全 文 ：园　艺　学　报　2008, 35 (4):603-606
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2007-11-06;修回日期:2008-03-10
基金项目:通化师范学院自然科学基金项目 (XS060073);吉林省科技厅项目 (200705C05)
＊E-mail:gudizhou@ 163.com;Tel:0435-3208073
牛皮杜鹃的组培快繁及种质试管保存技术
顾地周＊ , 孙忠林 , 何晓燕 , 张秋菊 , 朱俊义
(通化师范学院生物系 , 吉林通化 134002)
摘　要:以牛皮杜鹃休眠芽为外植体 , 筛选最适合萌发 、 再分化 、 生根和种质试管保存的培养基。结
果表明最适合休眠芽萌发的培养基为:1/4 MS+GA3 1.5mg· L-1 +维生素 C20mg· L-1;基部直接再分
化培养基为:1/4 MS+ 6-BA4.0 mg· L-1 +NAA0.3 mg· L-1;生根培养基为:MS+IBA0.46mg· L-1
+活性炭 450 mg· L-1;种质试管保存培养基为:1/6 MS(大量元素) + 1/4 MS(微量元素) + 1/2 MS
(铁盐) +1/4 MS(有机物质) +B9 3.5mg· L-1。牛皮杜鹃组织培养的不同阶段需要不同的培养基 , 常
温条件下 , 利用低营养矮化常温的方法在试管内保存种质资源。
关键词:牛皮杜鹃;组织培养;再分化;种质试管保存
中图分类号:S685.21　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2008) 04-0603-04
MicropropagationandGermplasmPreservationinTubeofRhododendron
chrysanthumPal.
GUDi-zhou＊ , SUNZhong-lin, HEXiao-yan, ZHANGQiu-ju, andZHUJun-yi
(DepartmentofBiology, TonghuaNormalUniversity, Tonghua, Jilin134002, China)
Abstract:DormantbudsofRhododendronchrysanthumPal.wereusedasexplantsforexperiment.The
mostsuitablemediaforinducement, diferentiation, rootingandgermplasm preservationintubewere
screened.Theresultsshowedthat1/4 MS+GA3 1.5mg·L-1 +vitaminC20mg·L-1 wasfitforsprouting
ofdormantbuds, 1/4 MS+6-BA4.0 mg· L-1 +NAA0.3 mg· L-1 fordiferentiation, MS+IBA0.46
mg·L-1 +activecarbon450 mg· L-1 forrooting, and1/6 MS(macro-elemenyts)+1 /4 MS(micro-
elements)+1 /2MS(fericsalt)+1/4MS(organicsubstances)+B9 3.5mg· L-1 forgermplasmpreser-
vationintube.Rhododendronchrysanthumtissueculturerequireddiferentkindsofculturemediaindiferent
phases.Themethodofdwarfingwithlownutrientsandnormaltemperaturewasutilizedforgermplasmpreser-
vationintubeatnormaltemperature.
Keywords:RhododendronchrysanthumPal.;tissueculture;diferentiation;germplasmpreservationin
tube
牛皮杜鹃 (RhododendronchrysanthumPal.)又称牛皮茶 , 杜鹃花科常绿小灌木 , 大多分布于长
白山自然保护区内 , 为我国国家三级保护的珍贵稀有植物。牛皮杜鹃可以盆栽观赏 , 也是上好的绿化
园艺品种 , 其叶片具有药用价值 , 可供制茶 (周繇 , 2006)。牛皮杜鹃在我国分布甚狭 , 仅在长白山
国家级自然保护区内有较大的种群面积。由于人们乱采乱挖 , 野生资源遭到极大破坏 , 并且种子细
小 , 萌发率低 (张乐华 等 , 2006), 扦插繁殖生根率低且根数少 , 移栽成活率极低 , 开发和利用受
到极大的限制。因此 , 在保护好现有野生资源的同时 , 应用植物组织培养方法对这一宝贵野生资源进
行快繁并大面积栽培 , 同时采取试管保存其种质 , 以防该物种灭绝。目前同属其他种植物的组织培养
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已有报道 , 但牛皮杜鹃的组培快繁和种质试管保存在国内外迄今未见报道 。
1　材料与方法
1.1　外植体材料及其培养条件
2005年 6月于长白山北坡海拔 1 700 m针阔叶混交林下采牛皮杜鹃未开花休眠芽 。将休眠芽带 2
cm半木质化部分剪下 , 在超净工作台上用 70%酒精涮洗 60 s, 用含 0.2%链霉素的次氯酸钠 (2%)
溶液浸泡 8min, 无菌水冲洗 6次 。用无菌滤纸吸干表面水分 , 切除木质部 , 将休眠芽作为外植体。
以 MS作基本培养基 , 附加蔗糖 30 g·L-1 (生根培养为 20 g·L-1), 琼脂 9.5g·L-1 , pH5.5,
附加各种植物生长调节剂 , 温度 (24±2)℃, 光照强度 1 200lx, 光周期 12h·d-1。
1.2　休眠芽萌发
将外植体接种到附加不同浓度 GA3的 MS培养基上进行暗培养。加入维生素 C20 mg·L-1以阻止
酚类物质氧化为醌类物质损伤组织细胞。
1.3　休眠芽萌发的嫩芽基部直接再分化和继代增殖培养
以 1 /4MS作为培养基 , 将休眠芽萌发出的嫩芽接种到附加不同浓度 6-BA和 NAA的培养基上进
行基部直接再分化培养。筛选最适宜基部直接再生植株的植物生长调节剂浓度配比 。培养至 40d嫩
芽基部直接再生植株形成丛生芽团。选择长势较好的丛生芽团或茎段 (一叶一段)切割 , 再接种到
再生植株诱导培养基 (植物生长调节剂浓度酌减)上进行继代增殖培养。
1.4　生根培养
以 MS作为基本培养基 , 附加不同浓度的 IBA, 筛选最合适的生根培养基 。
1.5　种质试管保存
采用 “低营养矮化常温 ” 的方法 , 将基部含有少量芽锥的丛生芽团或茎段 (一叶一段)接种到
不同培养基上进行试管保存 , 温度为 (24±2)℃, 光照强度 1 000 lx, 光周期 10 h· d-1 , 蔗糖 30
g· L-1 , 矮壮素采用 B9 2.0 ～ 4.0 mg· L-1。筛选最适合种质试管保存的培养基。
1.6　数据分析
数据分析与处理采用 SPSS11.0软件。
2　结果与分析
2.1　MS培养基中不同浓度 GA3对牛皮杜鹃休眠芽萌发的影响
从表 1可以看出 , 牛皮杜鹃休眠芽离体培养需要一定浓度的 GA3 , 1号单纯的 MS培养基不起作
用;5号培养基 GA3浓度过高对休眠芽萌发产生明显抑制作用;2号和 3号培养基可使休眠芽萌发 ,
但萌发时间长 , 生长不好;而 4号培养基适合牛皮杜鹃休眠芽萌发及生长。以上试验表明:GA3
0.5 ～ 1.5mg· L-1对休眠芽萌发有促进作用;1.5 mg· L-1以上有抑制作用 。因此 , 适合牛皮杜鹃休
眠芽萌发较好的培养基为 MS+GA3 1.5mg·L-1 +维生素 C20mg·L-1 (图版 , a)。
表 1　MS培养基中不同浓度 GA3对牛皮杜鹃休眠芽萌发的影响
Table1　EffectsofGA3 withdifferentconcentrationsondormantbudssproutingofRhododendronchrysanthumPal.inMSmedium
代号 Code GA3 /(mg· L-1) 外植体数 Numberofexplants 萌发率 /% Inducementrate
1 0.0 30 0.0
2 0.5 30 72.0
3 1.0 30 88.7
4 1.5 30 93.5
5 2.0 30 2.0
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　4期 顾地周等:牛皮杜鹃的组培快繁及种质试管保存技术　
2.2　1 /4MS培养基中不同浓度 6-BA对牛皮杜鹃基部直接再分化和继代增殖的影响
为防止继代增殖培养过程中生长素 (NAA)积累过多 , 造成再生植株变异的现象 , 采取降低生
长素 (NAA)浓度 (0.3mg· L-1)的措施 。
　　不同浓度 6-BA对牛皮杜鹃的基部直接再分
化影响显著 (F4, 45 =181.648, P<0.05)。
图 1显示 , NAA浓度为 0.3 mg· L-1时 , 随
6-BA浓度的增大 , 嫩芽基部直接再分化率也随之
增大 , 分化出的丛生苗生长良好;6-BA浓度为
4.0mg· L-1时嫩芽基部分化率达到最高。而 6-
BA浓度达到 4.5 mg·L-1以后分化率下降幅度较
大 , 有些几乎不分化 , 分化的苗叶片发生形态变
化并且细弱。所以 , 培养基 1/4 MS+6-BA4.0
mg·L-1 +NAA0.3 mg· L-1最适合牛皮杜鹃嫩
芽基部直接再分化和生长发育 (图版 , b)。继代
增殖培养时 , 6-BA浓度可略减 (图版 , c)
图 1　1/4MS培养基中不同浓度 6-BA对牛皮杜鹃基部
直接再分化的影响
Fig.1　Effectsof6-BAwithdifferentconcentrationsondiferen-
tiationofR.chrysanthumPal.in1/4MSmedium
2.3　MS培养基中不同浓度 IBA对牛皮杜鹃组培苗生根的影响
采用 MS培养基 , 生长素采用 IBA, 牛皮杜鹃组培苗有根发生且生长较好 。
IBA浓度在 0.1 ～ 0.5 mg·L-1之间时 , 组培苗生根率随其浓度的增加而升高。 IBA浓度为 0.1 ～
0.4mg· L-1时 , 苗根直接从皮孔中发出 , 生根率
和移栽成活率都较高 。IBA浓度为 0.5 mg·L-1时
, 虽然生根率相对最高 , 但根是从组培苗基部形
成的愈伤瘤中发出 , 这样的组培苗移栽成活率低。
因此 , 在 IBA浓度为 0.41 ～ 0.50 mg·L-1范围做
10个样本试验 (图 2)。单因子方差分析结果显
示:IBA浓度为 0.46 mg· L-1时生根效果最佳 ,
生根率达 89%, 且长势好;超过 0.46mg· L-1时
茎基部便出现棒状膨大 , 这样的苗即使生根 , 移
栽成活率也极低 。所以 , 牛皮杜鹃最佳生根培养
基为 MS+IBA0.46 mg· L-1 +活性炭 450 mg·
L-1 (图版 , d)。
图 2　MS培养基中不同浓度 IBA对牛皮杜鹃组培苗生根的影响
Fig.2　EfectsofIBAwithdiferentconcentrationsonrooting
ofR.chrysanthumPal.seedlings
fromtissuecultureinMSmedium
2.4　改良后的 MS培养基中不同浓度 B9对牛皮杜鹃种质试管保存的影响
牛皮杜鹃种质试管保存培养基采用改良后的 MS培养基:1/6 MS大量元素 +1 /4 MS微量元素 +
1 /2MS铁盐 +1/4 MS有机物质 , 并且附加一定浓度的 B9 , 对基部丛生芽团上芽锥的生长 、 发育及芽
锥发出苗均较为理想 。
在培养基中加入矮壮素 B9 2.0 ～ 4.0 mg· L-1 , 矮壮素 B9浓度为 3.5mg· L-1时较为理想。采用
低营养矮化常温的方法 , 在室温下每年更换两次培养基可长期在试管内保存牛皮杜鹃种质 (图版 ,
e), 并降低成本。
3　讨论
试验证明 , 牛皮杜鹃休眠芽的离体萌发需要适宜浓度的 GA3来打破休眠 。MS培养基中大量元素 、
微量元素 、 铁盐及有机物质浓度降低 , 有利于牛皮杜鹃休眠芽萌发的嫩芽基部直接再分化和继代增
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殖 , 但不利于生根培养。本研究与德国产粉红色高山杜鹃 `火箭 品种的组培技术 (汤桂钧 等 ,
2004)在配方和方法上略有不同之处 , 可能是由于品种 、 地域 、 生态环境等原因 。植物种质试管保
存大多采取低温处理 、低温结合弱光照的方法 (艾鹏飞和罗正荣 , 2004;钱剑林 等 , 2004)。牛皮
杜鹃种质试管保存技术采取 “常温低营养矮化 ” 方法 , 需特殊改良的 MS培养基且不需加生长素和细
胞分裂素 , 这种方法可常温下在试管内保存牛皮杜鹃种质达 8个月之久。分析其原因可能是不同的植
物种质试管保存需要不同的理化条件 。本研究应用植物组织培养技术对牛皮杜鹃进行组培快繁及其种
质试管保存 , 得到预期结果 , 对其开发和利用有一定的参考意义 。经过特殊改良后的 MS培养基可大
幅度降低成本 , 为今后长白山高山杜鹃引种 、 驯化 、种质试管保存及工厂化育苗提供参考依据 。
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图版说明:a.休眠芽萌发;b.再分化;c.继代增殖培养;d.生根培养;e.种质试管保存。
Explanationofplates:a.Cultivatedforbourgeoningofdormantbuds;b.Diferentiation;c.Cultivatedforproliferation;d.Cultivatedforroo-
ting;e.Germplasmpreservationintube.
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