全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 555 - 560
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 09; 修回日期 : 2007 - 03 - 22
基金项目 : 北京市重点实验室资助项目 ; 国家自然科学基金项目 (30170552)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@cau1edu1cn)
抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因
张玉刚 1, 2 , 许雪峰 1 , 李天忠 1 , 王　忆 1 , 孔　瑾 1 , 韩振海 13
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094; 2 青岛农业大学园艺学院 , 山东青岛 266109)
摘 　要 : 以铁高效基因型植物 ———苹果属小金海棠 (M alus xiaojinensis Cheng et J iang) 为材料 , 利用抑
制性消减杂交 ( SSH) 方法 , 成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减 cDNA文库。该文库包含 1 152个克
隆 , 通过 PCR检测插入片段大小在 300～1 000 bp之间。对构建的消减 cDNA文库进行差异筛选 , 得到差异
表达片段 ( ESTs) 105个。GenBank上 BLAST结果如下 : 50个 ESTs与其它物种同源性较高 , 视为已知基
因 , 并根据其功能分为 9个组 ; 32个 ESTs在 GenBank中无法查到对应的同源序列 , 可能代表了新基因 ;
另外 23个是与已知 ESTs重复的基因片段。
关键词 : 苹果 ; 小金海棠 ; 抑制性消减杂交 ; cDNA文库 ; 差异筛选
中图分类号 : S 661　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320555206
Isola tion of Fe D ef ic iency2induced Genes by Suppression Subtractive Hybr id2
iza tion in M a lus xiao jinensis
ZHANG Yu2gang1, 2 , XU Xue2feng1 , L I Tian2zhong1 , WANG Yi1 , KONG J in1 , and HAN Zhen2hai13
(1 Institu te for Horticultural P lan ts, China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, Ch ina; 2 Horticultural College, Q ingdao
A gricu ltura l U niversity, Q ingdao, Shandong 266109, China)
Abstract: In order to isolate genes involved in Fe nutrition, supp ression subtractive hybridization ( SSH)
was performed using m ixed cDNA s p repared from M alus x iaojinensis roots treated with Fe deficiency as tester
and treated with Fe sufficiency as drivers. A forward subtractive cDNA library was constructed, from which
1 152 recombinant colonies were p icked and amp lified. Through differential screening of the subtractive cDNA
library, 105 exp ress sequence tags ( ESTs) were identified as Fe deficiency stress induced. Of the 105 ESTs,
50 contain regions with 60% - 90% identity to their homolog in GenBank, 32 are expected to be novel genes,
23 are repeated fragments to other genes. The ESTs with significant p rotein homology were sorted into 9 func2
tional categories.
Key words: App le; M alus x iaojinensis; Supp ression subtractive hybridization ( SSH ) ; cDNA library;
D ifferential screen
铁是植物生长发育所必需的微量元素之一 , 偏碱性土壤中植物缺铁黄化现象较为普遍。苹果缺铁
黄化严重影响产品的质量和产量。
小金海棠 (M a lus x iaojinensis Cheng et J iang) 是近年来筛选出的一个铁高效苹果种 (Han et al. ,
1994a)。本试验应用抑制性消减杂交 ( Supp ression subtractive hybridization, SSH ) 技术构建了小金海
棠消减 cDNA文库 , 旨在通过差异筛选消减文库来获得缺铁诱导的差异表达片段 ( Exp ressed sequence
tags, ESTs) , 为今后克隆苹果铁高效基因以及果树基因工程奠定基础。
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1　材料与方法
111　试验材料
小金海棠种子层积 20 d左右 , 播种于基质 (高压灭菌后的蛭石 ) 中。待幼苗长出 3～4片真叶
时 , 转入水培 ( Han et al. , 1994b)。幼苗分为两个处理 , 一部分正常供铁 ( 40 μmol·L - 1 Fe2
EDTA ) , 另一部分缺铁处理 (4μmol·L - 1 Fe2EDTA ) , 5、10、15 d后分别取其新生根 , 称鲜质量 ,
液氮冷冻后 - 70℃保存。
112　小金海棠总 RNA的分离和双链 cD NA的合成
总 RNA的提取采用改进的 CTAB法 (张玉刚 等 , 2005) , cDNA的合成参照 SMARTTM PCR cDNA
Synthesis Kit (Clontech, USA) 试剂盒说明。
113　小金海棠消减 cD NA文库的构建
利用抑制性消减杂交的方法构建消减 cDNA文库 (D iatchenko et al. , 1996) , 文库的构建方法参
照 Clontech PCR SelectTM cDNA Subtractive Kit试剂盒说明书进行。以缺铁培养的小金海棠根 cDNA为
试验方 ( tester) , 以正常供铁的小金海棠根 cDNA为驱动方 ( driver) , 经过消减杂交和抑制性 PCR,
正向消减产物克隆到 pGEM 2T载体 , 并转化到大肠杆菌 DH5α。
蓝白斑筛选后的阳性克隆点种于盛有液体 LB培养基的 96孔板中 , 37℃培养过夜后 , 加 15%的
甘油 , 液氮速冻 , - 70℃保菌。
114　差异筛选消减 cD NA文库
差异筛选构建好的消减 cDNA 文库 , 具体方法参照 PCR2select D ifferential Screening ( Clontech,
USA ) 试剂盒说明书。利用试剂盒内巢式引物对挑取的白色菌落进行菌落 PCR。PCR产物一部分进行
琼脂糖凝胶电泳 , 观察插入片段的大小 , 另一部分平行点阵到 4张 12 cm ×8 cm的尼龙膜上。差异筛
选探针用α232 P2dCTP标记。共准备 4个探针 : 未削减 tester探针 (Unsubtracted tester p robe) p12c, 未
削减 driver探针 (Unsubtracted driver p robe) p22c, 正向削减探针 ( Forward2subtracted p robe) pE1, 反
向削减探针 (Reverse2subtracted p robe) pE2。
杂交和洗膜参见 Kong等 (2003) 的方法。
115　差异表达基因测序及序列分析
按照 Clontech公司的 PCR2select D ifferential Screening Kit说明书对差异筛选结果进行归类和分析。
差异筛选的阳性克隆 , 送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果去除载体和引物序列 , 得到每
个克隆的 EST序列。
将所有的 ESTs在 NCB I的网站上 ( http / /www1ncbi1nlm1nih1gov) 进行 BLAST, 参考拟南芥测序
计划 (A rabidopsis sequencing p roject) 的功能分类方法 , 将比对结果 E值低于 1e205的 EST进行功能
分类。
2　结果与分析
211　小金海棠消减 cD NA文库的构建及文库质量分析
抑制性消减杂交后 PCR扩增的正向差减 cDNA与 pGEM 2T Easy载体连接 , 经过蓝白斑筛选后 ,
共挑取白色克隆 1 152个。
利用巢式引物进行菌落 PCR, 可以观察到插入片段大小分布在 300～1 000 bp范围内 (图 1) , 同
试剂盒说明书基本一致 , 符合建库要求。
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　3期 张玉刚等 : 抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因 　
图 1　消减文库部分克隆的 PCR扩增结果
M: DNA marker; 1～11: 随机挑取克隆的 PCR扩增片段。
F ig. 1　PCR am plif ica tion results of som e random ly selected subtracted2library clones
M: DNA marker; Lane 1 - 11: PCR p roducts of some random clones.
212　差异筛选消减小金海棠 cD NA文库
为了进一步筛选真正的差异表达 cDNA , 排除假阳性 , 按照 Clontech公司的 PCR2select D ifferential
Screening Kit试剂盒说明书对构建好的 cDNA文库进行差异筛选。共用未削减 tester、未削减 driver、
正向削减 cDNA和反向消减 cDNA等 4个探针杂交平行点阵的 4张膜 (部分杂交结果见图 2) , 然后按
照试剂盒的标准进行统计。最后 , 从 1 152个克隆中选定了 105个具有差异表达的阳性克隆 ( ESTs)。
图 2　部分克隆差异筛选杂交结果
F ig. 2　Partia l results of d ifferen tia l screen ing subtracted cD NA library
213　小金海棠缺铁诱导相关的 ESTs
将通过筛选消减 cDNA文库得到 105个差异表达的 ESTs序列在 GenBank上 BLAST。与拟南芥、
烟草、番茄、水稻、玉米等同源性较高并且比对结果中 E值低于 1e205的 ESTs视为已知基因 , 共 50
个 (表 1) ; 与其它物种同源性较低 , 既无有意义的蛋白比对结果 , 也无有意义的 DNA比对结果的
ESTs, 所代表的可能是新基因 , 共 32个 ; 另外 23个是与已知 ESTs重复的基因片段。在这 50个已知
基因中 , 包括了一些已经报道的与缺铁胁迫相关的基因 , 如尼克烟酰胺合成酶 (NAS )、甲酸脱氢酶
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( FDH)、S -腺苷甲硫氨酸合成酶 (SAM S ) 和转录因子 M YB 等 , 这在一定程度上说明了所构建的消
减文库的可靠性。
将视为已知基因的 50个 ESTs, 按功能分为 9大类 : 基础代谢、蛋白合成、核酸代谢、金属转
运、膜蛋白、信号转导、转录因子、胁迫应答和未知蛋白 , 如表 1所示 , 这一结果说明 EST所代表
的基因参与到植物细胞生命活动的各个不同方面。在这 9大类 ESTs中 , 参与基础代谢的基因最多 ,
达到 28% , 参与核酸代谢的最少 , 仅占 2%。
表 1　差异表达的 ESTs及其可能编码的蛋白
Table 1　D ifferen tia lly expressed ESTs and puta tive prote in
功能类型
Functional categorization
数量
Count %
推测的蛋白名称
Putative p rotein
基础代谢
Primary metabolism
14 28 S - 腺苷甲硫氨酸合成酶
S2adenosyl2L2methionine
synthetase
甲羟戊酸脱羧酶
Mevalonate disphosphate
decarboxylase
葡萄糖转移酶
Glucosyltransferase
蔗糖合成酶
Sucrose synthase
乙醛酸途径调节基因
Glyoxylate pathway
regulator ( GPR) gene
甲硫氨酸亚砜还原酶
Methionine sulfoxide
reductase
ATP结合蛋白
ATP binding2p rotein ATP结合蛋白ATP binding2p rotein
甲酸脱氢酶
Formate dehydrogenase
( FDH)
辅酶 A还原酶
Coenzyme A
reductase
酰基辅酶 A合成酶
Acyl2coA synthetase 氧化还原酶Oxidoreductase
磷酸核糖转移酶
Phosphoribosylanthranilate
transferase ( PAT1)
天冬酰氨酸合成酶
A sparagine synthetase
蛋白合成
Protein synthesis
9 18 多亚基调节蛋白
Multisubunit regulator
p rotein COP9 (CSN8)
60S核糖体蛋白
60S ribosomal p rotein
18S核糖体 RNA
18S ribosomal
RNA
延伸因子
Elongation factor
23S核糖体大亚基
23S large subunit
ribosomal
26S核糖体大亚基
26S large subunit
ribosomal
氨基肽酶
Am inopep tidase
蛋白酶体α亚基
Proteasome alpha
subunit
核蛋白
Chlorop last ribonucleo
p rotein
核酸代谢
Nucleic acid metabolism
1 2 DNA修复蛋白
RAD23 p rotein
金属转运
Ion transporter
7 14 铜离子结合 /转运蛋白
Copper ion binding or
electron transporter
类金属硫蛋白
Metallothionein2like
p rotein (MT)
类金属硫蛋白
Metallothionein2like
p rotein (MT)
类金属硫蛋白
Metallothionein2like
p rotein (MT)
铜离子结合 /转运蛋白
Copper ion binding or
electron transporter
类金属硫蛋白
Metallothionein2like
p rotein (MT)
尼克烟酰胺合成酶
N icotianam ine
synthase (NAS)
膜蛋白
Membrane p rotein
4 8 质膜嵌入蛋白
Plasma membrane
intrinsic p rotein
富亮氨酸重复跨膜蛋白
Leucine2rich repeat
transmembrane p rotein
类固醇结合膜蛋白
Membrane steroid2
binding p rotein
ATP酶亚基
ATPase subunit
信号转导
Signal transduction
2 4 促分裂原活化蛋白激酶
M itogen2activated
p rotein kinase (MAPK)
钙调素
Calmodulin
转录因子
Transcrip tion factor
2 4 转录因子 Myb
Transcrip tion
factorMyb
转录因子 Myb
Transcrip tion
factorMyb
胁迫应答
Stress response
5 10 山梨醇脱氢酶
Sorbitol dehydrogenase
( SDH3)
成熟诱导蛋白
R ipening2induced
p rotein
富脯氨酸蛋白
Proline2rich
p rotein
热激蛋白
Heat shock
p rotein
超氧化物歧化酶
Superoxide dismutase
( SOD)
未知蛋白
Unknown p rotein
6 12 未知蛋白
Unknown p rotein
未知蛋白
Unknown p rotein
未知蛋白
Unknown p rotein
未知蛋白
Unknown p rotein
未知蛋白 Unknown p rotein 未知蛋白 Unknown p rotein
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　3期 张玉刚等 : 抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因 　
3　讨论
311　抑制性消减杂交分离差异表达基因
小金海棠是铁高效基因型苹果种 , 缺铁胁迫会诱导多少基因的差异表达 , 这些铁高效基因的作用
机制如何 , 目前还没有完全清楚。所以构建一个在缺铁条件下的消减 cDNA文库 , 对大量筛选、克隆
苹果铁高效基因具有重要意义。
抑制性消减杂交是近年来发展起来的一种差减杂交技术 , 用于分离两个 mRNA群体间差异表达
基因。该技术优于其它方法之处在于两种不同接头的设计上 , 通过两轮消减杂交和两次抑制性 PCR,
可以选择性地扩增差异表达的目的 cDNA片段 , 抑制非目的片段的扩增 , 使差异表达基因得到有效的
富集并得以克隆 ( Gao et al. , 2003; Zheng et al. , 2004)。从本试验筛选得到的结果看 , SSH用来分离
差异表达基因还是十分有效的。
312　小金海棠缺铁诱导相关 ESTs功能分析
对获得的 50个已知基因按功能分为 9大类 , 说明当植物受到缺铁胁迫时要涉及大量的基因参与
到各种代谢途径中 , 不仅需要大量的物质和能量代谢 , 还需要信号转导、转录因子等的参与。
在这 50个 ESTs中 , 有的已经报道与缺铁胁迫相关 , 比如 NAS基因在多种植物中已经被克隆到 ,
在禾本科植物中是铁载体麦根酸 (MA ) 合成途径中的关键酶 , 在双子叶植物中被认为是参与了铁运
输的重要酶。日本东京大学 Mori教授实验室研究人员发现在缺铁胁迫条件下甲酸脱氢酶 ( FDH ) 活
性明显增加 ( Suzuki et al. , 1998)。S -腺苷甲硫氨酸合成酶基因 (SAM S ) 和 M YB 在作者实验室已经
克隆得到 , 二者在缺铁的根中均加强表达 (曹冬梅 , 2003; 郭函子 , 2005 )。SAM S可以催化 ATP和
甲硫氨酸合成能与铁结合的尼克酰胺的前体物质 S -腺苷甲硫氨酸 , MYB转录因子则广泛参与植物特
有代谢和发育过程的调节 (Rabinowicz et al. , 1999)。
在筛选得到的 50个 ESTs中 , 参与基础代谢的最多 , 达到 28% , 基础代谢又可以分为糖代谢和
有机酸代谢。蔗糖合成酶、葡萄糖转移酶、磷酸核糖转移酶等参与了糖代谢的过程 ; 有机酸代谢中包
含了甲酸脱氢酶、天冬酰氨酸合成酶、甲羟戊酸脱羧酶等 , 酰基辅酶 A则是糖酵解途径中一种重要
的酶。
当植物的根系受到缺铁胁迫时会影响到根部的呼吸作用 , 为了获得足够的能量 , 需要大量的糖类
和有机酸参与其中 , 以适应缺铁胁迫 , 保障植物体正常的生命活动。Mass等 (1988) 的研究还认为 ,
叶片可以通过韧皮部向根系所运输的蔗糖来调节根系的缺铁反应 , 缺铁时根系所分泌的质子与叶片中
同化物向下运输的量直接相关。
植物在缺铁胁迫下 , 会有一些新的蛋白合成 , 这就会引起合成蛋白的相关基因表达量的增强。核
糖体蛋白是参与组成核蛋白体的成分 , 不同的核糖体蛋白组装成核糖体后在蛋白质的翻译过程中具有
不同的作用。延伸因子是在蛋白质合成过程中将氨酰 tRNA结合于核糖体受体位点所需的分子 , 当其
表达降低时蛋白质的合成速率便相应降低。铜离子结合 /转运蛋白是一种离子转运蛋白 , 在缺铁情况
下表达量增强 , 说明铜离子结合 /转运蛋白也可能参与了铁的转运。
在筛选的结果中 , 类金属硫蛋白出现频率最高 , 这暗示着其在缺铁胁迫中的作用 , 据推测该蛋白
可能参与了铁的转运。通过筛选文库得到了钙调素和蛋白激酶 , 钙调素可以作为一种信号物质 , 蛋白
激酶则是重要的细胞生长信号调节蛋白 , 可将多种信号加以整合 , 起着多种信号共同通路的作用 , 这
说明缺铁胁迫会引起信号的转导 , 从而调控某些基因的表达 , 并进一步引起植物相应生理生化的变化
以适应缺铁的环境。
山梨醇脱氢酶、热激蛋白、成熟诱导蛋白、超氧化物歧化酶以及富脯氨酸蛋白都是胁迫应答基
因 , 这些基因在植物适应逆境活动中起到了重要的作用 , 但是这些基因与缺铁有无直接的相关性 , 目
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前还未见报道。
一般而言 , 植物的抗逆特性是由多基因控制的数量性状 , 其生理生化过程是基因间相互协调作用
的结果 , 在这些基因当中 , 到底哪些起主导作用 , 还需要对其功能做进一步的研究。这些缺铁诱导
ESTs数据的获得 , 为今后克隆铁高效基因打下了良好基础。
References
Cao Dong2mei. 2003. Cloning and exp ression analysis of related genes under Fe2deficiency stress in M alus xiaojinensis [ Ph. D. D issertation ].
Beijing: China Agricultural University: 30 - 38. ( in Chinese)
曹冬梅. 2003. 苹果铁高效基因型生物技术的研究———缺铁胁迫相关基因的克隆和表达分析 [博士学位论文 ]. 北京 : 中国农业大
学 : 30 - 38.
D iatchenko L, Lauau Y F C, Campbell A P, Chenchik A, Moqadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N. , Sverdlov E D, Sile2
bert P D. 1996. Supp ression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue2specific cDNA p robes and li2
braries. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93: 6025 - 6030.
Gao Peng, W ang Guo2ying, Zhao Hu2ji, Fan L i, Tao Ya2zhong. 2003. Isolation and identification of submergence2induced genes in maize ( Zea
m ays) seedlings by supp ression subtractive hybridization. Acta Botanica Sinica, 45 (4) : 479 - 483.
Guo Han2zi. 2005. Identification of induced root p roteins under iron deficiency stress and cloning ofM xSAM S in M alus xiaojinensis [ Ph. D. D is2
sertation ]. Beijing : China Agricultural University: 39 - 61. ( in Chinese)
郭函子. 2005. 缺铁胁迫下小金海棠根特异蛋白的表达鉴定及 M xSAM S基因克隆 [博士学位论文 ]. 北京 : 中国农业大学 : 39 -
61.
Han Zhen2hai, Shen Tsuin, Korcak R F, Baligar V C. 1994a. Screening for iron2efficient species in the genusM alus. Journal of Plant Nutrition,
17: 579 - 592.
Han Zhen2hai, W ang Q ing, Shen Tsuin. 1994b. Comparison of some physiological and biochem ical characteristics between iron2efficient and iron2
inefficient species in the genusM alus. Journal of Plant Nutrition, 17 (7) : 1257 - 1264.
Kong J in, Gong J i2m ing, Zhang Zhi2gang, Zhang J in2song, Chen Shou2yi. 2003. A new AOX homologous gene O sIM 1 from rice ( O ryza sativa
L. ) with an alternative sp licing mechanism under salt stress. Theoretical and App lied Genetics, 107: 326 - 331.
Mass F M, van de W etering D A M, van Beusichem M L. 1988. Characterization of phloem iron and its possible role in the regulation of Fe effi2
ciency reactions. Plant Physiology, 87: 167 - 171.
Rabinowicz P D, B raun E L, Wolfe A D, Bowen B, Grotewold E. 1999. Maize R2R3 M yb genes: Sequence analysis reveals amp lification in the
higher p lants. Genetics, 153: 427 - 444.
Suzuki K, Itai R, Suzuki K, Nakanishi H, N ishizawa N K, Yoshimura E, Mori S. 1998. 8 formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic me2
tabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiology, 116 (2) : 725 - 732.
Zhang Yu2gang, Cheng J ian2hong, Han Zhen2hai, Xu Xue2feng, L i Tian2zhong. 2005. Comparison of methods for total RNA isolation from M alus
xiaojinensis and cDNA LD - PCR amp lification. B iotecnology Bulletin, 177 (4) : 50 - 53. ( in Chinese)
张玉刚 , 成建红 , 韩振海 , 许雪峰 , 李天忠. 2005. 小金海棠总 RNA提取方法比较及 cDNA的 LD - PCR扩增. 生物技术通报 ,
177 (4) : 50 - 53.
Zheng Jun, Zhao J in2feng, Tao Ya2zhong, W ang J ian2hua, L iu Yun2jun, Fu Jun2jie, J in Ying, Gao Peng, Zhang J in2peng, Bai Yun2feng, W ang
Guo2ying. 2004. Isolation and analysis of water stress induced genes in maize seedlings by subtractive PCR and cDNA macroarray. PlantMo2
lecular B iology, 55: 807 - 823.
065