄瓜抗霜霉病之间的关系。
References
Abramovitch R B, Martin G B. 2004. Strategies used by bacterial pathogens to supp ress p lant defenses. Curr Op in Plant B iol, 7 ( 4) : 356 -
364.
Bell E, Creelman R A, Mullet J E. 1995. A chlorop last lipoxygenase is required for wound2induced jasmonic acid accumulation in A rabidopsis.
Proc Natl Acad Sci USA, 92 (19) : 8675 - 8679.
Cao Q ing2he, W an Hong2jian, Chen J in2feng. 2007. Progress on downy m ildew resistance in cucumber. China Cucurbits and Vegetables, ( 1) :
27 - 30. ( in Chinese)
曹清河 , 万红建 , 陈劲枫. 2007. 黄瓜霜霉病抗性研究进展. 中国瓜菜 , (1) : 27 - 30.
Chen Hai2p ing, Feng Chun2mei, Mo Shi2bin, Dong He2ling, Dong Guo2kun. 2005. First report of the harm and pathogens identify of broccoli
corm change brown. Journal of Zhejiang Agricultural Science, (1) : 63 - 65. ( in Chinese)
陈海平 , 冯春梅 , 莫石彬 , 董荷玲 , 董国堃. 2005. 西兰花球茎褐变危害及病原鉴定初报. 浙江农业科学 , (1) : 63 - 65.
Fanourakis N E , Simon P W. 1987. Analysis of genetic linkage in the Cucumber. J Hered, 78 (4) : 238 - 242.
Ge Yun2xia, Yao Yun2cong, Zhang J ie, Han Zhen2hai. 2007. Relationship between lipoxygenase activity and senescence in ap ricot leaves under
drought stress. Journal of Fruit Science, 24 (7) : 102 - 104. ( in Chinese)
葛云侠 , 姚允聪 , 张　杰 , 韩振海. 2007. 干旱胁迫对杏脂氧合酶活性的影响. 果树学报 , 24 (7) : 102 - 104.
Lang P, Zhang C K, Ebel R C, Dane F, DozierW A. 2005. Identification of cold acclimated genes in leaves of Citrus unshiu bymRNA differenti2
al disp lay. Gene, 359: 111 - 118.
L iang P, Pardee A B. 1992. D ifferential disp lay of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 257 (5072) :
967 - 971.
Pierce L K , W ehner T C. 1990. Review of genes and linkage group s in cucumber. HortScience, 25 (6) : 605 - 615.
R ickauerM, B rodschelm W , Bottin A, Véronési C, Grimal H, Esquerré2TugayéM T. 1997. The jasmonate pathway is involved differentially in
the regulation of different defense responses in tobacco cells. Planta, 202 (2) : 155 - 162.
Siedow J N. 1991. Plant lipoxygenase: structure and function. Annu Re Plant Physiol PlantMol B iol, 1: 101 - 109.
van V liet G J A , MeysingW D. 1974. Inheritance of resistance to Pseudoperonospora cubensis in cucumber (Cucum is sativus L. ) . Euphytica,
(23) : 251 - 255.
Zhang Yu2wei, Lai Mao2de. 2004. A non2radioactive method used for reverse northern. Hereditas, 26 (3) : 353 - 355. ( in Chinese)
张宇伟 , 来茂德. 2004. 非同位素反向 Northern筛选法. 遗传 , 26 (3) : 353 - 355.
Zhu Q, D rÊge2LaserW , D ixon R A, Lamb C. 1996. Transcrip tional activation of p lant defense genes. Curr Op in Genet, 6 (5) : 624 - 630.
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