全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 391 - 396
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 28; 修回日期 : 2007 - 02 - 09
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2006AA100107) ; ICGEB项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xiech@mail1hzau1edu1cn)
马铃薯晚疫病水平抗性的 QTL标记评价
柳　俊 1 , 吴承金 2 , 胡　诚 1 , 宋波涛 1 , 田振东 1 , 谢从华 13
(1 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 , 国家蔬菜改良中心华中分中心 , 武汉 430070; 2 湖北恩施州农业
科学院马铃薯研究所 , 湖北恩施 445000)
摘 　要 : 以 11个马铃薯晚疫病水平抗性杂交组合后代的 636个基因型为材料 , 对 4个与晚疫病 ( Phy2
tophthora infestans) 水平抗性相关位于不同染色体的 QTL位点标记 GP179、GP76、p rp1和 GP125进行了评
价。结果显示 : 4个 QTL位点标记共有 6个特征带 , 在不同遗传背景的组合中带型分布存在差异 ; 田间抗
病性与 4个标记的总带数呈极显著直线相关 ; 主要成分分析表明 , p rp1570位点标记解释了供试材料 35%的
抗性表型变异 , 为主效 QTL。结合抗性表型分析 , 组合群体的抗性与 QTL位点数有关 , 而个体的抗病水平
与主效 QTL有关。
关键词 : 马铃薯 ; 晚疫病 ; 水平抗性 ; QTL标记
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220391206
Eva lua tion of QTL M arkers A ssoc ia ted w ith Hor izon ta l Resistance to La te
Blight of Pota to
L IU Jun1 , WU Cheng2jin2 , HU Cheng1 , SONG Bo2tao1 , TIAN Zhen2dong1 , and X IE Cong2hua13
〔1 Key Laboratory of Horticu ltura l P lan t B iology, M in istry of Educa tion, N ational Cen ter for V egetable Im provem ent (Cen tra l Chi2
na) , Huazhong A gricultural U niversity, W uhan 430070, Ch ina; 2 Pota to Research Institu te, Enshi A cadem y of A gricultural Sci2
ences, Enshi, Hubei 445000, Ch ina〕
Abstract: To imp rove the selection efficiency of potato horizontal resistance to late blight caused by Phy2
toph thora infestans, molecular markers ( GP179, GP76, p rp1 and GP125) of 4 quantitative trait loci (QTL )
linked to potato late blight resistance and located on different chromosomes were evaluated with 636 pedigrees
derived from 11 potato crosses with parental materials possessing horizontal resistance to late blight. The re2
sults showed that there were 6 bands p roduced by all the 4 markers and band distribution varied with crosses
that have different genetic background. The resistance level of the pedigrees identified in the field was signifi2
cantly related to the total number of the bands yielded by the 4 markers with a linear function. The dom inant
component analysis revealed that locus p rp1570 exp lained 35% of the phenotyp ic variance of the resistance and
its linked QTL was hence classified as a dom inant locus of late blight resistance. Combining the phenotyp ic a2
nalysis together, the experimental results have reinforced the evidence that late blight resistance is related to
the number of QTL s when a whole potato population ( i. e. all pedigrees of a cross) is taken into account and
the dom inant locus determ ined the resistance level of individuals within this population.
Key words: Potato; Phytoph thora infestans; Horizontal resistance; QTL marker
晚疫病是由卵菌 〔Phytoph thora infestans (Mont. ) de Bary〕引起的马铃薯最重要的病害之一
(Anonymous, 2002)。
就遗传基础而言 , 马铃薯晚疫病抗性分为单基因 (R ) 控制的小种特异抗性 (或称垂直抗性 ) 和
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多基因控制的非小种特异抗性 (或称水平抗性 )。马铃薯晚疫病主效抗性基因 R12R11主要来自于野
生种 S. dem issum , 现有马铃薯品种的晚疫病抗性也主要由这些 R基因控制。然而 , 这种小种专化抗
病性很容易被病原生理小种的变异所克服。
近 20年来 , 由于晚疫病菌 A2交配型的出现和在全球的迅速传播 , 加速了晚疫病菌的进化速度 ,
使病原菌生理小种突变更快 , 变异也更为复杂 ( Smart & Fry, 2001)。因此 , 选育抗性持久的马铃薯
水平抗性品种已成为目前晚疫病防治的重要策略。
由于受多基因控制 , 水平抗性的表达受环境因子的影响大 , 表型选择上还受到垂直抗性基因的干
扰 , 同时 , 马铃薯四倍体遗传的特性更是加大了一些性状选择的难度。因此 , 到目前为止 , 在育种上
还没有一种有效方法用于马铃薯微效多基因控制的性状选择 , 建立快速准确的评价方法已成为马铃薯
水平抗性育种的迫切需要。
近年来 , 针对多基因控制的抗性 QTL ( quantitative trait loci) 定位和遗传连锁图谱的构建研究已
有一些报道 , 马铃薯晚疫病抗性 QTL位点可能在全部 12条染色体上均有分布 (Leonards2Schippers et
al. , 1994; Collins et al. , 1999; Ewing et al. , 2000; Trognitz et al. , 2002) , 利用 QTL标记辅助选择
有望提高马铃薯晚疫病水平抗性评价的准确性 , 提高育种效率。然而 , QTL的实际应用涉及到位点在
不同遗传背景中分布的差异、标记数与抗性评价的稳定性等诸多因素 , 目前关于 QTL辅助选择应用
的报道还十分有限。
本研究选用已经报道的与晚疫病抗性相关的 QTL标记 , 对 11个马铃薯水平抗性组合后代同时进
行田间晚疫病抗性评价和 QTL标记鉴定分析 , 以期确立利用 QTL评价马铃薯晚疫病抗性的可能策略 ,
为 QTL分子标记的应用提供依据。
1　材料与方法
111　材料及田间晚疫病鉴定
采用从国际马铃薯中心引进的不带 R基因的 11个四倍体组合材料 , 其亲本均具有不同的水平抗
性特性。
将实生苗世代在网室中人工接种晚疫病混合小种病菌孢子 , 接种后 7～10 d进行发病调查 , 淘汰
完全不感病和极度感病的基因型。11个组合共选留 636个基因型进入无性世代作为研究的基本材料
(表 1)。
表 1　马铃薯供试材料组合及后代基因型数
Table 1　Pota to crosses and num ber of ped igrees used in the exper im en t
代码 Code 编号 Number 组合 Parental materials 基因型数 Number of pedigrees
A 395008 39265218 ×391679112 67
B 395013 39308515 ×391679112 27
C 395019 391002114 ×391679112 97
D 395021 391002115 ×39167917 79
E 395023 391002115 ×39263918 58
F 395024 39100216 ×39167917 50
G 395046 39304617 ×391679112 63
H 395048 393075154 ×39167917 37
I 395049 393075154 ×391679112 81
J 395050 393075154 ×39263918 37
K 396085 393280158 ×39263918 40
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　2期 柳 　俊等 : 马铃薯晚疫病水平抗性的 QTL标记评价 　
2001～2003年 , 在湖北恩施天池山 (海拔 1 150 m ) 连续 3年对 636个无性系进行了晚疫病鉴
定。除 2001年每个基因型取单株外 , 2002、2003年均取 5株 , 种植成 1行 , 对比法排列 , 每隔 5行
设置 2行感病对照 (品种 ‘M ira’) , 并在每行的头尾各种 2株感病对照 , 以诱发田间晚疫病。
晚疫病发病期间采用国际马铃薯中心的 9级分级标准鉴定发病等级 , 1～9级分别代表从极端抗
病到极端感病。根据 3年评价资料 , 最后的统计按记载等级归为 4大类型 , 即 1～2级 (抗病 )、3～4
级 (中抗 )、5～6级 (中感 )、7～9级 (感病 )。
112　QTL位点标记分析
根据前期试验结果 , 从已公布的与马铃薯晚疫病水平抗性相关的 QTL s标记中 , 选用位于不同染
色体的 4个 QTL s标记 (Oberhagemann et al. , 1999) 用于本研究。其标记序列、退火温度以及在染
色体上的位置见表 2。
马铃薯叶片 DNA提取参照 A ljanabi等 (1997) 的方法进行。
PCR扩增采用 25 μL 体系 ( 200 μmol/L dNTP, 115 mmol/L MgCl2 , 015 μmol/L 引物 , 110 U
TaqDNA聚合酶 , 20 ng基因组 DNA )。PCR扩增反应程序为 : 93℃ 2 m in; 93℃ 30 s、退火 ( GP179,
55℃; p rp1, 55℃; GP125, 57℃; GP76, 52℃) 30 s、72℃ 1 m in, 39个循环 ; 72℃ 5 m in。
扩增产物用 110%的琼脂糖凝胶电泳 , 溴化乙锭染色 , 凝胶成像系统观察并照相。
表 2　马铃薯抗晚疫病的 QTL标记
Table 2　M arkers tagg ing selected QTL s for resistance to la te blight of pota to
标记
Markers
引物序列
PCR p rimer sequences(5′→3′)
退火温度
Annealing temperature (℃)
连锁图位置
L inkage group
GP179 GGT TTT AGT GAT TGT GCT GC; AAT TTC AGA CGA GTA GGC ACT 55 Ⅴ
GP76 ATG AAG CAA CAC TGA TGC AA; TTC TCC AAT GAA CGC AAA CT 52 Ⅵb
p rp1 GTG ACA TGA GCA CAT AAG TC; GCA ACT TCA CTT CTG CCA TC 55 Ⅸ
GP125 AGC AGC TCT GAT GGC AAT GC; GAG CCT AGC TGC CCA GCT TC 57 Ⅺa
将每个标记扩增带的有无分别记为 1和 0, 根据所有材料的田间病级评价结果和 QTL标记检测结
果 , 采用 SPSS系统进行综合分析。
2　结果与分析
211　马铃薯组合及后代田间晚疫病抗性分布
经过连续 3年的田间评价 , 在 11个组合 636个基因型中 , 共有 491个基因型表现中抗和中感 ,
占 7712% , 表现抗病和感病的分别为 129和 16个基因型 , 占 20128%和 2152%。
模拟分析显示 , 11个组合 636个个体组成的群体 , 田间抗性趋于正态分布 , 符合水平抗性的表
型特征 (图 1)。
由于试验组合的亲本材料为经过几次轮回选择的水平抗性材料 , 且杂种群体在实生苗世代采用晚
疫病菌混合生理小种接种 , 淘汰了未表现病症 (1级 ) 和严重感病 (9级 ) 的个体 , 所以 , 剩余基因
型所组成的群体 , 其抗性分布具有向抗病方向偏移的现象。
进一步进行组合分析显示 , 由于遗传背景的差异 , 不同病级在各组合中的分布频率并不完全一
致。大多数组合中抗个体比例居多 , 但组合 395013 (B ) 和 395046 ( G) 两个组合的抗病个体比例高
于中抗个体比例 , 组合 395013 (B)、395021 (D )、395048 (H )、395049 ( I) 没有出现感病达到 8
级的个体 (图 2)。
212　QTL标记特征及在群体中的分布
PCR扩增结果显示 , 标记 GP179可以扩增出 570 bp的特征性带 , 标记 p rp1可以扩增出 300 bp、
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570 bp、800 bp 3个特征性带 , 分别记为 p rp1300、p rp1570、p rp1800 , 标记 GP125可以扩增出 1 100 bp
的特征性带 , 标记 GP76可以扩增出 800 bp的特征性带。
本研究结果显示 , QTL s标记位点在群体中的分布与杂交组合的遗传背景有关。综合 11个组合的
数据 , 标记 GP179、p rp1300、p rp1570、p rp1800、 GP125、 GP76 的总体出现频率分别为 0194、0194、
0184、0157、0191、0192。
但在不同组合中 , 各标记的出现频率则不尽一致 (图 3)。有 50%的基因型同时具有 4个标记的
6种特征带 (6个位点 ) , 含有 5个位点和 4个位点的基因型分别占 2712%和 1216% , 含 1～3个位点
的基因型只占 1014%。
就组合而言 , 395049和 395008所有标记的出现频率均高于总体频率 , 而 395023所有标记的出现
频率均低于总体频率。
就标记而言 , 标记 GP179、p rp1300和 GP76在所有组合中均具有较高的出现频率 , 而其它 3个标
记在不同组合中差异较大 , 如 p rp1800 , 在 395023组合中完全没有 , 而 395049和 395008两个组合中
的出现频率均超过 90%。标记 p rp1570在总体中的出现频率为 84% , 但在组合 395049中的出现频率达
到了 98% , 而在组合 395023中的出现频率却只有 41%。
图 3　QTL标记在各组合中出现的频率
F ig. 3　Frequency of QTL markers detected in 11 pota to popula tion s
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　2期 柳 　俊等 : 马铃薯晚疫病水平抗性的 QTL标记评价 　
213　单个 QTL标记对抗性变异的贡献率
　　主成分分析显示 , 在全部 4个标记的 6个位
点中 , 标记 p rp1570解释了 3518%的抗病性差异 ,
贡献率最大 ; GP125的贡献率最低 , 其单项方差
只占总方差的 519% ; 其余标记位点的贡献率分
布在 11% ～19% (表 3)。
因此认为 , 在本研究涉及的标记中 , p rp r1为
主效 QTL位点。
214　抗性与单个标记和位点数的相关性
田间病级与单个标记和位点数的相关分析显
示 , 4个标记的 6个位点和位点数与田间病级的
相关性从大到小依次为 p rp1570、p rp1800、位点数、
GP179、 p rp1300、 GP125、 GP76。其 中 p rp1570、
p rp1800 , 位点数与田间病级的相关性极显著 ,
GP179为显著 (表 4)。
统计显示 , p rp1570和 p rp1800出现频率高 , 则
田间病级较低 , 在田间表现抗病 (1～2级 ) 的基
因型中 , 出现该 2个标记的频率分别为 9318%和
6812% , 而在田间表现感病 (7～9级 ) 的基因型
中 , 出现该 2个标记的频率分别降低至 6215%和
3113%。试验还显示 , QTL位点的多少与田间病
级具有相关性 , 含多个 QTL标记位点的基因型具
有田间感病程度低的趋势。
表 3　单个标记在抗病性总变异中的比例
Table 3　Proportion of ind iv idua l markers
in the tota l var ia tion ( %)
标记
Marker
单个标记占总变异
Percentage in the total variation
累计
Accumulative total
p rp1570 3518 3518
p rp1800 1811 5319
p rp1300 1417 6816
GP179 1414 8310
GP76 1111 9411
GP125 519 100
表 4　马铃薯 11个组合 636个基因型 QTL位点和总位点数
与田间病级的相关性
Table 4　Rela tion sh ip between la te blight inc idence and
ind iv idua l QTL s and the tota l num ber of QTL s in 11
pota to popula tion s con ta in ing 636 genotypes
QTL 相关系数Correlation coefficient
p rp1570 - 011873 3
p rp1800 - 011653 3
位点数 - 011593 3
GP179
- 010793
p rp1300 - 01065
GP125 　01035
GP76 　010233 P = 0105; 3 3 P = 0101。
3　讨论
近年来 , 已有很多马铃薯晚疫病水平抗性 QTL分析的报道 , 这些研究显示 , 控制小种非特异抗
性的遗传成分几乎分布在马铃薯所有 12个连锁群上 (Bormann et al. , 2004) , 然而 , 在所有遗传背
景中均能呈现的 QTL位点几乎没有。
本研究对 11个组合中均出现带型的 4个 QTL标记进行评价 , 结果显示 , 不同遗传背景的 QTL位点
的分布具有较大差异。如在总体出现频率达 94%的 2个标记中 , GP179在 395023组合中出现频率只有
78% , 而在 395046和 396085两个组合中则完全没有分离 , 100%的基因型均有该标记的特征带。对于标
记 p rp1300而言 , 在 395049组合中 , 99%的基因型表现特征带 , 而在 395024组合中只有 82%的基因型具
有特征带。进一步分析组合的遗传背景可以看出 , QTL标记出现频率的差异可能与亲本有关。在 p rp1800
出现频率低于 70%的组合 395019、395021、395023、395024、395046 中 , 前 4 个组合的母本均为
391002, 而出现频率高于 80%的 395008、395013、395049、395050这 4个组合中 , 有 3个组合为同一父
本 391679112。对于大多数组合而言 , QTL出现频率高的 , 其群体的田间抗病性亦较强。
许多研究显示 , 抗性 QTL存在有主效位点。Rouppe等 (1998) 曾发现 1个主效 QTL Grp1, 在不
同的研究中分别解释了 45%和 77%的抗性变异 , Costanzo等 (2005) 利用 S. phureja ×S. stenotonum
杂交后代群体 , 也定位了 3个主效 QTL, 它们分别解释了 23%、17%和 10%的抗性变异。本研究分
析显示 , 4个标记 6个位点对抗性的贡献率从大到小依次为 p rp1570、p rp1800、p rp1300、GP179、GP76、
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GP125, 分别解释了 3518% ～519%的抗性变异 , 因此认为位于第 IX染色体末端的 p rp1为主效 QTL
位点。p rp1能扩增出 3个特异带 , 表现出复等位特征 , 这一现象在其它同类研究中也有报道。Geb2
hardt (2001) 认为 , 复等位位点可能对抗病程度产生影响 , 只有那些极端的复等位位点才可能表现
出抗病或感病 , 这使水平抗性的遗传机制变得更为复杂 , 它不仅受不同位点的多基因控制 , 同时还受
复等位基因影响。
本研究还显示 , 在所选 QTL标记的检测中 , 表现出含有多个 QTL位点的组合 , 其群体的抗晚疫
病性有增强的趋势。对于单个基因型而言 , 含有主效 QTL位点的个体大多表现抗病。这一现象表明 ,
如果选择含有较多 QTL位点的亲本进行杂交 , 然后根据主效 QTL位点在后代中进行辅助选择 , 有可
能实现 QTL标记在马铃薯晚疫病水平抗性育种中的应用。
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