全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 283 - 288
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 21; 修回日期 : 2007 - 02 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30671445)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangt@ cau1edu1cn)
利用 c DNA2AFLP技术研究苹果柱型与非柱型
c DNA的差异表达
朱元娣 1 , 孙凌霞 2 , 李春雨 1 , 张　文 2 , 王　涛 2 3
(1 中国农业大学农学与生物技术学院果树系 , 北京 100094; 2 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 , 北京
100094)
摘 　要 : 以苹果 (M alus ×dom estica Borkh. ) 柱型品种舞姿、非柱型品种富士及其杂交 F1群体中柱型、
非柱型单株为研究试材 , 应用 cDNA2AFLP ( cDNA2amp lified fragment length polymorphism) 技术 , 研究柱型与
非柱型苹果 cDNA的差异表达 , 探讨了苹果柱型基因 Co表达的分子机制。通过 64对引物组合的 cDNA2
AFLP分析获得了 1 630条在柱型与非柱型苹果中差异表达的片段。经过 BSA ( bulked segregant analysis) 分
析和反向 Northern杂交鉴定 , 获得了 11个差异表达的 cDNA片段 , 并进行了克隆、测序和序列同源性检索
分析。有 5个片段在 GenBank数据库中发现同源序列 , 其余的 6个功能未知。核酸和氨基酸比对分析中同
源性最高的是片段 A7和 A16。A7的核苷酸序列同源于红叶石楠 Photin ia fraseri 26S核糖体 RNA (97% )、
蛋白同源于玉米的细胞色素 P450单加氧酶 (91% ) , A16的核苷酸 (85% ) 及蛋白 (93% ) 同源于直果草
属 Triphysaria versicolor的α2expansin 2基因。对 A7、A16两个候选基因片段再进行正向 Northern杂交验证 ,
在富士中表达最强 , 在非柱型后代、柱型后代及舞姿中表达依次减弱。由此推断 , 由细胞色素 P450单加氧
酶基因所调控的赤霉素 GAS变化影响了苹果柱型性状的表达。
关键词 : 苹果 ; 柱型苹果 ; 柱型基因 ; 差异表达分析 ; cDNA2AFLP
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220283206
D ifferentia l Expression Analysis of cDNA Between Columnar and Non2columnar
Apples Using cDNA2AFLP
ZHU Yuan2di1 , SUN L ing2xia1 , L I Chun2yu2 , ZHANG W en2 , and WANG Tao23
(1 College of A gronom y and B iotechnology, China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, China; 2 S tate Key L abora tory forA gro2
B iotechnology, B eijing 100094, China)
Abstract: In order to illustrate the molecular mechanism of Co gene, which controls columnar tree struc2
ture in app le (M a lus ×dom estica Borkh. ) , differential exp ression p rofile of cDNA among the columnar app le
cultivarW altz, the normal cultivar Fuji, and F1 seedlings from the cross of Fuji ×W altz was analyzed through
cDNA2AFLP. Sixty2four pairs of p rimerswere used for the cDNA2AFLP amp lification. Totally 1 630 differenti2
ally exp ressed fragments between columnar and non2columnar app les were detected. Eleven differentially ex2
p ressed fragments were confirmed by bulked segregant analysis (BSA ) and reverse Northern blotting, further
cloned and sequenced. Based on Database search, five cDNA fragments had high homologies to known genes,
while the functions of other six were unknown. According to the alignment of B lastn and B lastx, one differenti2
ally exp ressed fragment, A7, was 97% identical in nucleotides to the 26S ribosomal RNA gene of Photin ia
fraseri and 91% in am ino acids to cytochrome P450 monooxygenase in maize, respectively. Another differenti2
ally exp ressed fragment, A16, was 85% in nucleotides and 93% in am ino acids identical to a lpha2expansin 2
in Triphysaria versicolor. A16 and A7 as the candidate cDNA differential fragments, which may be related to
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tree architectures, were further analyzed by Northern B lotting. The exp ress levels of them were the highest in
Fuji and reduced gradually in the order of the no2columnar gene pool, columnar gene pool and W altz. The re2
sults imp lied that the change of GAS modulated by the cytochrome P450 monooxygenase genes m ight influence
the columnar growth habit.
Key words: App le; Columnar app le; Co gene; D ifferential exp ression analysis; cDNA2AFLP
柱型苹果 ( columnar app le) 是一类自然状态下树体呈柱状生长、独干、新梢节间极紧凑、萌芽
率高而成枝力低的苹果品种 , 包括威赛克 (Mc Intosh W ijcik) 及以威赛克为亲本杂交所选育的芭蕾苹
果 (舞姿、舞乐、舞佳、舞美 ) 的总称 ( Tobutt, 1985; 李光晨和张勇 , 1993; 戴洪义 等 , 2003) ,
是苹果密植栽培的理想树型。柱型苹果品种表现出高的内源 CTK含量及低的赤霉素含量 , 与柱型生
长特性有关 (Looney et al. , 1988; Kelsey & B rown, 1992)。经典遗传学试验以柱型苹果与普通型苹
果为亲本进行杂交 , 一些杂交组合的 F1实生后代中柱型与非柱型单株近于 1∶1分离 , 而其他组合则
表现出偏分离特征 , 由此确认柱型苹果极紧凑的生长特性是受单显性的 Co基因控制 , 一个或几个修
饰基因共同作用 (Lap ins, 1976; Looney & Lane, 1984; Meulenbroek et al. , 1999)。分子遗传学研究
表明 , 柱型 Co基因在苹果遗传连锁图谱的位点不同矮化 Dw基因和控制顶端结果的 Tb基因 (Conner
et al. , 1997) , 但与多个影响树体生长发育的 QTL基因紧密连锁在同一区域 ( Kenis & Keulemans,
2004)。至今 , 柱型基因如何调控柱型性状表达的分子机制尚不清晰。
cDNA2AFLP ( cDNA2amp lified fragment length polymorphism) (Bachem et al. , 1996) 是研究基因差
异表达更直接有效的方法 , 保留了 AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了解序列信息等优点的同时 ,
集中显示基因组表达序列的多态性差异 , 成为基因差异表达显示、表达基因遗传连锁作图和基于表型
克隆基因的常用方法 (祝军 等 , 2000; B rugmans et al. , 2002)。本研究利用 cDNA2AFLP技术 , 以柱
型苹果品种舞姿 (Coco) 和普通型品种富士 ( coco) 及其后代柱型、非柱型实生苗为材料 , 研究两类
树之间基因表达的差异 , 从而初步探讨控制果树柱型生长发育的分子机制。
1　材料与方法
111　材料
试材为柱型苹果品种舞姿 (突变型 )、普通型品种 (野生型 ) 富士 , 以及 ‘富士 ×舞姿 ’杂交
后代的柱型与非柱型实生苗各 15株。分别提取 RNA, 依据集团分离分析 (Bulked segregant analysis
BSA ) 方法 , 分别将非柱型和柱型实生苗后代的 RNA等浓度混合构成野生型基因池 Pw和突变型基因
池 Pm。限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶和 T4 2DNA 连接酶等购自 MB I公司。
112　RNA提取及 cD NA合成
取 2 g苹果幼嫩叶片 , 在液氮中速冻并研磨成粉末 , 悬于 4 mol/L的异硫氰酸胍抽提液中 , 再用
酸性水饱和酚和氯仿抽提后 , 用异丙醇沉淀总 RNA, 最后溶于经 DEPC处理的水中 , - 70℃贮存待
用。分别用甲醛变性胶检测 RNA的质量 , 用分光光度计检测 RNA的质量和浓度。测定 RNA样品的
OD260 /280为 118～211。 cDNA的合成采用 CLONTECH公司 Smart cDNA L ibrary Construction的方法进行。
113　cD NA2AFL P分析
AFLP分析采用 Bachem等 (1998) 的方法稍作改动。所有材料均用等量的 cDNA进行酶切、扩
增 (预扩增和选择性扩增 )、6%聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测。所用的引物和接头如表 1所示。
114　差异片段的二次扩增、纯化及反向 Northern杂交
在染色的胶上找到 DNA差异带 , 在差异带上滴一滴无菌水 , 使干胶润湿 , 用锋利的刀片将差异
带切下 , 置于 50μL无菌水中 , 室温放置过夜。取 5μL上清液做模板 , 用相应的引物进行二次 PCR
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　2期 朱元娣等 : 利用 cDNA2AFLP技术研究苹果柱型与非柱型 cDNA的差异表达 　
扩增。PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳 , 检查扩增情况。如果扩增产物中出现弥散带 , 将主带用小
刀切下 , 采用 DNA快速纯化试剂盒 ( Sangon公司 ) 进行纯化。差异条带再扩增产物在 114%琼脂糖
凝胶电泳 , 然后转于尼龙膜。探针标记按 Promega公司的 Prime2a2Gene Labelling System Kit说明 ,
Northern杂交方法参照萨姆布鲁克和拉塞尔 (2002) 的方法进行。
115　cD NA差异片段的克隆、测序及同源性分析
将表现为阳性的片段与 pGEM 2T ( Promegra) 载体连接 , 并转化到大肠杆菌 DH5α, 筛选阳性克
隆。然后利用 AB I377自动测序仪进行测序 , DNA序列同源性分析是将所得序列提交 GenBank, 利用
BLAST进行序列分析。
116　候选片段的 Northern杂交分析
以候选片段的 cDNA为探针 , 分别与富士、舞姿、柱型基因池和非柱型基因池的总 RNA进行
Northern杂交。
表 1　用于 cD NA2AFL P分析的接头与引物
Table 1　Adaptors and pr im ers used for cD NA2AFL P ana lysis
引物 Primers 序列 Sequence
接头引物 Adap tors M se I 5′2GAC GAT GAG TCC TGA G23′; 3′2TA CTC AGG ACT CAT25′
EcoR I 5′2CTC GTA GAC TGC GTA CC23′; 3′2CTG ACG CAT GGT TAA25′
预扩引物 Primers for the p re2PCR amp lification E0 5′2GAC TGC GTA CCA ATT C23′
M0 5′2GAT GAC TCC TGA GTA A23′
选择性扩增引物 E1 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAA T23′M1 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AG23′
Primers for cDNA2AFLP amp lification E2 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CCT G23′M2 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AC23′
E3 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CGC C23′M3 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AC23′
E4 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CGT G23′M4 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AT23′
E5 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CCG A23′M5 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AA23′
E6 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CCA G23′M6 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AG23′
E7 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CCC A23′M7 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AT23′
E8 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CAT C23′M8 5′2GAT GAC TCC TGA GTA AA23′
2　结果与分析
211　柱型和普通型苹果叶片基因表达的 cD NA2AFL P分析
利用改良的 RNA提取方法 , 分别提取了柱型和非柱型苹果品种及其杂交实生后代的幼嫩叶片的
RNA。RNA的完整性很好 , 25S RNA的提取量约为 18S RNA的 115～2倍 (图 1, 左 )。利用 Smart系
统合成出的 cDNA是一个 300～3 000 bp的弥散条带 , 在舞姿及柱型个体的基因池 ( Pm) 中偶尔有几
条亮带 , 代表个别基因在该样品中表达量较多 (图 1, 中 )。通过对 cDNA进行 AFLP分析 , 预扩增片
段主要分布在 100～500 bp (图 1, 右 )。
图 1　不同表型的树体叶片总 RNA (左 )、dscD NA (中 ) 和 cD NA2AFL P (右 ) 预扩结果
Pw: F1 代非柱型单株构成的基因池 ; Pm: F1 代柱型单株构成的基因池 ; F: 富士 ; W: 舞姿。
F ig. 1　Tota l RNA ( left) , dscD NA ( m iddle) and the pream plif ica tion result of cD NA2AFL P ( r ight)
Pw: Standard F1 seedlings; Pm: Columnar F1 seedlings; F: Fuji; W: W altz.
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　　以 64对选择性扩增引物组合 , 对 4种表现型的 cDNA进行 AFLP分析 , 扩增片段大小主要集中在
100～500 bp之间 , 而且表达模式和表达强度一致 , 表明 cDNA2AFLP扩增的平行性好 , 试验结果有可比
性 (图 2)。对扩增较好的 40对引物进行预扩到选扩的重复 , 统计分析了 1 630条重复性好的扩增片段 ,
获得 19条多态性片段同时在野生型及非柱型基因池表达 , 或同时在突变型及柱型基因池中表达。
图 2　不同引物组合对舞姿 (W )、柱型池 ( Pm )、非柱型池 ( Pw) 和富士 ( F) 的 cD NA2AFL P分析
箭头表示多态性片段。
F ig. 2　cD NA2AFL P expression ana lysis of W a ltz (W ) , columnar gene pool ( Pm ) ,
standard gene pool ( Pw) , and Fuji ( F) using d ifferen t pr im er conb ina tion s
A rrows showed the polymorphic bands.
212　cD NA2AFL P多态性片段的反向 Northern杂交分析
对 cDNA2AFLP分离出的 19条差异片段进行二次扩增及纯化。扩增产物电泳转膜 , 分别以富士、舞
姿的总 RNA做探针标记进行 Northern杂交分析 (图 3) : 在舞姿和富士有差异表达的条带为 11条 , 其中
标号为 3、4、5、9、13和 14的片段在舞姿中特异表达 ; 片段 1在富士中特异表达 ; 在富士表达强而舞
姿表达弱的片段为 7和 16; 在舞姿表达强富士表达弱的为 6和 19, 其余片段在两个品种都表达。
图 3　19条 cD NA2AFL P差异片段的反向 Northern杂交分析
F ig. 3　Reverse Northern blotting ana lysis of 19 polym orph ic bands isola ted from cD NA2AFL P am plif ica tion
213　cD NA差异片段的克隆、测序及同源性分析
将反向 Northern验证后的 11条差异片段与
pGEM2T ( Promegra载体 ) 连接、转化大肠杆菌
DH5α, 进行蓝白斑筛选 , 鉴定阳性克隆 (图 4) ,
并测序。序列在 GenBank中进行同源性序列比较。
在这 11个差异片段中 , 有 5个在 GenBank
图 4　差异片段阳性克隆的酶切鉴定
F ig. 4　 Iden tif ica tion of positive clones of
d ifferen tia lly expressed bands
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　2期 朱元娣等 : 利用 cDNA2AFLP技术研究苹果柱型与非柱型 cDNA的差异表达 　
数据库中发现同源序列 (表 2) , 其余的片段 A1 ( 145 bp )、A4 ( 348 bp )、A5 ( 138 bp )、A6 (295
bp)、A9 (103 bp)、A19 (221 bp) 功能未知。在舞姿中特异表达的 A3和 A13分别与烟草 3 - 脱氧
-磷酸合成酶及拟南芥中准小泡运输蛋白的核苷酸 /氨基酸具有较高的同源性 ; A14则在核苷酸序列
同源于豌豆叶绿体 P700脱辅基蛋白 psaA1和 psaA2基因 , 推测的氨基酸序列同源于蓝藻类光合系统 I
的 PsaB亚基。在富士中表达强而舞姿中表达弱的片段 A7和 A16在 GenBank中检索到高度同源的序
列 , 如 A7的核苷酸序列同源于红叶石楠的 26S核糖体 RNA ( 97% ) , 蛋白同源于玉米中细胞色素
P450单加氧酶 (91% ) ; A16的核苷酸及蛋白同源于直果草属的α2expansin2基因。分析比较柱型及
非柱型苹果的生长特点及内源激素的特性 , A3、A13和 A14这 3个差异片段所推测的生理功能不能
解释树型变异的可能机制 , 而 A7和 A16更具有研究的价值 , 因此将作为候选片段进行验证。
表 2　差异片段的同源性比对结果
Table 2　Hom ology ana lysis of the cD NA2AFL P fragm en ts to sequences in the Da taba ses
片段编号
Code
片段大小
Length ( bp)
B lastn结果
Result of B lastn
B lastx结果
Result of B lastx
A7 249 红叶石楠 26S核糖体 RNA基因
Photin ia fraseri 26S ribosomal RNA gene;
155 /159 = 97%
玉米细胞色素 P450单加氧酶
Cytochrome P450 monooxygenase ( Zea m ays) ;
41 /45 = 91%
A16 224 直果草属α2expansin 2的 TvEXP2克隆
Triphysaria versicolor clone TvEXP2 alpha2expansin 2
mRNA; 108 /126 = 85%
直果草属α2expansin 2
alpha2expansin 2 ( Triphysaria versicolor) ;
40 /43 = 93%
A14 149 豌豆叶绿体 P700脱辅基蛋白 psaA1和 psaA2
P isum ativum chlorop last psaA1 and psaA2 genes
for P700 chlorophyll a2apop roteins; 100 /110 = 90% 蓝藻类光合系统 I反应中心的 p saB亚基p saB subunit of photosystem I reaction center(Cyanophora paradoxa) ; 37 /40 = 92%
A13 229 烟草 3 - 脱氧 - 磷酸合成酶
N icotiana tabacum 32deoxy2D2arabino2 hep tulosonate
72phosphate synthase (DAHP) ; 128 /148 = 86% 3 - 脱氧 - 磷酸合成酶 1Phospho222dehydro232deoxyhep tonate aldolase 1,chlorop last p recursor (DAHP synthetase 1) ; 55 /63 = 87%
A3 284 拟南芥准小泡运输蛋白的 mRNA
A rabidopsis tha liana putative vesicle
transport p rotein mRNA; 65 /77 = 84%
拟南芥准小泡运输蛋白
Putative vesicle transport p rotein
(A rabidopsis tha liana) ; 26 /35 = 74%
214　候选片段 A7、A16正向 Northern杂交分析
以 A7、A16这两个片段为探针分别对舞姿、
富士、柱型基因池和非柱型基因池的 cDNA进行
正向 Northern杂交。结果显示 A7和 A16在富士
表达最强 , 非柱型后代、柱型后代和舞姿中表达
依次减弱 (图 5 ) , 与反向 Northern杂交结果一
致。杂交后代中由柱型个体及非柱型个体所构建
的基因池在杂交表达量上存在差异 , 表明杂交后
代受双亲遗传控制的差异。
图 5　差异表达片段 A7 (上 ) 和 A16 (下 ) 的 Northern杂交分析
W: 舞姿 ; Pm: 柱型基因池 ; Pw: 非柱型基因池 ; F: 富士。
F ig. 5　Northern blotting ana lysis of A7 ( upper) and
A16 ( lower) d ifferen tia lly expressed fragm en ts
W: Waltz; Pm: Columnar gene pool; Pw: Standard gene pool; F: Fuji.
3　讨论
本文通过 cDNA2AFLP技术分析柱型性状相关基因的差异表达 , 获得了 5个有用的 cDNA序列。
A7片段的推定蛋白同源于玉米中细胞色素 P450单加氧酶 , 在富士中表达最强、舞姿中最弱 , 说明在
舞姿中细胞色素 P450单加氧酶表达水平低 , 而细胞色素 P450在植物体内作为赤霉素的合成过程中一
个限速酶在内质网膜上催化内根 - 贝壳杉烯到 GA12 - 醛的合成 , 进而调控赤霉素的合成 (O lszewski
et al. , 2002)。如果某一细胞色素单加氧酶发生了突变或其合成受到抑制 , 将导致赤霉素的含量降
低。与直果草属的α2expansin 2 (膨大素 ) 基因家族有 85%的同源性的 A16基因片段在富士中表达最
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强 , 非柱型后代、柱型后代和舞姿中依次减弱 , 表明果树茎的伸长与某些 expansin基因有关 , 因为植
物中α2expansin可能的功能是控制细胞伸长、细胞壁解体、细胞分离 (Cosgrove, 2000)。在研究深水
水稻中 expansin基因表达时 , 其表达水平与外源赤霉素的施加量成正比关系 , 推测它可能受赤霉素的
调控 (Cho & Kende, 1997)。
拟南芥的突变体 ( fca21) 在开花后植株对外源赤霉素非常敏感 , expansin表达水平比开花时高许
多 , 推测 expansin上游受 GA的调控 (Oka et al. , 2001)。由于某一细胞色素 P450单加氧酶的合成受
到抑制 , 导致赤霉素在第 2个合成途径受到抑制 , 赤霉素又可能调控 expansin基因 , 使柱型果树内
expansin基因含量极少。由此推测 , 细胞色素 P450单加氧酶某一个基因在柱型果树内合成受到抑制
或发生突变 , 影响了苹果柱型基因 Co的差异表达。进一步的研究在于获得 A7和 A16的全长序列 ,
并在普通型苹果中实行转化验证。同时 , 深入研究与烟草 3 -脱氧 - 磷酸合成酶、拟南芥中小泡运输
蛋白 mRNA、和 P700光系统 Ⅱα -无辅基蛋白中的 psaA1和 psaA2基因同源性较高的其余 3个在舞姿
中特异表达片段 , 增强柱型基因调控苹果树形的认识。
References
Bachem C W B, Hoevan R S, B ruijn ZM, V reugdenhilD, Zabeau M, V isser R G F, De B ruijn SM. 1996. V isualization of differential gene ex2
p ression using a novel method of RNA fingerp rinting based on AFLP: analysis of gene exp ression during potato tuber development. Plant Jour2
nal, 9: 745 - 753.
Bachem C W B, Oomen R J F, V isser R G F. 1998. Transcrip t Imaging with cDNA2AFLP: a step by step p rotocol. PlantMolecular B iology Re2
porter, 16: 157 - 173.
B rugmans B, Fernandez del Carmen A, Bachem C W B, van O s H, V isser R G F. 2002. A novel method for the construction of genome wide
transcrip tome map s. Plant Journal, 31: 211 - 222.
Conner P J, B rown S K, W eeden N F. 1997. Random ly amp lified polymorphic DNA2based genetic linkage map s of three app le cultivars. Journal
of the American Society for Horticultural Science, 122: 350 - 355.
Cho H T, Kende H. 1997. Exp ression of expansin genes is correlated with growth in deepwater rice. The Plant Cell, 9: 1661 - 1671.
Cosgrove D J. 2000. New genes and new biological roles for expansins. Current Op inion in Plant B iology, 3: 73 - 78.
Dai Hong2yi, W ang Cai2hong, Chi B in, Zhu Jun, W ang Ran, L i Gui2xue, ZhuangL i2li. 2003. Report on breeding cloumar app le varieties. Jour2
nal of Fruit Science, 20: 79 - 83. ( in Chinese)
戴洪义 , 王彩虹 , 迟　斌 , 祝　军 , 王　然 , 李贵学 , 庄丽丽. 2003. 柱型苹果品种选育研究. 果树学报 , 20: 79 - 83.
Kelsey D F, B rown S K. 1992. ‘McIntosh W ijcik’: a columnar mutation ofMcIntosh app le p roving useful in physiology and breeding research.
Fruit Variety Journal, 46: 83 - 87.
Kenis K, Keulemans J. 2004. QTL analysis of growth characteristics in app le. Acta Horticulturae, 663: 369 - 374.
Lap ins K O. 1976. Inheritance of compact growth type in app le. Journal of American Society for Horticultural Science, 101: 133 - 135.
L i Guang2chen, Zhang Yong. 1993. Ballerina app le. Beijng: China Agricultural University Press: 1 - 15. ( in Chinese)
李光晨 , 张　勇. 1993. 芭蕾苹果. 北京 : 中国农业大学出版社 : 1 - 15.
Looney N E, Lane W D. 1984. Spur2type growth mutants of McIntosh app le: a review of their genetics, physiology and field performance. Acta
Horticulturae, 146: 31 - 46.
Looney N E, Taylor J S, Pharis R P. 1988. Relationship of endogenous gibberellin and cytokinin levels in shoot tip s to ap ical form in four strains
of Mc Intosh app le. Journal of American Society for Horticultural Science, 113: 395 - 398.
Meulenbroek B, Verhaegh J, Janse J. 1999. Inheritance studies with columnar type trees. Acta Horticulture, 484: 255 - 259.
Oka M, Tasaka Y, Iwabuchi M, M ino M. 2001. Elevated sensitivity to gibberellin by vernalization in the vegetative rosette p lants of Eustom a
grandif lorum and A rabidopsis tha liana. Plant Science, 160: 1237 - 1245.
O lszewski N, Sun T, Gubler F. 2002. Gibberellin signaling: B iosynthesis, catabolism, and response pathways. The Plant Cell, 5: 523 - 530.
Sambrook J, Russell D W. 2002. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd. Huang Pei2tang trans. Beijing: Science Press: 549 - 552. ( in Chinese)
J萨姆布鲁克 , D W 拉塞尔. 2002. 分子克隆实验指南. 第 2版. 黄培堂译. 北京 : 科学出版社 : 549 - 552.
Tobutt K R. 1985. B reeding columnar app les at EastMalling. Acta Horticulturae, 159: 63 - 68.
Zhu Jun, L i Guang2chen, W ang Tao, ZhangW en, Zhao Yu2jun. 2000. AFLP polymorphism between Mc Intosh and W ijcik columnar app le. Acta
Horticulturae Sinica, 27 (6) : 447 - 448. ( in Chinese)
祝　军 , 李光晨 , 王　涛 , 张　文 , 赵玉军. 2000. 威赛克柱型苹果与旭的 AFLP多态性研究. 园艺学报 , 27 (6) : 447 - 448.
882