全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 122～124
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 01 - 17; 修回日期 : 2005 - 04 - 193 通讯作者 Author for correspondnence ( E2mail: yyhzhang@ sdau1edu1cn)
苹果 AFS基因的克隆与原核表达
李　萌 1, 2 　隋　娜 2 　张元湖 23 　孟庆伟 2
(1 山东省农业科学院 , 济南 250100; 2 山东农业大学生命科学学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 通过 RT2PCR扩增到苹果α -法尼烯合成酶 (α2Farnesene Synthase, AFS) 基因的编码区全长 ,
将其克隆到 pET230a ( + ) 上 , 构建了该基因的原核表达载体 pET2AFS, 转化大肠杆菌 BL21。SDS2PAGE
检测结果表明 , 此基因表达了 1个约 66 kD的蛋白 , 1 mmol/L异丙基 -β - D -硫代半乳糖苷 ( IPTG) 诱导
该基因高效表达 , 6 h表达量最高 , 诱导产物以包涵体形式存在。
关键词 : 苹果 ; α -法尼烯 ; 原核表达 ; SDS2PAGE
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120122203
C lon ing and Prokaryotic Expression of Apple A FS Gene
L iMeng1, 2 , Sui Na2 , Zhang Yuanhu23 , and Meng Q ingwei2
(1 Shandong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, J ipinan 250100, Ch ina; 2 College of L ife Sciences, Shandong A gricultural U niversi2
ty, Taipian 271018, China)
Abstract: α2farnesene synthase (AFS) gene from app le peel tissue was amp lified by RT2PCR, and
cloned into pET230a ( + ) vector to construct recombinant p rokaryotic exp ression vector pET2AFS. After
transformation of E. coli and induced by 1 mmol/L isop ropyl2β2D2thiogalactopyranoside ( IPTG) , recombi2
nant p rotein with 66 kD was exp ressed in pET2AFS system and separated by SDS2PAGE electrophoresis. The
maximum of p rotein was exp ressed when induced with IPTG for 6 h. The recombinant p rotein exp ressed as in2
clusion bodies.
Key words: App le; α2farnesene; Prokaryotic exp ression; SDS2PAGE
1　目的、材料与方法
众多试验证实α -法尼烯与苹果贮藏中的生理病害虎皮病的发生有关。α - 法尼烯的合成受到多
个酶的调控 , 其中α -法尼烯合成酶 (AFS) 是最直接的限速酶。A FS基因已经得到克隆 , 研究发现
它对苹果低温贮藏前 8周的α - 法尼烯的释放起重要调控作用〔1〕。作者也已经成功得到 A FS基因的
cDNA, 并研究了其在苹果冷藏出库后一段时间的表达与α - 法尼烯释放量的关系 , 并根据此序列设
计特异引物 , 通过 RT2PCR获得其编码区全长 , 将其克隆入原核表达载体 , 成功地在大肠杆菌中表达
了该蛋白。
所用材料为 ‘青香蕉 ’ (W hite Pearmain) 苹果 , 采自泰安市郊区果园。在 0℃冷库中贮藏 8周 ,
用于提取果皮 RNA , 此时 A FS表达量最大〔1〕。工程菌 E. coli DH5α, BL21及质粒 pET230a ( + ) 由
山东农业大学生命科学学院保存 , 克隆载体 pMD182T Vector购于大连宝生物公司 , 回收试剂盒为上
海博雅公司产品 , 各种 DNA聚合酶、限制性内切酶、 IPTG、X2gal均为大连宝生物公司产品。
用 L iCl沉淀法提取苹果果皮中的总 RNA〔2〕。用 M 2MLV反转录酶 ( Promega公司 ) 合成 cDNA ,
操作步骤根据说明书进行。根据已知序列 (注册号 AY563622) 设计特异引物 , 由上海生工生物工程
公司合成。引物 P1的 5’端引入 N coⅠ酶切位点 , P2的 5’端引入 X hoⅠ酶切位点 , 在酶切位点外侧
各加入 3个保护碱基。P1: AGCCCATGGCTATGGAATTCAGAGTT, P2: GCGGAGCTCACTAGTTTACAA
　1期 李 　萌等 : 苹果 A FS基因的克隆与原核表达 　
GAGG。用上述引物进行 PCR扩增 : 94℃预变性
5 m in, 94℃变性 1 m in, 55℃退火 1 m in, 72℃延
伸 1 m in 15 s, 循环 35次 , 72℃延伸 10 m in。取
10μL反应液 , 在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳 , 在
Gel2Pro Analyzer成像系统中观察并存储照片。将
PCR产物回收后与 pMD182T Vector连接 , 转化 E.
coli DH5α, 得到重组子。提取含目的片段的质粒
在上海生工生物工程公司测序。
挑取阳性克隆 , 提取质粒用 N coⅠ和 X hoⅠ进
行双酶切 , 琼脂糖凝胶电泳检测后用回收试剂盒
回收。挑取含 pET230a ( + ) 空载体的克隆 , 提
取质粒进行双酶切 (步骤同上 )。将回收片断与
酶切后 pET230a ( + ) 空载体连接 , 得到重组表
达质粒 pET2AFS (图 1) , 转化大肠杆菌 BL21感
受态细胞 , 筛选阳性克隆在上海生工生物工程公
司测序 , 鉴定所插入的序列及其读码框是否正确。
挑取阳性克隆 , 接种 LB液体培养基 (含卡
那霉素 50 mg/mL ) , 37℃震荡培养过夜 , 按 1∶
100的比例接种于相同的 LB培养基上 , 37℃培养
至 OD600约为 015, 加入 IPTG 1 mmol/L 诱导 0、
2、4、6 h, 离心并收集菌液 , 4℃, 12 000 g离心
图 1　pET2AFS的构建策略
F ig. 1　Con struction of pET2AFS
1 m in, 弃上清液 , 沉淀用 100μL 1 ×SDS凝胶加样缓冲液 ( Tris2HCl 50 mmol/L , pH 618; SDS 2% ;
二硫苏糖醇 100 mmol/L; 溴酚蓝 011% ; 甘油 10% ) 重悬 , 煮沸 3 m in, 12 000 g离心 1 m in, 取 20
μL上清液进行 SDS2PAGE检测。用考马斯亮蓝 R2250染色 (染色液 : 011%考马斯亮蓝 R2250, 40%
甲醇 , 10%冰乙酸 ) , 脱色 (脱色液 : 25%甲醇 , 6%冰乙酸 ) 至背景清晰为止。
2　结果与分析
211　苹果 A FS基因的克隆与序列比较
　　RT2PCR 扩增得到含 A FS 编码区全长的序
列 , 电泳检测到 1条约 1 700 bp的电泳带 (图
2, A ) , 与已知序列大小相符。将其克隆到
pMD182T vector上 , 转化大肠杆菌 DH5α, 筛选
阳性克隆 , 酶切鉴定 (图 2, B )。序列比较发
现 , 与注册序列 (AY563622 ) 完全相同 , 证明
得到的 A FS 基因的编码区序列真实。与另一注
册的苹果 A FS 21 (注册号 AY182241 ) 的 cDNA
序列的同源性高达 99171% , 与在梨中克隆得到
的α - 法尼烯合成酶基因 (注册号 AY566286 )
的同源性为 97140%。
212　苹果 AFS基因原核表达载体 pET2AFS的构建
重组质粒 pMD2AFS和 PET230a ( + ) 质粒分
别都用 N co I和 X ho I双酶切 , 电泳回收约 1 700 bp
图 2　RT2PCR扩增 A FS基因 ( A) 及 pMD 2AFS酶切鉴定 ( B)
F ig. 2　Am plif ica tion of cD NA of A FS gene ( A) and restr ictive
enzym e d igestion ana lysis of pMD 2AFS ( B)
M: DNA marker; 1: AFS gene; 2: pMD2AFS N co I + Xho I.
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
的片段及切开的空载体 , 两者用 T4 DNA连接酶
连接 , 构建重组质粒 pET2AFS, 转化大肠杆菌
BL21。筛选阳性克隆 , N co I和 X ho I双酶切及
PCR验证 (图 3) , 测序证实重组质粒的外源基因
插入正确。
213　苹果 AFS基因的原核表达与 SDS2PAGE分析
重组质粒 pET2AFS转入大肠杆菌 BL21 后 ,
用 IPTG诱导其表达。结果发现 , 重组质粒能够
表达 1 条约 66 kD 的特异蛋白带 , 而 pET230a
( + ) 质粒表达的蛋白中没有这条带。而不用
IPTG诱导的重组质粒也没有重组蛋白的表达。
IPTG诱导 6 h后重组蛋白的表达量最高 (图 4)。
重组蛋白以包涵体的形式存在 , 在上清液中没有
发现目的蛋白的表达。
Rupasinghe等〔3〕纯化了α - 法尼烯合成酶 ,
对其特性进行研究。A FS 表达的变化是引起果
皮中α - 法尼烯的含量变化的重要因素〔1〕。但
是以上的研究均是以 A FS mRNA的变化为依据
进行 , 而在蛋白水平上的变化则能更准确地反
映 A FS对α - 法尼烯的含量和虎皮病发生的影
响。利用普通的纯化方法已经很难得到纯度更
高的 A FS蛋白 , 通过原核表达 A FS蛋白制备抗
体后利用免疫学的方法对其进行研究将是下一
步的重点。
　　本研究将 A FS 的编码区序列导入 pET230a ( + ) 载体中 , 构建了原核表达载体 pET2AFS, 经
IPTG诱导 , 在大肠杆菌中表达了含 H is· tag的重组蛋白 , SDS2PAGE检测发现表达蛋白约为 66 kD ,
与预计大小相符。表达蛋白以包涵体形式存在 , 可有效地防止细菌蛋白酶的降解。pET230a ( + ) 载
体含有的组氨酸标记物序列编码的组氨酸标记融合尾比通常所用的标记物相对分子量小 , 免疫性低 ,
亲和性好 , 便于分离纯化。这为进一步研究 A FS在蛋白水平上与α -法尼烯释放和虎皮病发生的影响
奠定了基础。
参考文献 :
1　Pechous S W , W hitaker B D. Cloning and functional exp ression of an ( E, E) 2α2farnesene cDNA from peel tissue of app le fruit. Planta,
2004, 219 (1) : 84～94
2　王关林 , 方洪筠. 植物基因工程原理与技术. 北京 : 科学出版社 , 1998. 609～610
W ang G L, Fang H J. The technology and p rincip le of p lant genetic engineering. Beijing: Science Press, 1998. 609～610 ( in Chinese)
3　Rupasinghe H P V, Paligath G, Muri D P. Sesquiterpene synthase: partial purification, characterization, and activity in relation to superficial
scald development in app les. J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 2000, 125: 111～119
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