全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 33～37
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 12; 修回日期 : 2005 - 09 - 13
基金项目 : 河北省自然科学基金项目 (C2004000368) ; 河北农业大学博士、引进人才启动基金资助项目
苹果不同继代次数的茎尖组培苗同工酶酶谱及 RAPD
分析
杜国强 1 　师校欣 1 　张庆良 2 　马宝 1
(1 河北农业大学园艺学院 , 保定 071001; 2 河北省农林科学院棉花研究所 , 石家庄 050051)
摘 　要 : 分别对不同继代次数 (3～90代 ) ‘富士 ’、‘金冠 ’、‘乔纳金 ’苹果组培苗进行 POX、EST、
AMY同工酶分析。结果表明 , 同一品种不同继代次数处理间均有一致的酶带谱型。利用超薄层等电聚焦电
泳根据 POX酶蛋白 p I的差异可区分金冠和乔纳金两品种 , 同一品种不同继代次数的组培苗之间 p I相同 ,
组培过程未对 POX酶蛋白 p I产生影响。利用 25个随机引物对不同继代次数的苹果组培继代苗进行了
RAPD分析 , 其特征带型表现一致 , 未发现变异。说明苹果茎尖离体继代培养 90次以内具有较高的遗传稳
定性。
关键词 : 苹果 ; 组织培养苗 ; 遗传变异 ; 同工酶酶谱 ; RAPD
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120033205
Isozym e Pa ttern s and RAPD Ana lysis of Apple Plan tlets Repea tedly Subcul2
tured in V itro
Du Guoqiang1 , Shi Xiaoxin1 , Zhang Q ingliang2 , and Ma Baokun1
(1 College of Horticulture, A gricultural U niversity of Hebei, B aod ing 071001, China; 2 Cotton Research Institu te, Hebei A cadem y
of A griculture and Forestry Sciences, Sh ijiazhuang 050051, Ch ina)
Abstract: The genetic stability of app le p lantlets repeatedly subcultured in vitro for three to ninety times
was exam ined by analysis of isozyme patterns of POX, EST and AMY, as well as RAPD. The results showed
that there were clear difference in POX, EST, and AMY isozyme patterns among varieties, but there was no
detetable difference in the same varietieswith different times of subculturing. The POX isozyme was further an2
alyzed by using IEF electrophoresis. It was easy to distinguish between genotypes ( i1e. ‘Golden Delicious’
vs. ‘Jonagold’) according to the p I of POX isozyme. However, no difference was found in the same varieties
with different times of subculturing. RAPD analysis with twenty2five 102mer arbitrary p rimers revealed identi2
cal bands for p lantlets with different times of subculturing within a variety. Our results indicated that genetic
stability of app le p lantlets was maintained even after repeatedly subcultured in vitro for up to ninety times.
Key words: App le; Tissue culture seedling; Genetic variation; Isozyme patterns; RAPD
苹果茎尖离体培养是快速繁殖无性系的有效方法 , 比传统的嫁接、扦插、压条等繁殖方法快万倍
到数十万倍。但由于茎尖在离体条件下长期使用生长调节剂 , 使生长点分生组织一直处于不断分化的
活跃状态 , 是否会增加变异机率 , 经过多代繁殖的组培苗是否仍然保持原有品种的遗传性状 , 这关系
到组培快繁技术的实用化问题。前人的研究表明果树组培苗遗传稳定性受基因型、继代培养次数、培
养条件 (如生长调节剂的应用 ) 等因素的影响〔1～3〕, 如香蕉茎尖快繁后代存在一定比例的表现型变
异 , 变异率随继代次数的增加而增加〔2, 3〕。从生长与结果习性及孢粉学特征方面已有报道证实苹果茎
尖组培苗保持了原有品种的特性〔4〕。本文对苹果不同代数茎尖组培苗进行同工酶酶谱及 RAPD分析 ,
对其遗传稳定性进行评价 , 以期为苹果无病毒工厂化育苗提供理论基础。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
111　试材
试材为苹果 (M alus dom estica Borkh. ) 脱病毒茎尖组培试管苗 , 富士品种继代次数分别为 3、9、
60、90代 ; 金冠品种为 3、9、40、78代 ; 乔纳金品种为 3、9、45、78代。每代选取培养 25～30 d
的组培苗 30株作为样品。
112　同工酶分析
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 : 采用不连续系统凝胶电泳 , 浓缩胶浓度 315% (pH 617) ; 分离胶
浓度 715% (pH 819)。电极液选用 pH 813 Tris/甘氨酸缓冲液。取组培苗幼叶 012 g, 加入 1 mL提取
液 ( Tris2HCl, pH 810, 015 mmol·L - 1蔗糖 , 1% PVP) , 冰浴研磨 , 8 000 r·m in - 1离心 10 m in, 取上
清液点样。采用稳流电泳 , 起始电泳每样孔电流 1 mA, 当前沿指示剂 (012%百里溴酚蓝数滴电泳前
加入电极缓冲液 ) 走出分离胶时 , 每样孔电流加大到 2 mA, 溴酚蓝走到距胶板底部 1 cm处时停止电
泳 , 立即剥胶、染色〔5, 6〕。检测 POX、EST和 AMY。
水平板超薄等电聚焦电泳 : 凝胶液中含 Acr + B is 210 mL, Ampholine 016 mL, ddH2 O 514 mL、
TEMED 10μL、过硫酸铵 (10% ) 60μL, 凝胶厚度为 015 mm。取组培苗幼叶 012 g, 加入 1 mL重蒸
馏水 , 冰浴研磨 , 8 000 r·m in - 1离心 10 m in, 取上清液点样。阴极为 NaOH 1 mol·L - 1、阳极为 015
mol·L - 1磷酸。先预电泳 30 m in (稳压 60 V) , 点样后 , 稳压 100 V 15 m in, 然后稳流 15 mA (每样
点 1 mA) , 当电压升至 500 V时 , 去掉点样纸 , 调电压至 650 V , 稳压电泳直至电流降到 012 mA , 停
止电泳。醋酸联苯胺法染色。
113　RAPD分析
采用改良 CTAB法提取组培苗幼叶 DNA〔7〕。PCR反应物体积为 20μL, 内含缓冲液 ( Tris2HCl 10
mmol·L - 1 , KCl 50 mmol·L - 1 , 011% Triton X2100) , MgCl2 212 mmol·L - 1 , dNTP 012 mmol·L - 1 ,
115 unit Taq酶 , 012μmol·L - 1随机引物 , 50 ng样品 DNA。PCR反应条件 : 先 94℃ 5 m in, 冰浴 1
m in, 再 94℃ 50 s, 40℃ 90 s, 72℃ 60 s, 进行 35个循环 , 最后 72℃ 10 m in。产物于 019%琼脂糖凝
胶、1倍 TAE电极缓冲液条件下电泳分离 , 溴化乙锭染色 , 紫外观察并照像分析。
随机引物为 Operon公司生产的 A组系列中筛选出的 12个引物 (A01、A02、A03、A04、A05、
A06、A07、A08、A09、A11、A18和 A20) 和上海生工生物工程公司生产的 48个随机引物中筛选出的
13个引物 ( S12、S25、S48、S114、S301、S303、S304、S329、S368、S376、S379、S380、S445)。
2　结果与分析
211　组培微繁后代同工酶谱带差异
21111　垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 　对金冠、富士、乔纳金 3个品种不同继代次数组培苗的
POX、EST和 AMY进行了垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明 , POX酶谱可分为两个区 , 即快速
区 (Rf > 0140) 和慢速区 (Rf < 0140)。金冠品种共有 13条酶带 , 其中慢速区 6条 , 快速区 7条 ; 富
士在慢速区多出 1条 Rf = 013921的酶带 , 共 14条 ; 乔纳金慢速区也有 7条酶带 , 在快速区多出两
条 , Rf值分别为 015018和 016071, 共 16条酶带 (图 1)。依此可以将这 3个苹果品种区分开来。
EST谱带 Rf值在 0120～0140之间 , 分布较集中。其中金冠有 4条酶带 , 而富士有 3条酶带 , 少
了 1条 Rf = 012675的慢速酶带 , 乔纳金则少了两条快速酶带 , Rf分别为 013465和 013860, 共两条酶
带 (图略 )。依此亦可将这 3个苹果品种区分开。
AMY酶谱亦分为快速区 (Rf > 0150) 和慢速区 (Rf < 0150)。在快速区 , 金冠、富士、乔纳金都
只有 1条酶带 ; 在慢速区 , 金冠、乔纳金有两条酶带 , 而富士有 4条酶带 (图略 )。依此同工酶酶谱
只能将富士与金冠、乔纳金区分开 , 不能区分金冠和乔纳金。
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　1期 杜国强等 : 苹果不同继代次数的茎尖组培苗同工酶酶谱及 PAPD分析 　
这 3种同工酶酶谱在同一品种、不同继代次数的组培苗中均具有相同的酶谱 , 说明组培快繁未引
起其变化。
图 1　不同继代次数组培后代 PO X电泳图谱
F ig. 1　 Isozym e pa ttern s of PO X w ith d ifferen t subculture stages of m icropropaga tion
21112　水平板超薄等电聚焦电泳分析 　等电聚焦电泳是在 1个连续线性稳定的 pH梯度场内根据蛋
白质的等电点 (p I值 ) 的不同而将其分离的方法 , 其分辨率较高。本试验采用超薄层水平板等电聚
焦电泳研究了苹果茎尖组培后代的 POX酶谱特征 (图 2) , 结果表明 , 供试乔纳金和金冠两个品种具
有不同 p I值的 POX酶蛋白组成 , 其中乔纳金表现出较多的谱带 , 分析与其为三倍体、遗传背景更复
杂有关。依据 p I值为 4162酶带的有无可以准确地区分这两个苹果品种。在同一品种中不同继代次数
组培苗的酶谱表现一致 , 表明组培过程并未引起此种酶蛋白等电点发生变化 , 即酶蛋白结构稳定。
图 2　不同继代次数组培后代 PO X等电聚焦电泳分析
F ig. 2　The IEF electrophoresis ana lysis of PO X isozym e w ith d ifferen t subculture stages of m icropropaga tion
212　组培微繁后代 RAPD分析
本试验利用经过筛选的 25个随机引物对不同继代次数的苹果组培苗进行了 RAPD分析 (表 1) ,
每种引物都产生了清晰的扩增谱带。用 A01、S25、S301、S376引物可以将这 3个品种区分 (图 3) ,
其余的引物品种间则表现相同的谱带。相同引物在同一品种、不同继代次数处理中具有相同的带型。
　　　
表 1　不同继代次数的苹果继代苗 RAPD反应所产生的扩增带数
Table 1　Num ber of bands crea ted by RAPD reaction in subcultured plan tlets in apple
引物
Primers
扩增带数 Number of bands
富士
Fuji
金冠
Golden Delicious
乔纳金
Jonagold
引物
Primers
扩增带数 Number of bands
富士
Fuji
金冠
Golden Delicious
乔纳金
Jonagold
引物
Primers
扩增带数 Number of bands
富士
Fuji
金冠
Golden Delicious
乔纳金
Jonagold
A01 6 7 8 A11 7 7 7 S304 2 2 2
A02 5 5 5 A18 9 9 9 S329 2 2 2
A03 4 4 4 A20 6 6 6 S368 2 2 4
A04 5 5 5 S12 1 1 2 S376 3 1 2
A05 5 5 5 S25 2 2 1 S379 3 3 3
A06 4 4 4 S48 3 3 3 S380 1 1 1
A07 3 3 3 S114 2 2 2 S445 2 2 2
A08 3 3 3 S301 3 1 2
A09 5 5 5 S303 4 3 4
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表明在所检测的范围内多代增殖培养未对苹果碱
基序列产生影响。
3　讨论
酶蛋白多肽链的结构差异 , 取决于 DNA分子
核苷酸的排列顺序 , 基因结构的差异是产生同工
酶的主要原因 , 而同工酶酶谱则是基因在代谢水
平上的表型。因此 , 利用同工酶分析可以比较直
接地判断基因的存在及其突变。薛其清等研究发
现 , 甘蔗亚无性系形态性状的变异与同工酶的变
异有一定关系 , 在供试的亚无性系群体中 , POX
的变异一般表现为酶带数的增加 , 且与茎径和茎
数 /丛的变异呈正相关〔8〕。Kongkiatngam等利用同
工酶标记分析了红花三叶草 (Trifolium pratense L. )
图 3　苹果组培继代苗 RAPD反应
引 物 : A01; M: H ind III + EcoR I; A: 金冠 78代 ; B: 金冠 9代 ;
C: 富士 90代 ; D: 金冠 3代 ; E: 乔纳金 9代。
F ig. 3　RAPD ana lysis of subcultured plan tlets in apple
Primer: A01; M: HindIII + EcoR I; A: Golden Delicious subcultured
for 78 times; B: Golden Delicious subcultured for 9 times; C: Fuji
subcultured for 90 times; D: Golden Delicious subcultured
for 3 times; E: Jonagold subcultured for 9 times.
品种内部的变异情况 , 认为相对于形态指标来说 , 同工酶是更有用的植物遗传基因标记〔9〕。许多学
者认为同工酶是在分子水平上研究遗传变异及居群遗传结构最经济有效的方法。本研究对不同继代次
数的苹果微繁苗进行了 POX、EST和 AMY同工酶酶谱分析及 POX酶蛋白 p I的比较 , 结果未发现微
繁过程对上述性状产生影响 , 一定程度上说明苹果茎尖微繁后代保持了原有品种的特性。
Deng等对柠檬的 14个田间品种和 1个离体培养变异品种进行了 RAPD分析 , 可依其特征带将它
们区分开来〔10〕。Kongkiatngam利用 RAPD分析对红花三叶草品种内变异情况进行了估计 , 发现有较
高的变异率〔9〕。Angel等通过对经离体保存 10年的木薯 (Cassva) 继代苗和田间保存材料进行 RAPD
分析 , 认为木薯茎尖离体培养保持了原有种质特性〔11〕。果树组织与细胞培养中常有体细胞无性系变
异发生 , 多与树种种类、外植体材料类型、培养基植物生长调节剂种类与浓度、继代次数等因素有
关〔2〕。苹果叶片离体再生植株出现变异类型〔12, 13〕, 但有关苹果茎尖组培后代无性系变异分子标记情
况尚未见报道。本试验对不同继代次数的苹果组培苗的 RAPD反应结果表明 , 不同继代处理间具有一
致的特征带型 , 进一步支持了关于苹果茎尖组培苗后代遗传稳定性的观点。
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收稿日期 : 2005 - 09 - 01; 修回日期 : 2005 - 12 - 13
基金项目 : 湖南省科学技术厅资助项目 (04JT2001)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xiongxingyao@1261com)
超临界 CO2 萃取技术提取刺葡萄籽油的工艺研究
欧阳建文 1 　王仁才 1 　王辉宪 2 　熊兴耀 13 　 (1 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128; 2 湖南农业
大学理学院 , 长沙 410128)
Study on the Extract Process of Grape ( V itis david ii Foёx. ) Seed O il w ith
Supercr itica l CO2 Extraction
Ouyang J ianwen1 , W ang Rencai1 , W ang Huixian2 , and Xiong Xingyao13 ( 1 Horticu lture and Landscape College,
Hunan A gricu ltura l U niversity, Changsha 410128, Ch ina; 2 College of Science, Hunan A gricu ltura l U niversity, Changsha
410128, Ch ina)
关键词 : 超临界 CO2 ; 萃取 ; 刺葡萄籽油
中图分类号 : S 66311　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120037201
近年来 , 葡萄籽中不饱和脂肪酸和原花青素等生物活性物质的开发利用已受到国内外广泛重视 , 葡萄籽提取物等
功能性保健食品受到普遍欢迎。刺葡萄产量高 , 抗性强 , 但果粒小 , 果皮厚 , 种籽多 , 种籽占整粒葡萄的 4% ～6% ,
特别适合于加工制汁及天然生物活性物质的开发 , 但是至今尚未见到有关的研究报道。
超临界 CO2 萃取技术是近年来迅速兴起的化工分离新技术 , 在食品、香料、医药、化工等领域得到了广泛应用
(欧阳建文 , 2004)。萃取猕猴桃籽油 (杨柏崇 , 2003)、葡萄籽油 (唐韶坤 , 2004)、玉米胚芽油 (葛保胜 , 2002)
等已有较多报道 , 但在萃取刺葡萄籽油方面尚未见报道。本文对此简要报道。
试验用的刺葡萄为湖南农业大学等单位从野生资源中选育出的刺葡萄新品种 ———紫秋 , 种植在湖南省怀化市芷江
县山区。果实榨汁后的残渣去除果皮等杂质后得到种籽 ; 于 40～45℃烘箱中将种籽烘干 , 粉碎至 30～40目 , 用超临
界 CO2 萃取装置 (江苏南通华安超临界萃取有限公司生产 , HA221250206型 ) 研究刺葡萄籽油的提取工艺。以萃取温
度 (35、40、45、50℃) , 萃取压力 (15、20、25、30MPa) , 分离温度 (35、40、45、50℃) , 分离压力 (6、8、10、
12MPa) , 萃取时间 (40、50、60、70 m in) 为变量 , 进行 L16 (45 ) 的正交试验 , 每次装料 200 g, 以萃取率和油质为
考察指标 , 探讨超临界 CO2 萃取技术萃取刺葡萄籽油的工艺参数。
正交试验极差分析表明 , 萃取压力和分离压力是影响萃取的两个关键因素。最佳萃取组合为萃取压力 30 MPa,
萃取温度 50℃, 分离温度 35℃, 分离压力 10 MPa, 萃取时间 60 m in, 在此条件下萃取率为 1313%。刺葡萄籽油颜色
为淡黄色 , 澄清透明 , 无杂质 , 无溶剂残留 , 气味芳香。经湖南省疾病预防控制中心检验 , 刺葡萄籽油各理化指标、
微生物指标、急性经口毒性试验均符合有关标准要求。
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