全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 677 - 682
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 31; 修回日期 : 2007 - 04 - 18
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471191) ; 山东省良种产业化项目 ; 山东农业大学博士基金项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yuxiyan@ sdau1edu1cn)
甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化
樊继德 1 , 何启伟 2 , 王秀峰 1 , 于喜艳 13
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2 山东省农业科学院蔬菜所 ,
济南 250100)
摘 　要 : 利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系 ‘0123’果实 , 应用 PCR和
Southern B lot对后代进行分子鉴定。结果表明 , 330株甜瓜转化植株中 , 有 2株为阳性转基因植株 , 转化率
约为 016%。进一步研究发现 , T0代转基因甜瓜植株生长势减弱 , 果实比对照小 30%左右 , 但可溶性糖含
量比对照提高了 52%。PCR和 PCR - Southern B lot鉴定表明 , T0 21的自交后代没有基因丢失 , 反义酸性转
化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱 , 但成熟果实可溶性总糖含量提
高了 26% , 蔗糖含量比对照提高了 215倍 , 果糖和葡萄糖含量略有降低 , 酸性转化酶活性比对照明显降
低。这些结果表明 , 反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性 , 调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程 , 改变
了甜瓜果实糖分组成 , 同时抑制了植株生长。
关键词 : 甜瓜 ; 转基因 ; PCR; 酸性转化酶
中图分类号 : S 652　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320677206
An tisen se Ac id Inverta se ( an ti2M A I1) Gene A lters Soluble Sugar Com posi2
tion and S ize in Tran sgen ic M uskm elon Fru it
FAN J i2de1 , HE Q i2wei2 , WANG Xiu2feng1 , and YU Xi2yan13
(1 College of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, S ta te Key Laboratory of C rop B iology,
Ta ipian, Shandong 271018, China; 2 Shandong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, J ipinan 250100, Ch ina)
Abstract: Anti2MA I1 gene was translated into melon fruits by ovary injection. PCR amp lification and
Southern B lot analysis showed that two transgenic p lants were obtained from 330 melon p lants, transformation
frequency was about 016% , and each transgenic p lant had double cop ies of anti2MA I1 gene. The T0 genera2
tion transgenic melon p lants had lower growth ability, and the fruits were 30% smaller than control fruits, but
had 52% more soluble sugar than control fruits. There was no gene lost in T0 21 p rogeny with the analysis of
PCR and PCR - Southern blot. A lso, transgenic p lants of T1 generation had weaker growth ability than control
p lants. Each T1 generation transgenic fruit had higher soluble sugar and sucrose concentrations but had lower
levels of acid invertase in ripe fruit than control fruits. These results suggest that acid invertase control sugar
composition in melon fruit and this change in composition contributes to alterations in fruit size and p lants
growth ability.
Key words: Melon; Transgenic; PCR; Acid invertase
甜瓜 (Cucum is m elo L. ) 的品质主要决定于可溶性糖的含量和种类。成熟甜瓜中大于 97%的可
溶性固形物是可溶性糖 , 其中蔗糖占 60%左右 (索滨华 等 , 1997)。因此 , 蔗糖含量是甜瓜果实品
质的重要指标之一。甜瓜果实发育过程中蔗糖代谢机理一直受到人们的关注 , 国内外许多学者进行了
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
这方面的研究 (Hubbard et al. , 1989; 张明方 等 , 1998; Hayata et al. , 2001)。果实中蔗糖代谢关
键酶主要是转化酶 ( Invertase, Ivr)、蔗糖合成酶 ( Sucrose synthase, SS) 和蔗糖磷酸合成酶 ( Sucrose
phosphate synthase, SPS)。转化酶为分解蔗糖的酶 , 根据其最适 pH值 , 分为酸性转化酶 (Acid invert2
ase, A I)、中性或碱性转化酶 (Neutral invertase, N I)。在甜瓜成熟过程中 , 蔗糖具有明显的积累转折
点 (张明方 等 , 1998) , 且酸性转化酶活性的降低是引起蔗糖积累的关键因子之一 (Hayata et al. ,
2001; Lester et al. , 2001)。随着分子生物学的发展 , 现在已经从许多高等植物中克隆到酸性转化酶基
因 (W ang et al. , 2005; Yamada et al. , 2006) , 于喜艳等 (2003) 最先克隆到甜瓜果实酸性转化酶基
因片段。本研究构建了此基因的反义表达载体 ( anti2MA I1) , 并通过子房注射法对甜瓜进行遗传转化
研究 , 获得了稳定遗传的转反义酸性转化酶基因的甜瓜新种质。
1　材料与方法
111　材料及试剂
供试材料为自交系 ‘0123’厚皮甜瓜 , 反义酸性转化酶基因表达载体 ( anti2MA I1) 由本实验室
构建 , 表达载体由 PB I121改建而成 (切除 Gus基因和引入 X baⅠ等酶切位点 ) , 结构见图 1。田间试
验在山东农业大学蔬菜站日光温室中进行 , 播种及定植后的栽培管理同生产。
图 1　反义 MA I1基因表达载体结构图
F ig. 1　The structure of vector expression an ti2MA I1 gene
Taq DNA聚合酶为大连宝生物工程公司产品 ; CTAB, β - 巯基乙醇购自上海生工生物工程有限
公司 ; 地高辛标记检测试剂盒购自罗氏公司。尼龙膜 (Hybond2N + ) 购自 Amersham公司。
112　子房注射的转化方法
上午 9时左右对甜瓜进行自交授粉 , 挂牌标记 , 次日上午 9时左右进行子房注射 , 微量注射器用
70%酒精消毒后 , 吸入 anti2MA I1质粒 DNA溶液 , 将针头伸入子房 3～4 mm , 每个子房注射 210μL,
含有约 2μg DNA。对照注射同等量空载体质粒 DNA。
113　PCR和 Southern Blot筛选鉴定阳性植株
CTAB法提取叶片基因组 DNA , 根据反义载体上 35S启动子和 NOS终止子序列设计上游引物 :
5′2ACG CAC AAT CCC ACT ATC CTT 23′; 下游引物 : 5′2GAC CGG CAA CAG GAT TCA AT23′, PCR反
应条件为 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 1 m in, 50℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 31个循环 ; 72℃延
伸 10 m in。以 35S启动子基因片段作为探针 , 按照地高辛标记检测试剂盒说明书进行探针合成及检
测 , 取基因组 DNA 10μL (115μg /μL) , 经 H indⅢ酶切过夜 , 40 V电压 , 110%琼脂糖凝胶电泳分离
8 h, 碱变性后转膜 , 方法参照 Sambrook等 (1989) 的分子克隆。120℃烘膜 015 h以固定 DNA。杂
交操作严格按照地高辛标记检测试剂盒说明书的要求进行。
114　T0代转基因植株生长势及单瓜质量和可溶性糖含量测定
将 PCR和 Southern B lot鉴定呈阳性的两株转基因植株定植到山东农业大学蔬菜站日光温室 , 严
格控制自交授粉。测量植株生长势指标 (株高和茎粗 ) , 手持测糖仪测定成熟果实可溶性糖含量。
115　T1代转基因甜瓜果实各单糖含量和酸性转化酶活性测定
将收获的可溶性糖含量较高的 T0 21种子播种 , 苗期进行 PCR和 PCR - Southern B lot鉴定 , 将阳
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　3期 樊继德等 : 甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化 　
性植株苗定植于山东农业大学日光温室 , 田间管理同生产。随机选取 10株 , 测量植株生长势指标
(株高和茎粗 )、单瓜质量和可溶性糖。分别取授粉后 5、10、15、20、25 d和成熟的 T1代果实 , 每时
期随机选取 3个果实 , 切取不同部位果肉 , 均浆后 , 称取 1 g样品 , 试验共设 3次重复 , 糖的提取参
照陈美霞 (2005) 的方法 , 采用美国 Beckman P /ACE高效毛细管电泳仪测定果糖、葡萄糖、蔗糖含
量。色谱条件 : 未涂层石英毛细管 (50μm ×57 cm ) , 有效长度 50 cm, 缓冲液为 10 mmol/L苯甲酸
钠 + 015 mmol/L CTAB, pH 12, 电压 20 kV, 压力进样 3 s, 负极进样 , 温度 22℃, 214 nm间接检
测。酸性转化酶的提取和活性测定参考 Natalie等 (1989) 的方法 , 试验设计同糖的测定。
2　结果与分析
211　转基因植株的筛选
将 330株甜瓜幼苗每 10株为一组 , 分为 33组 , 对每一组的 10株幼苗混合叶片提取 DNA进行
PCR鉴定 , 结果只有两组扩增到了 1 kb的目的带 (图 2, 泳道 1和 5) ; 分别对这两组的每一株叶片
提取 DNA, 进行 PCR鉴定 , 结果在每一组中分别鉴定出一株转化植株 (图 2)。对 PCR检测阳性植
株进行 Southern B lot检测 , 发现 PCR检测呈阳性的植株均有杂交信号 , 非转基因植株无杂交信号 ,
且该基因在转基因植株中有两个拷贝 (图 3, 泳道 3和 4) , 说明 anti2MA I1基因已经整合到自交系
‘0123’甜瓜基因组 DNA中 , 这也说明 PCR可用于本试验中阳性植株的鉴定。根据转化植株占测试
植株的百分率 , 得出本研究中子房注射法 anti2MA I1对甜瓜的转化率约为 016%。
图 2　 PCR鉴定结果
1～10: 供试植株 ; 11: 未转基因植株 ; 12: 阳性对照 ;
M: Marker DL 2000。
F ig. 2　The iden tif ica tion result by PCR
1 - 10: Plants for identification; 11: Non2transgenic p lant;
12: Positive control; M: Marker DL 2000.
图 3　Southern Blot鉴定结果
1: 阳性对照 ; 2: 未转基因植株 ;
3, 4: 供试植株。
F ig. 3　The iden tif ica tion result by Southern Blot
1: Positive control; 2: Non2transgenic p lant;
3, 4: Plants for identification.
212　T0代转基因植株生长势及单瓜质量和可溶性糖含量
将鉴定出的两株转基因植株分别命名为 T0 21和 T0 22。对植株生长发育过程中的株高、茎粗性状
进行调查研究 , T0代转基因植株在株高方面略比对照弱 , 但茎粗显著弱于对照。总体来说 , 转基因植
株的生长势与对照相比明显变弱。转基因甜瓜果实变小 , T0 21单瓜质量仅为对照的 76% , T0 22单瓜
质量为对照的 85% , 但果实的可溶性糖含量明显提高 , T0 21比对照提高 52% , T0 22比对照提高
35%。
213　PCR和 PCR - Southern Blot鉴定 T1代转基因植株
选含糖量高的 T0 21转基因植株继续进行 T1代研究。对 T0 21进行人工授粉 , 严格控制自交。将收
获种子播种于日光温室 , 共得到成苗 51株 , 分别提取 DNA进行 PCR和 PCR - Southern B lot鉴定 , 结
果都为阳性植株 (图 4和图 5)。这说明 anti2MA I1基因已经在 T0 21自交后代中稳定遗传。
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图 4　 PCR鉴定结果
1～9: 供试植株 ; 10: 未转基因植株 ;
11: 阳性对照 ; M: Marker DL 2000。
F ig. 4　The iden tif ica tion result by PCR
1 - 9: Plants for identification; 10: Non2transgenic p lant;
11: Positive control; M: Marker DL 2000.
图 5　 PCR - Southern Blot鉴定结果
1～9: 供试植株 ; 10: 未转基因植株 ;
11: 阳性对照 ; M: Marker DL 2000。
F ig. 5　The iden tif ica tion result by PCR - Southern Blot
1 - 9: Plants for identification; 10: Non2transgenic p lant;
11: Positive control; M: Marker DL 2000.
214　T1代转基因植株生长势及单瓜质量和可溶性糖含量
　　随机选取 10株 T1代转基因植株 , 测量植株生
长势指标 (株高和茎粗 ) 和单瓜质量。结果表明 ,
T1代转基因植株生长势与对照相比更为明显的受到
抑制 , 不仅茎粗明显弱于对照 , 而且在植株发育的
中、后期 , 株高也表现出明显的矮于对照植株 (图
6)。单瓜质量和可溶性糖含量的测定结果表明 , T1
代转基因植株的单瓜质量仅为对照的 66% , 可溶
性糖含量比对照提高了 25% (表 1)。
表 1　T1 代转基因甜瓜平均单瓜质量和可溶性糖含量
Table 1　The average ma ss of per fru it and
soluble sugar con ten t of T1 genera tion tran sgen ic
处理
Treatment
平均单瓜质量
Average mass
of per fruit( g)
平均可溶性糖含量
Average soluble
sugar content( % )
对照 Control 75515 ±50 1116 ±0192
T1 49615 ±60 1415 ±112
图 6　T1 代转基因甜瓜生长势分析
F ig. 6　The growth v igor ana lysis of T1 genera tion of tran sgen ic plan ts
215　T1代转基因甜瓜果实单糖含量及酸性转化酶活性分析
转基因和对照果实具有相近的果糖、葡萄糖和蔗糖积累模式 (图 7) , 发育初期的果实中可溶性
糖主要是果糖和葡萄糖 , 蔗糖含量相对较低 , 授粉后 20 d的果实中蔗糖开始迅速积累 , 而果糖和葡
萄糖随果实成熟呈下降趋势 ; 转基因果实各发育时期果糖和葡萄糖含量均比对照低 , 蔗糖含量为对照
的 114～315倍 ( P≤0101)。说明转入的 anti2MA I1基因调控了甜瓜果实发育过程中的糖分组成。
由图 7还可以看出 , 转基因和对照果实酸性转化酶活性也具有相似的变化趋势 , 都是在果实发育
初期呈上升趋势 , 授粉后 10 d达到最高值 , 对照 27μmol·h - 1 ·g- 1 FM , T1代转基因植株为 16168
μmol·h - 1 ·g- 1 FM , 之后酶活性呈直线下降趋势 , 在成熟果实中几乎检测不到酶活性。说明转入的
anti2MA I1基因并没有改变果实发育过程中酸性转化酶原有的变化趋势 , 而是在果实发育过程中不同
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　3期 樊继德等 : 甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化 　
程度的降低了酶活性水平 , 导致转基因果实具有相对较强的蔗糖积累能力 , 在果实发育初期蔗糖含量
为对照的 219～315倍 (5～15 DAP, P≤0101) , 成熟果实含量为对照的 114倍 ( P≤0101)。这说明
酸性转化酶活性的下降与蔗糖积累有着密切的关系。在授粉后 15 d酸性转化酶活性迅速下降 , 授粉
后 20 d时活性下降至检测水平下 , 伴随蔗糖开始迅速积累 , 进一步说明酸性转化酶活性的下降是蔗
糖积累的必要前提和关键因素。
图 7　 T1 代转基因甜瓜果实发育各时期果糖、葡萄糖、蔗糖含量和酸性转化酶活性
F ig. 7　The fructose, glucose, sucrose con ten t and ac id inverta se activ ity dur ing
m elon fru its developm en t of T1 genera tion of tran sgen ic plan ts
3　讨论
311　子房注射法在转基因甜瓜上的应用
子房注射法是对整体植株的早期胚细胞转化 DNA , 无需进行细胞或原生质体的组织培养 , 可在
田间或温室进行 , 比花粉管通道或农杆菌介导遗传转化等更简单 , 在进行子房注射时 , 要尽量减少污
染和对子房的伤害 , 避免引起化瓜。甜瓜虽属双子叶植物 , 但其组培再生能力差 , 利用农杆菌介导法
进行基因转化相当困难 , 且成本比较高 , 转化率也很低 (王慧中 等 , 2000)。本研究利用子房注射
法成功将反义酸性转化酶基因转入甜瓜 , 转化率为 016% , 低于李余良等 (2005) 的 919% , 这可能
与供试材料不同有关系。虽然这种转化方法后代鉴定的工作量很大 , 但转化方法简单、经济 , 转化率
也较高 , 对甜瓜来说 , 是切实可行的。
312　an ti2M A I1对植株生长势、果实糖含量和酸性转化酶活性的影响
研究表明 , 甜瓜中酸性转化酶活性的增强可为组织的快速生长提供作为碳源的己糖 ( Gao et al. ,
1999) , 在甜瓜快速膨大的幼嫩组织中 , 主要存在葡萄糖和果糖 , 这些组织中的转化酶活性通常很高
(L ingle & Dunlap , 1987)。本试验研究发现 , 转反义 anti2MA I1基因的植株明显比对照长势弱 , 且果实
变小 , 但果实的可溶性糖含量明显提高。转基因 T1代植株果糖和葡萄糖含量下降 , 但蔗糖含量提高
了 40% ～250% , 酸性转化酶活性有不同程度下降。本研究中的这些结果进一步验证了前人的结论 ,
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而且与 Klann等 (1996) 的研究结果相一致。Klann等 (1996) 将反义酸性转化酶基因转入番茄 , 发
现转基因植株有几个株系果实蔗糖含量增加 , 己糖含量减少 , 而且积累蔗糖的转基因植株的果实比对
照小 30%。Mccollum等 (1988) 认为 , 网纹甜瓜果实转化酶通过水解蔗糖成为葡萄糖和果糖 , 以保
持细胞的渗透压 , 因为在果实生长中 , 高渗透压保证水分的吸收。综上所述 , 酸性转化酶可通过调节
植株组织中己糖的含量调节植株的生长 , 本试验中 anti2MA I1基因抑制了酸性转化酶的活性 , 导致转
基因植株的酸性转化酶活性降低 , 低活性的酸性转化酶不能为植株和果实的快速生长提供充足己糖作
为碳源和维持细胞的高渗透压 , 引起植株生长势减弱 , 但果实发育期中低活性的酸性转化酶引起蔗糖
积累 , 这进一步说明酸性转化酶活性的下降是甜瓜果实蔗糖积累的必要前提和关键因素。
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