全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 493 - 496
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 28; 修回日期 : 2007 - 03 - 23
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30170633) ; 教育部回国留学人员基金项目3 E2mail: jiangguoyong@ hotmail1com
番茄抗病基因 Tm 222及其等位基因氨基酸序列的比较
姜国勇 13 , 王林华 1 , 黄婷婷 2
(1 莱阳农学院植物基因工程研究所 , 山东青岛 266109; 2 青岛农业科学院蔬菜研究所 , 山东青岛 266101)
摘 　要 : 从 4个番茄栽培品种 (L ycopersicon esculentum M iller) 中获得了 Tm 222等位基因的同源克隆 ,
进行序列分析 , 结果表明 : ‘沙龙 ’、‘渝抗 2号 ’和 ‘9724’分别与 ‘GCR - 267’ ( Tm 222 )、‘GCR - 236’
( Tm 22)、以及 ‘GCR - 26’( tm 22 ) 有 100% 的同源性 , 而樱桃番茄 ( Lycopersicon peruvianum. var.
cerasiform e) 品种 ‘樱红 1号 ’与 ‘GCR - 26’ ( tm 22) 仅有 98%的同源性 ; 在 C -端的 LRR结构域中 , 抗
病基因 Tm 222和 Tm 22编码蛋白的氨基酸序列与感病基因 tm 22存在 624和 704两个位点的氨基酸差异 , 即
624位点的脯氨酸 ( P) 对应亮氨酸 (L)、704位点的甲硫氨酸 (M ) 对应异亮氨酸 ( I) ; 在 601～790个氨
基酸的 LRR结构域中 , 抗病基因 Tm 222、 Tm 22及其秘鲁种 (L ycopersicon peruvianum var. den ta tum ) lptm 22
三者均与感病基因 tm 22的编码蛋白存在 23个氨基酸的差异 ; 樱桃番茄品种 ‘樱红 1号 ’与含有 tm 22基因
的栽培种之间具有同源性关系。
关键词 : 番茄 ; 抗病基因 ; Tm 222等位基因 ; 氨基酸序列
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220493204
Com par ison of Am ino Ac id Sequences on Resistant Gene Tm 222 and Its A lleles
J IANG Guo2yong13 , WANG L in2hua1 , and HUANG Ting2ting2
(1 Institu te of P lant Gene Engineering, L aiyang A gricultural College, Q ingdao, Shandong 266109, Ch ina; 2V egetables Institu te,
Q ingdao A cadem y of A gricultural Sciences, Q ingdao, Shandong 266101, China)
Abstract: A lleles of Tm 222 from 4 different cultivars were cloned. Sequence analysis of them showed
that: Salong, Yukang22 and 9724 had 100% identity to reported sequences from GCR267 ( Tm 222 ) , GCR236
( Tm 22) and GCR26 ( tm 22) , respectively; Cultivar Yinghong 1 had 98% identity to GCR26 ( tm 22) ; in
LRR domain of the encoded p roteins, the resistant alleles Tm 222 and Tm 22 have two am ino acid at sites of 624
and 704 different from that of the suscep tible alleles tm 22, lptm 22, in which p roline ( P) changed to leucine
(L) and methionine (M ) to isoleucine ( I) ; in LRR domain of the encoded p roteins between the sites of 601
and 790, 23 am ino acid differences were found among Tm 222 , Tm 22, lptm 22 and tm 22; tm 22 of Yinghong 1
(L ycopersicon escu len tum var. cerasiform e) m ight be an orthologous gene evolved from L ycopersicon escu len tum
cultivars.
Key words: Tomato; Resistant gene; Tm 222 alleles; Am ino acid sequence
番茄 (L ycopersicon escu len tum M iller) 的 Tm 222基因是一个属于 NBS - LRR家族 , 对 Tobam ovirus
属的病毒专化性的抗病基因 , 它位于第九号染色体长臂上、与基因 nv紧密连锁。 Tm 222与 Tm 22及其
感病基因 tm 22互为等位基因 , 具有 Tm 222基因的番茄感染病毒株系 ToMV22a, 对其它 5个番茄花叶病
毒 ( ToMV ) 却具有抗性 (W eber & fitzner, 1998)。通过烟草 Tm 222转化体的试验发现 (姜国勇和杨
仁崔 , 2003) , 转化体的 Tm 222基因与病毒无毒基因 M P相互作用时 , 病毒移动蛋白激发的受体抗病反
应与 Tm 222基因的自主启动子有关 ; 通过比较 TMV和 ToMV病毒不同分离物移动蛋白氨基酸序列的同
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
源性可以清楚地看到 , C -端的氨基酸差异决定了病毒的致病性 (W eber & Pfitzner, 1998; 姜国勇和
杨仁崔 , 2005)。同样 , Tm 222及其等位基因 Tm 22和 tm 22的编码蛋白分别在 NBS结构域和 LRR结构
域内存在着氨基酸序列的差异 (Lanfermeijer et al. , 2003, 2005) , 这种差异决定了 Tm 222及其等位基
因的抗病或者感病的性状特征。因此 , 研究 Tm 222基因及其编码蛋白的氨基酸序列能够在分子水平上
了解番茄品种的抗病特性、抗病基因杂交和重组的遗传规律 , 加深理解抗病基因编码蛋白对病毒的识
别和应答机制 , 为抗病基因的应用奠定基础。
1　材料与方法
试验材料为栽培番茄 (L1escu len tum M iller) 品种 ‘沙龙 ’、‘9724’, ‘渝抗 2号 ’; 樱桃番茄
(L . escu len tum var. cerasiform e) 品种 ‘樱红 1号 ’。
采用 CTAB法提取植株的总 DNA (姜国勇和杨仁崔 , 2003)。以提取的 DNA为模板 , 设计引物
进行 PCR扩增。扩增反应体系 50μL。扩增的引物序列为 : Primer 1: 5′2ATGGCTGAAATTCTTCTTA2
CATCAGTAATC23′; Primer 2: 5′2TCATTTACTCAGCTTTTTAAGCCGTT23′;
反应条件与姜国勇和杨仁崔 ( 2003) 的文献相同。扩增产物用 DNA Gel Extraction Kit ( Sangon,
上海 ) 回收 , T4连接酶 ( Takara, Co1L td; 大连 ) 与 pUm2T或 pUC57载体 ( Sangon, 上海 ) 连接 ;
上海生工生物工程服务有限公司测序。测序分别挑取了 4个克隆 , 其中来源于 ‘渝抗 2号 ’的克隆
为 pUC572Yukang 2, 来源于 ‘沙龙 ’的克隆为 pUC572Salong, 来源于 ‘9724’的克隆为 pUm 2T2974,
来源于 ‘樱红 1号 ’的克隆为 pUm2T2Yinghong1。
3个番茄株系 ‘GCR267’ ( Tm 222 , AF536201)、‘GCR236’ ( Tm 22, AF536200)、‘GCR26’
( tm 22, AF536199) 和秘鲁野生种 (L. peruvianum var. den ta tum ) ( lptm 22, AY765395) 的核苷酸序列
来源于 NCB I (www1ncbi1nlm1gov) 的数据库 , 应用 DNAMAN 软件分析氨基酸序列。
2　结果与分析
211　Tm 222等位基因的克隆及其酶切验证
经过 PCR特异扩增 , 栽培番茄 ‘渝抗 2号 ’、
‘沙龙 ’和 ‘9724’以及樱桃番茄 ‘樱红 1号 ’
均获得高纯度、单一的 2 586 bp 扩增产物 (图
1)。分别用 Pst I (CTGCA /G) 和 Sph I ( GCATG/
C) 来酶切 2 586 bp的 PCR回收产物 , 分别获得
1 500 bp 和 1 086 bp 的两段 Pst I酶切片段 (图
2) , 以及 558 bp 和 2 028 bp 的 S ph I酶切片段
(图 3 )。
图 1　Tm 222等位基因的 PCR扩增
F ig. 1　PCR am plif ica tion of Tm 222 a lleles
M: λDNA Marker EcoR I/H ind III
1. Salong; 2. Yukang 2; 3. 974; 4. Yinghong 1.
图 2　Tm 222等位基因扩增产物的 PstI酶切图谱
F ig. 2　PstID igestion for PCR products of Tm 222 a lleles
1. Salong; 2. Yukang 2; 3. 974; 4. Yinghong 1.
图 3　Tm 222等位基因扩增产物的 Sph I酶切图谱
F ig. 3　Sph I d igestion for PCR products of Tm 222 a lleles
1. Salong; 2. Yukang 2; 3. 974; 4. Yinghong 1.
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　2期 姜国勇等 : 番茄抗病基因 Tm 222及其等位基因氨基酸序列的比较 　
212　Tm 222等位基因的序列比较
对上述 4个克隆和 Genbank公布的 ‘GCR267’( Tm 222 )、‘GCR236’( Tm 22)、‘GCR26’( tm 22)以及
‘秘鲁野生种 ’ (L. peruvianum var. den ta tum ) ( lptm 22) 进行氨基酸序列的同源性分析和比较 , 结果
表明 : 来源于品种 ‘沙龙 ’的克隆 pUC572Salong
的插入基因序列与 ‘GCR267’具有 100%的同源
性 ; 来源于品种 ‘渝抗 2 号 ’的克隆 pUC57 -
Yukang 2 的插入基因序列与 ‘GCR236’具有
100%的同源性 ; 来源于品种 ‘9724’的克隆
pUm2T2974基因序列与 ‘GCR26’具有 100%的
同源性 ; 而来源于品种 ‘樱红 1 号 ’的克隆
pUm2T2Yinghong 1 基因序列与 ‘GCR26’具有
98%的同源性 ; 来源于番茄野生种的 lptm 22 与
‘GCR267’有 98%的同源性 (图 4)。
图 4　Tm 222及其等位基因编码蛋白的氨基酸序列系统进化树
F ig. 4　Phylogenetic tree on com pletely an im o ac id sequences
encoded by Tm 222 and its a lleles
213　Tm 222等位基因的 L RR结构域分析
Tm 222及其等位基因是一个 NBS2LRR家族的抗病基因 , 富含亮氨酸重复序列 LRR结构域。对其氨
基酸序列进行分析 (图 4, 图 5) 表明 , pUC572Salong、pUC572Yukang 2的插入序列与 ‘GCR267’和
‘GCR236’分别具有 Tm 222和 Tm 22基因序列的特征 , 与感病基因 tm 22 (‘GCR26’、 lptm 22) 以及所克隆
的栽培品种 ‘9724’和 ‘樱红 1号 ’的插入序列存在 624和 704两个位点的氨基酸差异 , 即 Tm 222和
Tm 22基因序列的 624位点是脯氨酸 ( P)、704位点的甲硫氨酸 (M ) ; 而感病基因 tm 22是亮氨酸 (L)
图 5　Tm 222及其等位基因编码蛋白中部分 L RR结构域的氨基酸序列比较
F ig. 5　Com par ison of an im o ac id sequences w ith partia l L RR doma in encoded by Tm 222 and its a lleles
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和异亮氨酸 ( I)。秘鲁野生种的 lptm 22基因与栽培品种 ‘GCR267’、‘GCR236’、‘沙龙 ’以及 ‘渝
抗 2号 ’含有的抗病基因 Tm 222和 Tm 22有 98%的基因序列同源性 , 它从第 601个氨基酸开始到第 790
个氨基酸中至少有 23个氨基酸与栽培种的等位基因不同。
3　讨论
番茄栽培品种抗病基因 Tm 222及其等位基因具有 95%以上的氨基酸同源序列 , 表明抗病基因
Tm 222及其等位基因在进化上是同源的 , 抗病基因 Tm 222和 Tm 22的形成是由于感病基因 tm 22突变的结
果 , 而这种突变的发生主要是 LRR结构域中的氨基酸的改变。从同源关系树 (图 4) 可以看出 , 栽
培品种 ‘GCR267’、‘GCR236’、‘沙龙 ’以及 ‘渝抗 2号 ’中含有的抗病基因 Tm 222和 Tm 22相互之
间具有很高的同源性 , 上述 4个品种的 Tm 222和 Tm 22依然与番茄秘鲁野生种的变种 (L1peruvianum
var. den ta tum ) 的 lptm 22有 98%的基因序列同源性 , 也就是说 , 除了第 601个氨基酸到第 790个氨基
酸之间的 LRR结构域存在 23个氨基酸差异外 , Tm 222和 Tm 22基因编码蛋白中的 861个氨基酸与 lptm 2
2有相当高的同源性 , 所以这一结果同一些学者的观点 ( Hall, 1980; Lanfermeijer et al. , 2004) 一
致 , 即 Tm 22基因的抗病性特征来源于番茄秘鲁野生种 (L. peruvianum ) 的基因突变 , 而不是来源于
番茄的智利野生种 (L. ch ilense) 的变异株 I1P1128650 (余诞年 等 , 1999)。
测序结果还表明 , ‘沙龙 ’和 ‘渝抗 2号 ’与 GenBank公布的抗病基因 Tm 222和 Tm 22的氨基酸
序列 100%一致 , 因此 , 可以认为 ‘沙龙 ’和 ‘渝抗 2号 ’是分别含有 Tm 222和 Tm 22的抗病品种。
品种 ‘沙龙 ’含有 Tm 222基因 , 是一个对 ToMV22病毒分离物感染 , 而对 ToMV20 、ToMV21、ToMV2
2a病毒分离物具有抗性的品种。从第 601个氨基酸到第 790个氨基酸中 , Tm 222和 Tm 22以及 lptm 22
至少有 23个氨基酸与 tm 22不同 , 在 10% (23个氨基酸 ) LRR结构域发生核苷酸变异 , 这一结果表
明栽 培 种 ( L1escu len tum M iller )、樱 桃 番 茄 ( L1escu len tum 1var1cerasiform e ) 与 秘 鲁 野 生 种
(L1peruvianum ) 在该结构域内具有显著性的差异。
番茄栽培种 (9724和 GCR26) 及其变种樱桃番茄品种 ‘樱红 1号 ’的 tm 22的氨基酸序列分析表
明 , 樱桃番茄作为野生栽培种的变种 , 二者的基因序列高度同源 (98% ) , 也显示它们之间进化的同
源关系以及杂交后代的基因稳定性。
References
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Lanfermeijer F C, J iang G, FerwerdaM A, D ijkhuis J, de Haan P, Yang R, H ille J. 2004. The durable resistance gene Tm 22 from tomato confers
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