全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1345～1348
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 12 - 19; 修回日期 : 2006 - 04 - 13
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30500343)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
白菜 GLDH基因 cDNA的克隆及序列分析
任锡亮 1 　侯喜林 1, 23 　李　英 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 江苏南京 210095; 2 南京农业大学园艺学院 , 江苏南京
210095)
摘 　要 : 以白菜品种 ‘苏州青 ’ cDNA为模板 , 采用 RT2PCR、巢式 PCR、3’RACE和 5’RACE技
术 , 获得了 L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯脱氢酶 ( EC 1131213, GLDH ) 基因 cDNA 2 034 bp全长序列。序列
分析表明 , GLDH基因 cDNA序列编码 601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜 GLDH基因具有 98%的同源
性 , 与拟南芥 GLDH基因具有 90%的同源性。该基因在 GenBank中登录号为 AY899298。
关键词 : 白菜 ; L -抗坏血酸 ; L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯脱氢酶
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621345204
M olecular C lon ing and Sequence Ana lysis of GLDH Gene cD NA from
B rassica cam pestris ssp. ch inensis
Ren Xiliang1 , Hou Xilin1, 23 , and L i Ying2
(1N ationa l Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N anjing, J iangsu 210095, China; 2 College of Horti2
cu lture, N anjing A gricultural U niversity, N anjing, J iangsu 210095, Ch ina)
Abstract: The L2galactono21, 42lactone dehydrogenase ( EC 1131213, GLDH ) is a key enzyme that
catalyzes the final step in the L2ascorbic acid synthetic pathway of p lants. GLDH gene cDNA sequence was
cloned with cDNA isolated from B rassica cam pestris ssp. ch inensis‘Suzhouqing’. A 2 034 bp full2length cD2
NA sequence of GLDH was obtained using RT2PCR, nested PCR, 3’RACE and 5’RACE techniques.
Further analysis on GLDH gene cDNA indicated that it encoded a pep tide containing 601 am ino acids. The
am ino acid sequence comparison with B rassica oleracea GLDH gene and A rabidopsis tha liana GLDH gene
showed that identity was 98% and 90% , respectively. The sequence was accep ted and released by GenBank
(Accession number AY899298).
Key words: B rassica cam pestris ssp. ch inensis Makino; L2ascorbic acid; L2galactono21, 42lactone de2
hydrogenase
1　目的、材料与方法
植物通过 L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯脱氢酶 ( GLDH, EC 1131213) 将 L -半乳糖酸 - 1, 4 -内酯
转变成 L -抗坏血酸 , GLDH是这一合成途径的关键酶 , GLDH基因的表达水平决定了抗坏血酸含量
的高低〔1〕。目前已从花椰菜、马铃薯、烟草、刺梨、甜瓜、番茄、辣椒、草莓、拟南芥〔2〕等植物中
克隆了编码该酶的基因。本研究克隆了白菜的 GLDH基因 cDNA, 为进一步研究其活性和表达的变化 ,
利用基因工程提高白菜抗坏血酸含量 , 提高其对氧化胁迫逆境适应能力奠定基础。
试材为白菜常规品种 ‘苏州青 ’ (B rassica cam pestris ssp. ch inensis‘Suzhouqing’) , 由南京农业大
学白菜课题组提供。AMV反转录酶、3’2Full RACE Core Set、pMD182T Vector、Taq酶均为 TaKaRa公
司产品 , JM109为本实验室保存。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
参照已发表的花椰菜 GLDH基因 cDNA序列 (登录号 : Z97060) 设计两条特异引物 SP: 5pi2TTCGCT2
GGCTCAGGTTTC23pi, AP: 5pi2GCTCCCTTCGTGCTTTGT23pi用于 RT2PCR扩增。根据 RT2PCR扩增产物的测
序结果设计 3piRACE上游两条嵌套引物 RACE21: 5pi2TGGTGGTCAACAGTGGGT23pi和 RACE22: 5pi2ACCAG2
CACCTTCTCCAATA23pi。设计 F1: 5pi2TGCCAATCACTTGCTCATC23pi, F2: 5pi2GCTGCTGAACCCTAATCCC2
3pi, F3: 5pi2CCTTGACGAGAGCTTCGAGAT23pi3条嵌套引物 , 并参照 Invitrogen公司的 5piRACE试剂盒原理
合成 两 条 锚 定 引 物 AAP: 5pi2GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG23pi, AUAP: 5pi2GGC2
CACGCGTCGACTAGTAC23pi用于扩增 GLDH基因的 5pi末端。RT反应参照 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV )
Ver1310试剂盒说明书进行。3piRACE和 5piRACE分别参照 TaKaRa公司的 3piRACE试剂盒说明书和 Invitro2
gen公司的试剂盒说明书进行。PCR扩增条件为 : 94℃ 3 m in, 1个循环 ; 94℃ 30 s, 55℃ 1 m in, 72℃ 1
m in 30 s, 30个循环 ; 72℃ 10 m in; 4℃保存。PCR法鉴定的阳性克隆由 Invitrogen公司测序。测序结果用
DNAman软件进行氨基酸多重序列比对分析 , 用 PROSITE、M itoProt、TMHMM、SMART、PSORT等程序
进行蛋白质二级结构和功能预测。
2　结果分析与讨论
211　白菜 GLD H 基因 cD NA的 RT2PCR扩增
以 ‘苏州青 ’总 RNA反转录的单链 cDNA为模板 , 利用一对特异引物 SP和 AP进行 PCR扩
增 , 扩增出了一条约 1 800 bp的条带 (图 1, A )。蓝白斑筛选后 , 以阳性重组质粒 DNA为模板 ,
以相同的引物在同样的条件下进行 PCR 扩增 , 可以看出重组质粒 PCR产物与目的片段大小相符
(图 1, B )。
图 1　RT2PCR及其产物重组质粒的 PCR分析
M: TaKaRa DL 2000 marker; A (1) : GLDH特异片段的电泳检测结果 ; B (1, 2, 3) : RT2PCR产物重组质粒的 PCR结果。
F ig. 1　Electrophoresis results of GLDH gene RT2PCR products and recom b inan t pla sm ids
M: TaKaRa DL 2000 marker; A (1) : Electrophoresis of GLDH gene fragment;
B (1, 2, 3) : PCR analysis of the RT2PCR recombinant p lasm ids.
212　白菜 GLD H 基因 cD NA 3’RACE和 5’RACE扩增
根据 RT2PCR产物测序结果设计的两条正向嵌套引物 RACE21和 RACE22分别用于 3’端第一轮和
第二轮 PCR扩增。3’RACE首轮扩增没有明显的特异条带出现 (图 2, A , 1) , 用内侧引物对首轮扩
增产物进行巢式 PCR扩增 , 得到 1条约 600 bp的特异条带 (图 2, A, 2) , 与期望值相符。用引物
F1反转录合成 cDNA第一条链后 , 再分别用引物 AAP、F2和 AUAP、F3进行 5’RACE首轮和巢式
PCR扩增。从图 2可以看出 5’RACE首轮也没有扩增出明显的特异条带 (图 2, C, 1) , 第二轮扩增
出 1条约 500 bp的特异条带 (图 2, C, 2)。从图 2, B和图 2, D中可以看出 , 3’RACE与 5’RACE
重组质粒 PCR扩增产物分别与目的片段大小相同 , 表明目的片段已克隆成功。
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　6期 任锡亮等 : 白菜 CLDH基因 cDNA的克隆及序列分析 　
图 2　3’RACE和 5’RACE PCR扩增及其重组质粒的 PCR分析
M: TaKaRa DL 2000 marker; A (1) : 3’RACE第一轮扩增结果 ; A (2) : 3’RACE巢式 PCR扩增产物 ;
B (1, 2, 3, 4) : 3’RACE巢式 PCR重组质粒的 PCR结果 ; C (1) : 5’RACE第 1轮扩增结果 ;
C (2) : 5’RACE巢式 PCR扩增产物 ; D (1, 2, 3) : 5’RACE巢式 PCR重组质粒的 PCR结果。
F ig. 2　Electrophoresis results of GLDH gene 3’RACE, 5’RACE PCR products and recom b inan t pla sm ids
M: TaKaRa DL 2000 marker; A (1) : Electrophoresis of the p rimary amp lification result of 3’RACE; A (2) : The nested PCR
p roduct of 3’RACE; B (1, 2, 3, 4) : PCR analysis of the nested PCR p roduct of 3’RACE recombinant p lasm ids;
C (1) : Electrophoresis of the p rimary amp lification result of 5’RACE; C (2) : The nested PCR p roduct of 5’RACE;
D (1, 2, 3) : PCR analysis of the nested PCR p roduct of 5’RACE recombinant p lasm ids.
213　GLD H 基因 cD NA全长序列分析
RT2PCR和 3’RACE、5’RACE巢式 PCR扩增产物的阳性克隆并经过双向测序 , RT2PCR获得了 1
779 bp的片段 , 3’RACE巢式 PCR扩增产物为 622 bp, 5’RACE巢式 PCR扩增产物为 453 bp。将 3
段序列拼接 , 获得的白菜 GLDH基因 cDNA全长 2 034 bp。将该 cDNA序列提交 GenBank, 登录号为
AY899298。利用 NCB I站点的 ORF finder进行分析发现 , 该 cDNA包含一完整开放阅读框 ( 25～1
828) , 编码 601个氨基酸。启始密码子 ATG的 23位为 A符合 Kozak规律 , 在 3’poly (A) +区之前 25
bp有一 AATAAA加尾信号 , 这些都符合有效翻译的基因全长 cDNA的特征。该基因含有 24 bp的 5’
非编码区和 203 bp的 3’非编码区 , 推测的 GLDH分子量为 67 921 Da, 等电点为 8166。
经 BLAST分析 , 白菜 GLDH基因 cDNA序列与花椰菜 GLDH基因的同源性高达 95% , 与拟南芥
为 89% , 与刺梨为 82% , 与草莓和辣椒为 81% , 与马铃薯、甜瓜、番茄为 80% , 与烟草为 79%。
214　推测的氨基酸序列分析
白菜 GLDH的氨基酸序列与花椰菜的同源性最高 , 达到 98% , 与拟南芥的同源性为 90% , 与甜
瓜、草莓、刺梨的同源性为 78% , 与辣椒、番茄、马铃薯和烟草的同源性为 76% (图 3)。
通过 PROSITE数据库比较 , 发现白菜的 GLDH具有以下可能的基序 : 1个脯氨酸富集区 ( 19～
46) , 1个依赖于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位点 (8 RRSS) , 1个 N端糖基化位点 (105 NW SG) ,
8个蛋白激酶 C磷酸化位点 (15 SlR, 52 SeK, 205 SiR, 305 TnK, 366 SsK, 367 SkK, 451 SmK, 481 TgR ) , 13个酪蛋白
激酶 Ⅱ磷 酸 化 位 点 (50 SasE, 52 SekE, 122 TlaD, 205 SirE, 290 StlE, 291 TleE, 342 TtdE, 382 SftE, 451 SmkD ,
474 Sp iE, 493StaE , 494 TaeD , 540 SayE) , 4个 N 端酰基化位点 (146 GL spNG, 151 GiglSR, 153 GL srSG, 218 GahgTG)。
TMHMM分析发现白菜 GLDH具有与拟南芥相似的跨膜结构域〔2〕。PSORT程序预测白菜 GLDH位于
线粒体内膜上 , 这与前人的报道〔3〕相符合。通过 M itoProt分析 , 发现线粒体靶缩氨酸的剪切位点位于
N端 37位。利用 SMART分析蛋白质结构 , 发现 N端 114～249位点是黄素腺嘌呤二核苷酸 ( FAD )
结合结构域 , 该结构域保守性很高 , 在拟南芥、花椰菜、烟草、甜瓜、马铃薯、草莓等推测的氨基酸
序列中也都存在 , 表明黄素基团可能参与 GLDH催化的反应〔2〕。
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图 3　不同植物 GLD H 氨基酸序列同源性比较
黑色方框 (黑底白字 ) 代表各序列中相同的氨基酸残基 , 推导的 GLDH线粒体靶缩氨酸剪切位点用箭头表示 ,
带星号的氨基酸表示推测的 FAD结合结构域。Ⅰ: 白菜 (AY899298) ; Ⅱ: 花椰菜 ( Z97060) ;
Ⅲ: 拟南芥 (AB042279) ; Ⅳ: 辣椒 (AY547352) ; Ⅴ: 烟草 (AB048530) ; Ⅵ: 甜瓜 (AF252339) ;
Ⅶ: 草莓 (AY102631) ; Ⅷ: 马铃薯 (AB017357) ; Ⅸ: 番茄 (AB080690) ; Ⅹ: 刺梨 (AY643403)。
F ig. 3　A lignm en t of pred icted am ino ac id sequences of GLDH genes from d ifferen t plan ts
The identical residues in all sequences are boxshaded (white letters in black background) . The arrow indicates the putative cleavage site
of the m itochondrial targeting pep tide. Suggested FAD2binding domain is indicated in asterisks. Ⅰ: B rassica cam pestris ssp. chinensis
(AY899298) ; Ⅱ: B rassica oleracea ( Z97060) ; Ⅲ: A rabidopsis tha liana (AB042279) ; Ⅳ: Capsicum annuum (AY547352) ;
Ⅴ: N icotiana tabacum (AB048530) ; Ⅵ: Cucum is m elo (AF252339) ; Ⅶ: F ragaria ×ananassa (AY102631) ; Ⅷ: Ipom oea bata tas
(AB017357) ; Ⅸ: Lycopersicon esculen tum (AB080690) ; Ⅹ: Rosa roxburghii (AY643403) .
参考文献 :
1　Tabata K, Takaoka T, Esaka M. Gene exp ression of ascorbic acid2related enzymes in tobacco. Phytochem istry, 2002, 61: 631～635
2　TamaokiM, Mukai F. L ight2controlled exp ression of a gene encoding L2galactono2γ2lactone dehydrogenase which affects ascorbate pool size in
A rabidopsis thaliana. Plant Science, 2003, 164: 1111～1117
3　O stergaard J, Persiau G, Davery M W , Bauw G, Montagu M V. Isolation of a cDNA coding for L2galactono2γ2lactone dehydrogenase, an
enzyme involved in the biosynthesis of ascorbic acid in p lants. The Journal of B iological Chem istry, 1997, 272 (48) : 30009～30016
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