全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 155～157
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 07; 修回日期 : 2005 - 06 - 17
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2003AA207120)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
ISSR2PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜 SSR引物
崔秀敏 1 　侯喜林 13 　董玉秀 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2 山东农业大学生命科学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 分别利用 ISSR2PCR和链亲和素磁珠吸附法分离白菜基因组微卫星 , 共得到 41对 SSR引物。
ISSR2PCR法运用巢式 PCR, 分别设计微卫星两侧引物 IP2 和 IP3 , SSR引物得率为 12%。磁珠吸附法首先
利用生物素标记的 SSR探针与文库杂交 , 链亲和素磁珠吸附富集含 SSR的片段。然后用接头引物扩增 , 克
隆。根据测序结果 , 设计 SSR两侧引物 PL 和 PR , 引物得率为 916%。
关键词 : 白菜 ; 微卫星 ; ISSR2PCR; 链亲和素磁珠吸附 ; SSR引物
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120155203
SSR Pr im ers D evelopm en t in Non2head ing Ch inese Cabbage by ISSR2PCR
and Streptav id in2coa ted M agnetic Beads Adsorption
Cui Xium in1 , Hou Xilin13 , and Dong Yuxiu2
(1N ationa l Key L abora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing A gricu ltural U niversity, N an jing 210095,
China; 2 College of L ife Science, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian 271018, China)
Abstract: Two methods of ISSR2PCR and strep tavidin2coated magnetic beads adsorp tion were used to
isolate m icrosatellites from genom ic DNA of non2heading Chinese cabbage (B rassica cam pestris ssp. ch inensis)
and a total of 41 SSR p rimers were successfully developed in this study. SSR p rimers ( IP2 and IP3 ) were de2
signed on the base of the determ ined term inal sequence of nested PCR p roducts in the ISSR2PCR method with
the efficiency of 12% for SSR p rimer development. A s to the method of strep tavidin2coated magnetic beads ad2
sorp tion, firstly the biotin2labeled SSR p robe was hybridized with digested genom ic DNA and SSR fragments
were enriched by absorp tion with strepavidin2coated magnetic beads and then they were amp lified, cloned and
sequenced. On the base of the sequence flanking m icrosatellites SSR p rimers ( PL and PR ) were designed with
an efficiency of 916%.
Key words: Non2heading Chinese cabbage; M icrosatellite; ISSR2PCR; Strep tavidin2coated magnetic
beads adsorp tion; SSR p rimer
1　目的、材料与方法
微卫星 DNA又称简单重复序列 ( SSR, simp le sequence repeat) , 是一类由 1～6个碱基组成的串
联重复序列。不同物种核心序列重复次数变化较大 , 重复序列两侧多是相对保守的单拷贝序列 , 因此
可利用其两端保守序列设计引物 , 扩增基因组 DNA, 片段长度多态性可用作分子标记。微卫星标记
因具多态性丰富、重复性好、共显性等优点广泛应用于遗传图谱构建、种群遗传学、指纹分析、系统
发育等研究领域。
传统的微卫星分离需构建基因组文库 , 用人工合成放射性同位素或地高辛等标记的 SSR探针与
文库杂交 , 不仅要花费大量人力、财力 , 而且效率较低。1992年 O strander等〔1〕首次报道可通过微卫
星探针与 AFLP2DNA文库杂交富集包含 SSR的 DNA片段。2001年 L ian等〔2〕利用 ISSR2PCR ( ISSR,
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
即 inter2simp le sequence repeat) 在日本红松中成功分离了微卫星 DNA。最近利用链亲和素磁珠吸附法
分离微卫星的技术逐渐成熟〔3〕, 并相继在花生、林木上实现了高效分离。 ISSR2PCR和链亲和素磁珠
吸附法具有无需知道任何靶标序列、操作安全方便、检测快速等优点 , 目前还未见在白菜上应用的相
关报道。现利用 ISSR2PCR和链亲和素磁珠吸附法从白菜基因组中分离微卫星 DNA, 并对二者的效率
进行比较。
供试白菜品种 ‘暑绿 ’与 ‘寒笑 ’。取 4～5叶期新鲜叶片各 215 g左右 , 混合 , CTAB大量法提
取基因组 DNA。
ISSR2PCR法 : 37℃条件下 , EcoRⅤ酶切基因组 3～4 h, 至 DNA带型均匀弥散。70℃水浴灭酶
活 , NaAC和无水乙醇沉淀 , ddH2O回溶。利用 T4 DNA L igase将接头与酶切的基因组 DNA在 4℃下连
接过夜。接头由 1段 48 bp长链 ( P1: 5pi2GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGCGACGGCCCGGG
CTGGT23pi) (下划线序列为 AP1 , 黑斜体为 AP2 ) 和 1段 8 bp且 3pi端带有氨基的短链 (P2: 5pi2ACCAGC2
CC2NH2 23pi) 组成。以加接头序列的 DNA为模板 , 以 S1 : (AG) 10 +AP1 为引物进行 PCR扩增 , 115%琼
脂糖凝胶电泳检测。若带型弥散 , 则将 PCR产物与载体连接、转化。蓝白斑筛选并进行菌落 PCR鉴
定 , 同时设计 AP1单引物对照 , 115%琼脂糖凝胶电泳检测 , 选取介于 150～1 000 bp之间的阳性克
隆进行测序。
根据测序结果 , 在接头序列与 SSR间设计巢式 PCR引物 IP1 (27 bp) 和 IP2 (21 bp)。以加接头
序列的 DNA为模板 , 以 IP1 +AP1 为引物进行 1次 PCR。将 1次 PCR产物稀释 50倍作为反应模板 ,
以 IP2 +AP2 为引物进行再次 PCR。两次 PCR的复性温度均根据 IP1、 IP2 不同作适当调整。PCR产物
与 pMD182T载体连接 , 转化大肠杆菌 DH5α, 挑取阳性克隆进行测序。在 SSR与另一接头序列间设
计引物 IP3 (注意方向性 ) , IP2 和 IP3 即为开发的 SSR引物对。
链亲和素磁珠法 : 首先用 H ind Ⅲ和 B am H Ⅰ酶切基因组 DNA , 30℃ 3 h, 37℃ 3 h。双链接头
O ligoA +O ligoB , O ligoC +O ligoD分别配对 , 92℃ 1 m in, 60℃ 2 m in, 冷却至室温。T4 DNA ligase连
接双链接头与酶切 DNA, 预扩增。PCR产物 92℃变性 10 m in, 快速冷却到 0℃。然后与生物素标记
的 SSR探针结合 , 链亲和素磁珠富集含 SSR的单链 DNA。再以 O ligoA +O ligoD为引物扩增 , PCR产
物与载体连接 , 转化大肠杆菌 DH5α。以 O ligoA、O ligoD分别和 S1 组成两对引物进行菌落 PCR双重
鉴定 , 取片段大小有差异的克隆测序。根据微卫星侧翼序列设计引物 PL 和 PR , 若有明显扩增条带 ,
则为有效 SSR引物。
2　结果分析与讨论
211　基因组 D NA提取与酶切
图 1显示 , 利用 CTAB法大量提取白菜基因
组 DNA条带清晰 , RNA已除净 , 质量较好。 IS2
SR2PCR法用 EcoRⅤ单酶切基因组 DNA, 酶切片
段大部分介于 250～2 000 bp之间 , 而链亲和素磁
珠吸附法用 H ind Ⅲ和 B am H Ⅰ双酶切 , 酶切片段
主要在 100～1 500 bp间。图 2显示 , 基因组 DNA
单、双酶切产物弥散较均匀 , 表明酶切完全 , 可
用于下一步试验。
212　连接产物的 PCR扩增检测 图 1　CTAB法提取的基因组 D NAF ig. 1　Genom ic D NA isola ted by CTAB m ethodM: DNA marker; I - V: DNA rep licates.
　　酶切 DNA片段加上接头序列后 , 分别以 AP1 + S1 和接头序列引物 O ligoA + O ligoD进行 PCR扩
增。电泳结果如图 3所示 , 扩增产物呈均匀弥散状 , 表明两种方法中大小不同的 AFLP2DNA片段
均有扩增。
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　1期 崔秀敏等 : ISSR2PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜 SSR引物 　
213　连接产物的克隆、转化及 SSR引物的设计
21311　 ISSR2PCR法 　将 212的 ISSR2PCR产物转化大肠杆菌 DH5α, 得到 500多个阳性克隆。随机选
取 250个以 AP1 + S1 为引物进行菌落 PCR鉴定 , 同时以 AP1设计单引物对照 , 85%的阳性克隆为双
引物带。挑取其中 200个阳性克隆测序。结果表明 , 除少数序列中 AP2 与 (AG) n间距离太近难以
设计引物外 , 146个克隆可在 AP2 与 (AG) n间设计引物 IP1、 IP2。
以 IP1 +AP1 和 IP2 +AP2 两对引物进行巢式 PCR, 54对 (37% ) 引物有扩增且为双引物带。将
其 PCR产物克隆、测序。结果表明 , 50个序列 ( 92% ) 含有 SSR序列 , 其中 29个 (58% ) 可以设
计另一侧引物。在 SSR与接头序列间设计另一侧引物 IP3 , 以基因组 DNA为模板 , 以 IP2 和 IP3 为引
物扩增 , 25对 (86% ) 可以得到双引物的扩增条带 , 则 IP2 + IP3 即为开发的 SSR引物对。加上测序
结果中包含的 SSR。本试验共得到 30对有效 SSR引物 , 开发效率为 12%。
ISSR2PCR用 PCR扩增、DNA克隆等技术 , 方法简单 , 但它的假阳性率很高。本试验中省略回收
PCR产物步骤 , 通过菌落 PCR双重鉴定 , 并设置单引物对照 , 可以提高产率 , 显著降低重复克隆和
无效克隆。 ISSR2PCR法的缺陷在于 : 需要 2～3次克隆、测序 , 对没有测序仪的实验室则开发成本较
高 ; 另外 , 若微卫星 DNA重复次数太多 , 容易出现部分碱基难以识别的现象 , 导致测序中断。
21312　链亲和素磁珠吸附法 　将 212链亲和素磁珠吸附法的 PCR产物转化大肠杆菌 , 蓝白斑筛选
后 , 共得到 104个阳性克隆 , 双重菌落 PCR鉴定 , 仅 24个有明显扩增产物。测序结果表明 , 24个克
隆中均包含 SSR, 除去某些 SSR距酶切位点太近 , 难以设计引物外 , 根据序列本身特点 , 共设计 14
对引物 PL 和 PR。以基因组 DNA为模板扩增 , 其中仅 10对有明显扩增 , 开发效率为 916%。
链亲素磁珠吸附法只需要 1次克隆、测序 , 成本相对较低 , 但 SSC洗脱过程对试验条件及技术要
求较高。通过对阳性克隆进行菌落 PCR双重鉴定 , 可大大降低无效克隆测序。整个过程操作简单 ,
消耗少 , 可作为从植物中分离 SSR的一种简单有效方法。
参考文献 :
1　O strander E A, Jong P M, R ine J, Duyk G. Construction of small2insert genom ic DNA libraries highly enriched for m icrosatellite repeat se2
quences. PNAS, 1992, 89: 3419～3423
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peat. Journal Plant Research, 2001, 114: 381～385
3　Gao G Q, He G H, L I Y R. M icrosatellites enrichment from AFLP2fragments by magnetic beads. Acta Botanica Sinica, 2003, 45 ( 11) :
1266～1269
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