全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 885 - 890
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 02 - 27; 修回日期 : 2008 - 04 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671319)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: huangsanwen@caas1net1cn)
马铃薯抗晚疫病主效基因 R10的 RGA2CAPS标记
的开发
王加加 1, 2 , 徐建飞 2 , 李　颖 2 , 王凤义 1 , 黄三文 23
(1 东北农业大学农学院 , 哈尔滨 150030; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 马铃薯晚疫病抗性基因 R10, 属于马铃薯抗晚疫病主效位点 MLB单倍型之一 , 该位点已知的
各单倍型基因均具有保守结构域 , 属于同一个 R3a基因家族。将 R3a基因和源于 MLB位点的 R3a基因的
同源序列进行比对 , 根据它们高度保守的区域设计引物 , 以马铃薯晚疫病鉴别寄主 MaR10 (含抗晚疫病基
因 R10)、四倍体马铃薯栽培种 Katahdin (不含已知抗病基因 ) 及其杂交一代为试材 , 得到 R3a的抗病基因
同源序列 , 再结合限制性内切酶筛选 , 开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因 R10连锁的两个 RGA2CAPS标
记 : RGA2600和 RGA21000, 这两个标记距离 R10基因 0125 cM。
关键词 : 马铃薯 ; 晚疫病 ; R10基因 ; RGA2CAPS标记
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620885206
D evelop ing of RGA2CAPS M arkers for Resistan t Gene R10 to Pota to La te
Blight
WANG J ia2jia1, 2 , XU J ian2fei2 , L I Ying2 , WANG Feng2yi1 , and HUANG San2wen23
(1 College of A gricu lture, N ortheast A gricultural U niversity, Harbin 150030, China; 2 Institu te of V egetable and Flow ers, Chinese
A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: R10 gene conferring resistance to potato (Solanum tuberosum L. ) late blight is one of hap lo2
types in major late blight (MLB ) resistance comp lex. Based on sequence analysis for resistant genes known in
this comp lex, itpis indicated that these hap lotypes have conserved domains and belong to R3a gene fam ily. So
twelve p rimer combinations were designed based on the conserved sequences of R3a gene and its homologs de2
rived from MLB and were used to identify resistance gene analogs (RGA ) closely linked to the R10 gene. The
conserved p rimers combinations were screened by a population of the R10 differential (MaR10) and the sus2
cep tible potato (Solanum tuberosum L. ) cultivar Katahdin. The PCR p roducts then were digested with twelve
restriction enzymes and were assessed for polymorphism by bulk segregant analysis. The RGA2CAPS marker
RGA2600 and RGA21000 linked 0125 cM to the R10 gene, were developed and made base for the cloning of
R10 gene.
Key words: potato; late blight; R10 gene; RGA2CAPS marker
克隆马铃薯 (S olanum tuberosum L. ) 抗晚疫病基因 , 构建田间抗晚疫病基因多态性是实现高效、
持久的防治马铃薯晚疫病工作的一项重要策略 (徐建飞 等 , 2006)。目前已有 4个马铃薯抗晚疫病基
因被成功克隆 (Ballvora et al. , 2002; Song et al. , 2003; Huang et al. , 2005; van der Vossen et al. ,
2003, 2005)。这些抗病基因具有较高的序列一致性 , 蛋白产物往往也具有相似的结构域 , 如核苷酸
结合位点 ( nucleotide binding site, NBS) , 富含亮氨酸重复 ( leucine2rich repeats, LRR ) , 卷曲螺旋
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( coiled2coil domain, CC) 等。这些结构域在植物对病原物的识别、诱导抗病反应及信号传导等过程中
起到非常重要的作用 (Dangl & Jones, 2001)。
从马铃薯野生种 S. dem issum 导入到栽培种中的 11个主效基因 (R1～R11) 中有 8个基因 ( R3,
R5～R11 ) 来自于同一个等位多态性非常高的染色体区域 , 即马铃薯抗晚疫病主效位点 MLB (major
late blight resistance comp lex) (Huang, 2005)。该位点和番茄的抗枯萎病位点 I2同源 , 两者都位于第
11号染色体上 , 且都是复合抗病基因位点 , 因此 R3、R5～R11被称为 MLB的单倍型 ( hap lotypes) ,
而非经典意义上的等位基因 ( alleles)。通过进一步的分子标记分析和对 MLB的 10余个细菌人工染色
体 ( bacterial artificial chromosome, BAC) 的测序了解到 MLB的单倍型之间具有很大相似性 , 都是
R3a的同源基因。
基于以上两点 , 作者通过设计保守引物来获得与 R10基因连锁的 R3a基因家族的抗病基因同源
序列 ( resistance gene analogs, RGA s) , 通过限制性内切酶酶切筛选 , 构建出两个 RGA2CAPS标记 :
RGA2600和 RGA21000。这将有助于 R10基因的遗传定位 , 为进一步克隆 R10基因奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
供试材料为四倍体马铃薯 MaR10、Katahdin及其杂交一代分离群体。亲本由中国农业科学院蔬菜
花卉研究所马铃薯研究室提供 , 其中 MaR10含有马铃薯抗晚疫病基因 R10, 基因型为 R10 r10 r10 r10
(Muller & B lack, 1952; Malcolm son & B lack, 1966; Malcolm son, 1969) , Katahdin不含已知抗晚疫病基
因 , 基因型为 r10 r10 r10 r10 , 简称 Kat (徐建飞 等 , 2007)。
将 MaR10和 Kat杂交获得的 410粒种子播种于 MS培养基中 , 25 ℃, 16 h (光 ) /8 h (暗 ) 条件
培养 , 扩繁后定植于营养钵中 , 并置于温室中培养。最终获得包含 400个单株的杂交一代分离群体 ,
用于遗传分析和接种鉴定。
晚疫病菌株 8914829 (0号小种 ) 由荷兰 W ageningen大学的 Francine Govers博士提供。晚疫病菌
株于液氮中保存。
112　D NA提取
采取试管苗叶片 , 利用 CTAB 法 ( Jones &
W alker, 1963) 结合高通量的 Retsch 细胞破碎仪
(RETSCH INC, Haan, Germany) 和 96孔 COSTAR
深孔板 (CORN ING INC, New York) 进行 DNA快
速提取。提取的 DNA溶于 TE中于 - 20 ℃保存。
113　引物设计
依据马铃薯抗晚疫病基因 R3a及其同源家族
基因的序列信息比对结果 , 利用 Primer510软件
在它们高度保守的区域分别设计 4个上游引物和
3个下游引物 (表 1)。引物均由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。将设计的保守引物自
由组合成 12对引物组合。
表 1　保守引物序列
Table 1　Sequence of con served pr im ers
引物名称
Name
引物序列
Primer sequence (5′- 3′)
引物
长度 / bp
Length
保守区域
Conseved
regions
R3a21F ATGGAGATTGGCTTAGCAGTTGG 23 CC
R3a22F TTAGCAGTTGGTGGTGCATTTCT 23 CC
R3a23F GTTGGTGGTGCATTTCTCTCTTCAG 25 CC
R3a24F ATGTTCTCTTTGATAGGCTTGCTCC 25 CC
R3a21R GCTTCCCTTCTATCAACCACATTTT 25 NBS
R3a22R CAGCTTCCCTTCTATCAACCACATT 25 NBS
R3a23R AAGGRAGTTGTCCTAGTGCTGGC 23 NBS
　　注 : F: 上游引物 ; R: 下游引物。
Note: F: Forward p rimer; R: Reverse p rimer.
114　分离群体分组分析法
根据杂交一代分离群体的接种结果构建抗病池和感病池。抗病池由表现明显过敏反应的 20个单
株组成 , 感病池由表现最明显孢子化病斑的 20个单株组成。两池的 DNA均由各单株 DNA等量混合
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组成 (徐建飞 等 , 2007)。如果某个标记在抗病亲本和抗病池中具有条带 , 而在感病亲本和感病池中
缺失条带 , 便推断该标记与目的基因连锁 , 进而进行分离群体验证。
115　PCR扩增
PCR扩增体系为 : 20μL反应体系中含 10 ng·μL - 1 DNA模板 115μL, 5 pmol·μL - 1上游 p rimer
110μL, 5 pmol·μL - 1下游 p rimer 110μL, 2 mmol·L - 1 dNTPs 210μL, 10 ×PCR buffer 210μL, Taq
DNA聚合酶 (215 U·μL - 1 ) 014μL, ddH2 O 1211μL。Taq DNA聚合酶为 Tiangen公司产品。
反应程序 : 95 ℃, 5 m in; 94 ℃, 30 s; 退火 , 1 m in; 72 ℃, 2 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 m in。
116　酶切反应
选取的限制性内切酶有 : EcoR Ⅰ、HpyCH4 Ⅳ、H if Ⅰ、Hha Ⅰ、H ind Ⅲ、D ra Ⅰ、Sau96 Ⅰ、
HpyCH4 Ⅴ、XhoⅠ、A vaⅡ、Hpy188Ⅰ和 H incⅡ, 均为 NEB公司产品。
15μL反应体系中包含 PCR扩增产物 610μL, 10 ×buffer 115μL, 限制性内切酶 1 U , 用 ddH2 O
补足体积。在酶最适温度下保温 2～3 h后加入 loading buffer终止反应 , 用 2 %琼脂糖凝胶在 5 V·
cm
- 1电压条件下电泳 1 h, 溴化乙锭染色 , B io2RAD凝胶成像系统显示。
117　晚疫病菌活化及抗性鉴定
于黑麦培养基上活化晚疫病菌 , 活化的菌株在霉菌培养箱中 16 ℃黑暗培养 7～14 d, 待菌丝长满
培养皿时加适量无菌水 , 于 4 ℃诱导游动孢子 3～6 h, 利用血球计数器统计游动孢子数量并稀释到接
种浓度 , 准备接种。
抗性鉴定采取离体叶片接种法 (V leeshouwers et al. , 1999 )。接种的游动孢子浓度为 5 ×104
spores·mL - 1 , 在叶片背面主叶脉两侧各接种 1滴 , 每滴 10μL。接种叶片插于岩棉上 , 置于接种盒 ,
密闭保湿。将接种盒放入人工气候箱 , 16 ℃、16 h (光 ) /8 h (暗 ) 条件诱导发病。接种 6 d后统计
发病情况。
抗性分级采用 van der Lee等 (2001) 方法 , 从最明显感病的孢子化病斑到最明显抗病的原位坏
死 , 过敏反应分别记为 1～5级。
118　连锁性分析
利用 JoinMap310软件对杂交一代分离群体重组单株分子标记和晚疫病接种结果进行连锁分析。
2　结果与分析
211　引物筛选
用 12对引物组合分别对两亲本 MaR10和 Kat进行扩增 , 均扩增出 2 400 bp的主带。选择其中具
有代表性的 3对引物组合 (R3a22F + R3a21R, R3a23F + R3a23R, R3a24F + R3a23R) 分别以 MaR10、
Kat、抗病池和感病池的 DNA为模板进行扩增。结果表明 , 引物组合 R3a23F + R3a23R (退火 : 63
℃) 除扩增出 2 400 bp的主带外 , 还扩增出 1 400 bp和 600 bp的条带 , 而其他引物没有扩增出这两
条带。鉴于该引物组合扩增出的条带数多、一致性好、重复性高和酶切时产生多态性的几率较高等原
因 , 选择该引物组合来扩增 R3a基因的抗病基因同源序列 (RGA ) (图 1) , 以进一步构建 RGA2CAPS
标记。
212　RGA2CAPS标记的开发
用引物组合 R3a23F + R3a23R, 以 MaR10、Kat、抗病池和感病池的 DNA为模板进行 PCR扩增 ,
对其扩增产物进行限制性内切酶酶切 , 构建 Cap s标记。结果表明 : HpyCH4 Ⅳ酶切时 , 在抗病亲本
(MaR10) 和抗病池中能够切出约 600 bp的条带 , 而感病亲本 ( Kat) 和感病池的酶切产物中没有此
条带 ; 用 AvaⅡ酶切时 , 在抗病亲本 (MaR10) 和抗病池中能够切出约 1 000 bp的条带 , 而感病亲本
( Kat) 和感病池的酶切产物中没有此条带 , 符合分离群体分组分析。所以将这两个限制性内切酶酶
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切的特异片段构建成 CAPS标记 , 分别记为 RGA2600和 RGA21000 (图 2)。
图 1　引物组合 ( R3a23F + R3a23R) 的 PCR扩增
MaR10: 抗性亲本 ; Kat: 感性亲本 ; RB: 抗病池 ; SB: 感病池。
F ig. 1　The PCR of pr im er ( R3a23F + R3a23R)
MaR10: Resistant p lant; Kat: Suscep tible p lant;
RB: Resistant bulk; SB: Suscep tible bulk.
图 2　RGA2600 ( H pyCH4 Ⅳ) 和 RGA21000 ( A vaⅡ) 标记
MaR10: 抗性亲本 ; Kat: 感性亲本 ; RB: 抗病池 ; SB: 感病池。
F ig. 2　RGA2600 ( H pyCH4 Ⅳ) and RGA21000 ( A vaⅡ)
MaR10: Resistant p lant; Kat: Suscep tible p lant;
RB: Resistant bulk; SB: Suscep tible bulk.
213　RGA2CAPS标记的定位
根据本实验室前期对 R10基因低分辨率遗传图谱构建的研究可知 : R10基因的两侧标记分别为
cLET5E4和 C2_A t5g59960 (徐建飞 等 , 2007) , 遗传距离分别为 612 cM和 116 cM。用这两个标记分
析 MaR10 ×Kat杂交后代 400个单株的杂交一代分离群体 , 从中筛选出在 cLET5E4和 C2_A t5g59960
之间发生重组的 20个单株 , 然后用新构建的 CAPS标记 RGA2600和 RGA21000进行分析 (图 3) , 发
现 20个单株中有 8个与抗性亲本一致 , 扩增出特异性条带 , 12个单株与感性亲本一致 , 未扩增特异
性条带 , 两个标记之间没有发生重组的单株。
图 3　RGA2600 ( H pyCH4 Ⅳ) 和 RGA21000 ( A vaⅡ) 标记在 M aR10和 Ka t杂交后代 F1 的重组单株中的验证
RB: 抗病池 ; SB: 感病池 ; 1～20: MaR10 ×Kat后代中在 cLET5E4与 C2_A t5g59960之间的 20个重组单株。
F ig. 3　Screen ing of RGA2600 ( H pyCH4 Ⅳ) and RGA21000 ( A vaⅡ) in the recom b inan ts of F1 plan ts
RB: Resistant bulk; SB: Suscep tible bulk; 1 - 20: The recombinants of MaR10 ×Kat
between cLET5E4 and C2_A t5g59960.
214　接种鉴定
根据徐建飞等 (2007) 对 R10基因遗传定位的研究结果 , 晚疫病菌株 8914829与抗性亲本 MaR10
产生 HR反应 , 与感病亲本 Kat产生感病反应。因此 , 可以认为与 8914829产生 HR反应的单株具有
R10基因。用晚疫病菌株 8914829接种在 cLET5E4和 C2_A t5g59960这两个标记间发生重组的 20个单
株。其中 , 产生明显 HR反应的有 9株 , 有明显孢子化病斑的 11株 , 20个单株中只有 1株 (JF20062
17) 在这两个 RGA2CAPS标记与 R10基因之间发生了重组 (图 4)。
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图 4　杂交亲本及其后代的 20个重组单株对晚疫病菌株 8914829的接种反应
1～20: 重组单株 ; MaR10表现过敏反应 (HR) , Kat表现感病反应 ( S) ;
17: RGA2CAPS标记与 R10基因之间发生重组的单株 , 其后代中的重组单株表现明显的抗感分离。
F ig. 4　Phenotype of d ifferen tia l resistance reaction to P. infestans isola tes 8914829 on paren ts
and recom b inan ts of the ir progeny
1 - 20. The recombinants; MaR10 showed hypersensitive response (HR) , and Kat is
suscep tible as shown by sporulating lesion ( S) ; 17: Obvious resistance segregation to the isolate was
showed in the recombinants of RGA2CAPS markers and R10 gene.
215　连锁图的构建
　　如图 5所示 , RGA2600和 RGA21000与 R10
基因的遗传距离为 0125 cM , 较之以前标记 , 离
R10基因更近一步。由于在此位点上这两个标记
未发生重组 , 导致 RGA2600和 RGA21000位于同
一遗传位置。
3　讨论
马铃薯遗传背景复杂 , 基因组测序尚未完
成 , 其标记开发较为困难。现有的马铃薯标记
多数为 RFLP、AFLP标记 , 而 SSR、 CAPS标记
图 5　RGA2600、RGA21000与 R10基因的连锁图
F ig. 5　Genetic map of R10, RGA2600 and RGA21000
相对较少 , 且大多数标记都是以二倍体马铃薯为研究对象 (宋吉轩 等 , 2006)。四倍体马铃薯相对
于二倍体马铃薯而言 , 遗传背景更为复杂 , 这就使得有些标记在四倍体马铃薯中的应用受到限制。本
研究是根据 R3a和源于 MLB位点的 R3a同源序列的保守区域设计引物 , 从四倍体马铃薯中克隆出
R3a基因的 RGA, 进而构建出与 R10基因连锁的标记 , 丰富了四倍体马铃薯的分子标记 , 为今后直
接从四倍体马铃薯中克隆抗晚疫病基因奠定基础。
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需要指出的是 , 这两个 RGA2CAPS标记尚未分开 , 产生这种现象的原因可能是由于分离群体不
够大 , 没有在这两个标记间发生重组的单株 , 还可能是这两个标记本身属于一个标记 , 而在染色体区
段上发生了重叠 , 所以可以通过扩大分离群体数量的方法来验证。如果 RGA包含 R10基因 , 那么开
发的标记应与 R10基因共分离。但本研究的两个 RGA2CAPS标记都未与 R10基因共分离 , 一方面可
能与试验中选用的限制性内切酶种类有关 , 可以通过增加限制性内切酶种类的方法来寻找新的标记 ,
或者可以将 PCR产物测序 , 根据序列的多态性位点信息进行针对性地限制性酶切 , 更准确的开发出
与 R10遗传距离更近甚至共分离的标记 ; 另一方面可能是由于 R10基因附近存在其同源基因或类似
物 , 以上推测将在以后的试验中进一步验证。
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