全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 985～988
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 02 - 21; 修回日期 : 2006 - 08 - 25
基金项目 : 高等学校博士点科研基金项目 (20030307021)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
白菜病程相关蛋白 1基因 cDNA全长的克隆与分析
王彦华 1, 2 　侯喜林 13 　申书兴 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 江苏南京 210095; 2 河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001)
摘 　要 : 以水杨酸处理后的 ‘苏州青 ’白菜为材料 , 通过 RT2PCR和 RACE技术 , 获得了白菜病程相
关蛋白 PR 21基因的 cDNA全长序列。该基因与甘蓝型油菜 PR 21基因氨基酸序列的同源性为 91% , 与拟南
芥的同源性为 78% , 与其它植物的同源性为 57% ～60%。Southern杂交表明该基因在白菜基因组中的拷贝
数至少为 2个。半定量 RT2PCR分析表明 , 2 mmol/L的水杨酸处理后 12 h, 该基因的表达量达到高峰。
关键词 : 白菜 ; 病程相关蛋白 1; 水杨酸 ; RT2PCR
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0520985204
C lon ing and Character iza tion of a Full2length cD NA of Pa thogenesis2rela ted
Prote in 1 in B rassica rapa ssp. ch inensis
W ang Yanhua1, 2 , Hou Xilin13 , and Shen Shuxing2
(1N ationa l Key Labora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing A gricu ltura l U niversity, N anjing, J iangsu
210095, China; 2 College of Horticu lture, Hebei A gricultural U niversity, B aoding, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: In this study, according to the consensus domain of the B rassica napus pathogenesis2related
p rotein PR 21 gene ( accession number U21849) , using RT2PCR and RACE technology, a full2length cDNA
of pathogenesis2related p rotein 1 named B cPR 21 was obtained from B rassica rapa ssp. ch inensis cultivar
Suzhouqing, which disp layed resistance to downy m ildew. Sequence analysis indicated that cloned B cPR 21
gene consisted of 646 nucleotides ( nt) containing 161 am ino acids. Further comparison to B. napus PR 21
gene and A rabidopsis tha liana PR 21 gene showed that its identity was 91% and 78% , respectively. Its sim ilar2
ity to other PR 21 genes was 57% to 60%. Southern2blot analysis indicated that there were at least two cop ies
of B cPR 21 gene in B. rapa ssp. ch inensis genome. Sem i2quantitative RT2PCR analysis revealed that exp res2
sion of B cPR 21 gene was induced by SA treatment in Suzhouqing, and the corresponding mRNA was accumu2
lated most abundantly 12 h after treatment upon 2 mmol/L SA.
Key words: B rassica rapa ssp. ch inensis; Pathogenesis2related p rotein 1; SA; RT2PCR
植物在受到病原菌侵染后会积累一些新的蛋白质 , 称为病程相关蛋白 (pathogenesis2related p ro2
teins) , 简称 PR蛋白。van Loon等〔1〕根据 PR家族成员的氨基酸组成、结构及生物活性等 , 将其分为
14类 , 即 PR21～PR214。PR蛋白只在病原物侵染或某些化合物 (如水杨酸等 ) 的诱导下生成和大量
积累 , 在拟南芥中 , 病原菌侵染或水杨酸 ( SA ) 处理能够诱导 PR 21基因的表达〔2〕。有研究发现 ,
PR21蛋白能够介导植物对真菌产生抗性 , 表达 PR 2la的转基因烟草中 , PR 21基因以组成型高效表达 ,
增强了对两种卵菌侵染的耐性〔3〕, N iderman等〔4〕提供了 PR21蛋白在体外有直接抑菌作用的证据。
近年来 , 植物抗病基因工程研究日益受到重视 , 而目的基因的克隆是转基因育种的基础与关键 ,
目前尚未见白菜 PR 21基因被克隆的报道。作者参照已发表的甘蓝型油菜 PR 21基因序列设计引物 , 以
SA处理后的白菜为材料 , 通过 RT2PCR和快速扩增 cDNA末端 ( Rap id Amp lification of cDNA Ends,
RACE) 方法 , 获得了白菜 PR 21基因 cDNA全长序列 , 并对该基因的表达进行了初步研究。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
材料为白菜抗病自交系 ‘苏州青 ’, 由南京农业大学白菜课题组提供。幼苗两片真叶时用 2
mmol/L SA (用 KOH调节 pH至 615) 进行喷雾处理 , 分别于处理后 0、12、24、48和 72 h提取叶片
总 RNA ( Trizol试剂法 )。DNA的提取采用 CTAB法。大肠杆菌菌株 JM109由本实验室保存 ; 质粒载
体 pMD182T、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、AMV反转录试剂盒等均购自 TaKaRa公司 ; D ig DNA
Labeling and Detection Kit购自 Roche公司。
利用 RNase Free DNaseⅠ去除总 RNA中痕量 DNA污染 , RT反应参照大连 TaKaRa生物公司的
TaKaRa RNA PCR Kit (AMV ) Ver1 211试剂盒说明书进行。根据甘蓝型油菜 PR 21基因 ( accession
number U21849) 序列设计正向引物 PR12F和反向引物 PR12R, 由上海博亚生物技术公司合成。PCR
扩增程序为 : 94℃ 3 m in, 1个循环 ; 94℃ 30 s, 57℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 35个循环 ; 72℃ 10 m in;
4℃保存。扩增产物在 112%琼脂糖凝胶中进行电泳 , 凝胶成像系统进行拍照及分析。
根据已获得的白菜 PR 21基因 cDNA片段测序结果 , 设计两条正向嵌套引物 PR121和 PR122, 以
通用引物 M4为反向引物 , 进行巢式 PCR扩增。第 1轮 PCR以 cDNA为模板 , 正反向引物为 PR121和
M4, 53℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in 30 s; 第 2轮 PCR以第 1轮 PCR产物为模板 , 正反向引物为
PR122和 M4, 退火温度为 55℃, PCR反应体系同上。
回收 DNA片段连接到 pMD 182T载体上。连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109, 蓝白斑筛选。煮
沸法提取质粒 , 用上述特异引物同条件下进行 PCR扩增 , 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。
Southern杂交 : 用限制性内切酶 EcoRⅠ、B am HⅠ及 H ind Ⅲ完全消化 20μg基因组 DNA ( 37℃
过夜 ) , 018%琼脂糖凝胶电泳 12 h (1 V /cm) , 使酶切产物充分分开 , 利用碱性转移液进行转膜。探
针的标记、杂交、洗膜及显色处理均按照 D IG标记检测试剂盒说明进行。
半定量 RT2PCR分析 : 选取在不同植物中保守的延伸因子 EF21a基因作为内标 , 引物设计参照文
献 〔5〕: EF21F 5pi2AGACCACCAAGTACTACTGCAC2 3pi; EF21R 5pi2CCACCAATCTTGTACACATCC2 3pi;
预期的扩增产物为 495 bp。除去白菜总 RNA中的 DNA污染进行反转录。调整模板浓度使 EF21a的
PCR扩增产物量一致 , 这时的模板用于白菜 PR 21基因 mRNA的表达分析。最后以内标基因 EF21a的
引物和白菜 PR 21基因片段的引物 (预期片段长度为 340 bp ) 进行双重 PCR分析。PCR扩增程序为 :
94℃预变性 5 m in; 94℃ 30 s, 58℃ 40 s, 72℃ 1 m in, 29个循环 ; 72℃延伸 10 m in。
序列测定由上海博亚生物技术公司在 AB I 377测序仪上进行 ; 相似性比较在 NCB I站点上用
BLAST完成。多序列比较利用 B ioEdit软件完成 , 开放阅读框 (ORF) 分析在 NCB I站点上用 ORF
finder进行。利用 SMART进行基因结构分析 , 利用 ExPASy分析推导蛋白分子量及等电点。
2　结果与分析
211　白菜病程相关蛋白 1基因 cD NA全长的克隆
以 SA处理后 24 h的白菜 cDNA为模板 , 利
用正向引物 PR12F和反向引物 PR12R进行 PCR扩
增 , 获得了约 480 bp的单一条带 (图 1) , 命名
为 PR1L。根据已获得的 cDNA片段 PR1L设计了
3piRACE的引物 , 经过两轮巢式 PCR扩增 , 得到
了 250 bp左右的单一条带 (图 2)。将 2个片段
结合在一起 , 获得了 646 bp的白菜病程相关蛋白
1基因全长 cDNA序列 , 命名为 B cPR 21。将该序
列提交 GenBank, 登录号为 AY623008。
图 1　白菜 PR 21基因 5pi端的扩增
F ig. 1　PCR am plif ica tion of PR 21 gene 5piend in
B. rapa ssp. ch inensis
M: DL22000; 1. PCR p roduct using p rimer PR12F and PR12R.
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　5期 王彦华等 : 白菜病程相关蛋白 1基因 cDNA全长的克隆与分析 　
212　白菜 B cPR 21基因的序列分析
在 NCB I站点上用 ORF finder分析 B cPR 21的
开放阅读框 (ORF) , 结果表明其 5pi端含有 19 bp
的前导序列区 , 20～505 bp构成一个完整的开放
阅读框架 , 编码 161 个氨基酸残基的蛋白质。
BLAST分析表明 , B cPR 21基因的核苷酸序列与甘
蓝型油菜 PR 21的同源性为 96% , 与拟南芥 PR 21
的同源性为 82%。其氨基酸序列与甘蓝型油菜
PR 21的同源性为 91% , 与拟南芥 PR 21的同源性
为 78 % , 与辣椒、番茄、烟草、马铃薯、黄瓜
图 2　3pi2RACE扩增
1. 第 1轮 PCR产物 ; 2. 第 2轮 PCR产物。
F ig. 2　The result of 3pi2RACE
M: DL22000; 1. The first PCR; 2. The second PCR.
PR 21基因的同源性为 60% ～63%。利用 B ioEdit软件对玉米、甘蓝型油菜、白菜、烟草、拟南芥、番
茄、马铃薯等 7种植物 PR 21基因的氨基酸序列进行多重对比 (图 3) , 结果表明 , 不同植物的 PR 21
基因在 C末端氨基酸序列具有很高的保守性 , 但在其 N末端氨基酸序列构成上有较大的差异 , 而且
其氨基酸序列的长度也基本相似 , 充分说明了 PR 21基因在不同植物中的保守性。
图 3　白菜 B cPR 21与其它植物 PR 21基因氨基酸序列的多重比较
黑色方框代表相同或相近的氨基酸残基。
F ig. 3　A lignm en t of the deduced am ino ac id sequence of B cPR 21 from B. rapa ssp. ch inensis w ith other plan t PR 21 genes
The dark boxes indicate identical residues in am ino acid sequence.
213　白菜 B cPR 21基因的蛋白结构特征分析
利用 SMART进行基因结构分析发现 , 白菜 B cPR 21基因推导的蛋白 N端具有由 1～20位氨基酸组成
的信号肽结构 , 第 28～157位为典型的 SCP结构域 , 而 SCP结构域是植物 PR21家族的共有特征。利用
ExPASy分析白菜 B cPR 21基因 , 推导的蛋白分子量为 17142 kD, 等电点 9109, 表明该蛋白为碱性蛋白。
214　白菜 B cPR 21基因的拷贝数验证
利用克隆 B cPR 21基因所设计的引物 , 以 ‘苏州青 ’白菜的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,
得到了大小为 550 bp的 B cPR 21基因片段。选取在 B cPR 21基因中无酶切位点的 EcoRⅠ、B am HⅠ及
H ind Ⅲ对白菜基因组 DNA 进行酶切 , 进行 Southern杂交。如果 B cPR 21基因为单拷贝 , EcoR Ⅰ、
B am HⅠ及 H ind Ⅲ的酶切产物应出现 1条杂交带。从图 4中可以看出 , 3种限制性内切酶均出现了两
条强带 , 说明白菜 B cPR 21基因在基因组中应该至少包括 2个拷贝。
215　SA处理对白菜 B cPR 21基因表达的影响
从图 5中可以看出 , SA处理后 12 h其 mRNA积累达到高峰 , 直至处理后 24 h一直维持高水平 ,
48 h之后其表达开始减弱。显然 , SA诱导了 B cPR 21基因的表达。
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图 4　Southern杂交结果
F ig. 4　Southern blot ana lysis of genom ic D NA
w ith d ifferen t restr iction enzym es
图 5　水杨酸处理后不同时间 B cPR 21基因的表达
F ig. 5　T im e course ana lysis of B cPR 21 gene expression
upon trea tm en t w ith SA
M: DL22000.
3　讨论
有研究表明 , 同一物种中 PR21蛋白含有酸性和碱性两种异构体 , 碱性 PR21蛋白具有更高的抗真
菌活性〔1〕, 而本试验中所获得的白菜 PR21蛋白为碱性的异构体。烟草 DNA的 Southern印记分析表
明 , 其基因组中可能有 8个 PR 21基因拷贝〔6〕。Kim 等〔7〕从辣椒中分离了 1个碱性的 PR 21基因 ,
Southern杂交结果显示 , 该基因在辣椒基因组中为单拷贝。于玲等〔8〕从小麦中克隆的 TaP r21基因在
小麦基因组中大于一个拷贝数。本试验中通过 Southern印记分析表明 , 白菜基因组中至少存在两个
B cPR 21基因的拷贝 , 说明在不同的植物中 PR 21基因的拷贝数存在差异。Terras等〔9〕分析了不同浓度
水杨酸对萝卜的 PR 21基因 (R s2PR 21) 的诱导作用 , 发现用 215 mmol/L处理后 24 h, 该基因没有表
达 , 但 10 mmol/L 处理后 24 h则有明显的 mRNA 积累。本试验中采用 2 mmol/L 的 SA 诱导白菜
B cPR 21基因的表达 , 在 SA处理后 12 h已经开始高水平表达 , 说明白菜 B cPR 21基因的表达模式不同
于萝卜的 R s2PR 21基因和烟草的 PR 21a基因。本试验通过 RT2PCR和 RACE方法获得了白菜 PR 21基因
的 cDNA全长序列 , 为进一步分离该基因的启动子序列 , 构建 PR 21基因的植物表达载体 , 以及通过基
因工程培育抗病蔬菜品种打下了基础。
参考文献 :
1　van Loon L C, van Strien E A. The fam ilies of pathogenesis2related p roteins, their activities, and comparative analysis of PR21 type p roteins.
Physiol. Mol. Plant Pathol. , 1999, 55: 85～97
2　Uknes S, Mauch2Mani B , MoyerM, Potter S, W illiam s S, D incher S, Chandler D, Slusarenko A, W ard E, Ryals J. Acquired resistance in
A rabidopsis. Plant Cell, 1992, 4: 645～ 656
3　A lexander D, Goodman R M, Gut2Rella M, Glascock C, W eymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl2Goy P, Luntz T, W ard E, Ryals J. In2
creased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco exp ressing pathogenesis2related p rotein 1a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1993, 90: 7327～7331
4　N iderman T, Genetet I, B ruyere T, Gees R, Stintzi A, Legrand M, Fritig B, M singer E. Pathogenesis related PR21 p roteins are antifungal,
isolation and characterization of three 142kilodalton p roteins of tomato and of a basic PR21 of tobacco with inhibitory activity against Phytoph2
thora infestans. Plant Physiol. 1995, 108: 17～27
5　彭建令 , 赵　静 , 潘小玫 , 赵建方 , 董汉松 , 王金生 , 刘伯新 , 刘广玉 , 程云吉. 核黄素启动植物生长信号通路的初步研究. 南
京农业大学学报 , 2002, 25 (4) : 33～36
Peng J L, Zhao J, Pan X M, Zhao J F, Dong H S, W ang J S, L iu B X, L iu G Y, Cheng Y J. R iboflavin activates growth signal transduction
pathway in p lants. Journal of Nanjing Agricultural Univerisity, 2002, 25 (4) : 33～36 ( in Chinese)
6　王金生. 分子植物病理学. 北京 : 中国农业出版社 , 1999. 217～219
W ang J S. Molecular p lant pathology. Beijing: China Agricultural Press, 1999. 217～219 ( in Chinese)
7　Kim Y J, Hwang B K. Pepper gene encoding a basic pathogenesis2related 1 p rotein is pathogen and ethylene inducible. Physiol. Plant,
2000, 108: 51～60
8　于　玲 , 牛吉山 , 马正强 , 李新燕 , 陈佩度 , 刘大钧. 小麦病程相关蛋白 1基因的克隆及特征分析. 遗传学报 , 2001, 28 (8) : 760～768
Yu L, N iu J S, Ma Z Q, L i X Y, Chen P D, L iu D J. Cloning and characterization of pathogenesis2related p rotein 1 from wheat2H. villosa
translocation lines. Acta Genetica Sinica, 2001, 28 (8) : 760～768 ( in Chinese)
9　Terras F R, Penninckx IA, Goderis I J, B roekaertW F. Evidence that the role of p lant defensins in radish defense responses is independent
of salicylic acid. Planta, 1998, 206 (1) : 117～124
889