全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1341～1344
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 12; 修回日期 : 2006 - 03 - 27
基金项目 : 浙江省重大科技攻关项目 (2005C12019 - 02) ; 国家自然科学基金项目 (30370975)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@zju1edu1cn)
白菜离体春化相关基因表达的 cDNA2AFL P分析
孙保娟 1, 2 　曹家树 13 　黄细松 1 　余小林 1
(1 浙江大学蔬菜研究所 , 浙江杭州 310029; 2 广东省农业科学院蔬菜研究所 , 广东广州 510640)
摘 　要 : 借助 cDNA2AFLP技术分离到 15个与白菜离体春化反应相关的表达序列标签 ( EST)。B last结
果表明 : 低温春化处理抑制性表达的 12个 EST, 多与异化作用相关基因同源性较高 ; 春化诱导表达的 3个
EST, 分别与编码核糖体蛋白的亚基 (或与自主开花途径相关的 FAC基因连锁的因子 ) , ATPase的亚基 ,
小 G -蛋白亚基的基因同源性较高。
关键词 : 白菜 ; 春化 ; 离体 ; 基因 ; cDNA2AFLP
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621341204
cD NA2AFL P Ana lysis on Genes A ssoc ia ted w ith Verna liza tion in V itro in
B rassica cam pestris ssp. ch inensis
Sun Baojuan1, 2 , Cao J iashu13 , Huang Xisong1 , and Yu Xiaolin1
(1 Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou, Zhejiang 310029, China; 2V egetable Research Inseitu te,
Guangdong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, Ch ina)
Abstract: Fifteen ESTs associated with vernalization in vitro of Chinese cabbage2pak2choi (B rassica
cam pestris L. ssp. ch inensis Makino) were isolated by cDNA2AFLP. B last results showed that 12 ESTs down2
regulated by vernalization had high sim ilarity to genes encoding enzymes involved in the disassim ilation. 3
ESTs up regulated had high sim ilarity to genes with positive effect on vernalization, including ribosomal p rotein
subunit related to the synthesis of p riotein or the linkage factor of FAC involved in auto flowering pathway, the
subunit of ATPase, and the subuint of small2G2p rotein.
Key words: Chinese cabbage2pak2choi; B rassica cam pestris ssp. ch inensis; Vernalization; In vitro;
Gene; cDNA2AFLP
1　目的、材料与方法
白菜 (B rassica cam pestris ssp. ch inensis Makino) 生态类型丰富 , 对二年生白菜春化诱导成花转变
机制的研究具有重要的意义。基于春化作用过程中重要基因转录的程序化改变的观点 , 通过差异筛选
和差异显示策略 , 种康等〔1〕在冬小麦上克隆了一系列春化作用相关的基因 , 这为白菜春化作用研究
提供了很好的借鉴。在离体条件下进行不同时间的低温处理 , 借助 cDNA2AFLP技术分离白菜春化作
用相关基因 , 将为从分子水平上对白菜等芸薹属蔬菜进行成花调控奠定基础。
采用 “未春化 —春化 —脱春化 ”模式研究白菜不定芽离体春化中差异表达的基因 , 用 5℃ 4 d处
理消除冷适应特异表达的基因。‘矮脚黄 ’白菜可育株再生的不定芽在 MS + 2%蔗糖 + 018%琼脂
粉 + 2 mg·L - 1 62BA + 012 mg·L - 1 NAA的培养基上扩繁。具有 5 ～ 6片叶的不定芽培养 7 d后 ,
进行如下处理 : (1) 未春化 ; (2) 5℃ 4 d; (3) 5℃ 28 d; (4) 5℃ 28 d后 , 33℃ 5 d脱春化。低温
处理和高温脱春化在人工智能光照培养箱内进行 , 设定 16 h /8 h的光暗交替。
切取各处理不定芽顶端分生组织 (生长点 ) , 长度约为 013 cm, 每处理至少取 60个 , 用于提取
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RNA。总 RNA的提取、 cDNA2AFLP分析参考王永勤等〔2〕文章 , 略有改动。春化处理特异表达和缺失
的条带回收、克隆后 , 提供 1 mL菌液到鼎国公司测序。测序结果通过 NCB I国际互联网进行 BLAST
分析。RT2PCR检测 , 先以肌动蛋白 (ACTIN ) 引物进行 PCR扩增 , 根据琼脂糖凝胶电泳结果 , 调整
不同处理模板 (双链 cDNA ) 用量 , 使亮度一致。不同处理模板用量确定之后 , 把 ACTIN引物换成
不同的片段特异性引物 , 进行 PCR扩增。
2　结果分析与讨论
211　离体春化处理差异表达基因的 cD NA2AFL P分析
各处理材料的总 RNA甲醛变性凝胶电泳如图 12A , 28S、18S和 5S条带清晰。 cDNA的第 2链合
成最佳的循环数是 26, 双链 cDNA合成结果如图 12B , cDNA在 011～3 kb之间形成 Smear, 说明合成
的双链 cDNA质量较好。
图 1　白菜 ‘矮脚黄 ZUB97201AB’不同时间低温处理的不定芽 RNA ( A) 及反转录后 dsD NA ( B) 电泳分析
M: Marker, 1: 未春化处理 , 2: 5℃ 4 d, 3: 5℃ 28 d, 4: 脱春化处理。
F ig. 1　Electrophoresis of RNA ( A) and dsD NA ( B) reverse tran scr ipted from tota l RNA of adven titious shoots of
‘A ijiaohuang ZUB97201AB’lines w ith d ifferen t tim e low tem pera ture trea tm en t
M: Marker; 1, 2, 3, 4: dsDNA of unvernalized, 5℃ 4 d, 5℃ 28 d and devernalized, respectively.
利用 256对引物进行选择性扩增 , 其中每个处理都有其特异表达的 EST, 最终回收到 3条春化特
有条带 (A4T16V, A1019V, A14T5V ) 和其余 12条春化缺失条带 (图 2)。与未春化、5℃ 4 d和脱春
化处理相比 , 春化处理 28 d后 , 很多结构性基因的表达减弱。
图 2　不同时间低温处理 ‘矮脚黄 ZUB97201AB’白菜离体再生不定芽 cD NA2AFL P分析获得的差异表达片段
泳道从左到右依次为 : 未春化、5℃ 4 d、5℃ 28 d春化、脱春化 4个处理。
F ig. 2　D ifferen tia l expression fragm en ts obta ined from cD NA2AFL P ana lysis on d ifferen t
dura tion of ch ill trea tm en ts in B rassica cam pestris ssp. ch inensis
Lanes from left to right: unvernalized, 5℃ 4 d, 5℃ 28 d vernalized, devernalized.
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　6期 孙保娟等 : 白菜离体春化相关基因表达的 cDNA2AFLP分析 　
212　差异片段测序结果的 BLAST分析及半定量 RT2PCR检验
测序结果通过 NCB I国际互联网进行 BLAST分析 (表 1 ) 。可见 , 春化后缺失的 EST, 一般与水
表 1　差异片段的基本特征
Table 1　The ba sic character istics of the d ifferen tia l expression fragm en ts
表达类型
Exp ression type
片段编号
Fragment
code
长度
Length
( bp)
同源序列
Sequences of significant alignments
同源性
Identities
( % )
最低 E值
Lowest E
value
春化特有 A4T16V 167 拟南芥核糖体蛋白基因或 FCA基因重叠群 90106 e247
Peculiar to vernalization A rabidopsis thaliana ribosomal p rotein gene or FCA gene config
A10T9V 186 萝卜叶绿体 ATP酶β亚基基因 99146 4e297
Raphanus sativus chlorop last gene for ATPase beta subunit
A14T5V 192 G - 蛋白家族基因 G2p rotein fam ily gene 22139 9e209
春化缺失 A5T12 206 拟南芥花芽 GSLTFB33ZB04克隆 86136 1e241
Deficient after vernalization A rabidopsis tha liana flower buds GSLTFB33ZB04 clone
A5T1621 318 半胱氨酸蛋白酶 Cysteine p roteinase 90125 1e2100
A5T1622 187 拟南芥细胞周期相关的基因 84144 7e234
A rabidopsis tha liana cell cycle2related p rotein
A6T1621 318 半胱氨酸蛋白酶 Cysteine p roteinase 90131 1e2100
A6T1622 179 油菜β21, 4 - 内葡聚糖酶 99133 3e273
B rassica napus gene for endo21, 42beta2D2glucanase
A6T1721 215 蛋白酶体调控部分的亚基 Putative 26S p roteasome subunit 90119 2e252
A6T1722 179 油菜β21, 4 - 内葡聚糖酶 99134 7e274
B rassica napus gene for endo21, 42beta2D2glucanase
A11T17 173 新基因 New gene 23170 6e206
A11T19 184 拟南芥去乙酰化酶基因 87188 1e229
A rabidopsis tha liana gene for histone deacetylase
A12T16 289 拟南芥抗病相关的甜蛋白 86103 3e262
A rabidopsis tha liana gene for putative thaumatin p rotein
A17T1723 199 新基因 New gene 11156 01033
A19T7 220 油菜生长素负调控蛋白基因 98162 1e2111
B rassica rapa subsp. pekinensis auxin2rep ressed p rotein
图 3　Actin及差异片段的 RT2PCR检测电泳图
M: Marker (从上至下 : 501 bp, 404 bp, 331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp)。
每对引物对应的泳道从左到右依次为 : 未春化、5℃ 4d、5℃ 28d春化、脱春化 4个处理。
F ig. 3　Electrophoresis of RT2PCR for Actin and d ifferen tia l fragm en ts
M: Marker (Up to down: 501 bp, 404 bp, 331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp) .
Lanes of each pair of p imers from left to right: unvernalized, 5℃ 4 d, 5℃ 28 d vernalized, devernalized.
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解代谢 , 或异化代谢相关基因的同源性较高 ; 春化诱导表达的 EST, 与合成代谢相关基因的同源性较
高。
A5T1621、A5T1622、A6T1622、A11T17和 A17T1723等 5个片段的 RT2PCR 表达模式与 cDNA2
AFLP分析结果一致 (图 3) ; A5T12有所不同 ; A6T1721、A19T7、A12T16、A11T9等 4个片段在春
化处理的条件下也有扩增 , 但表达较弱 , 这很可能是由于人肉眼读板将弱表达条带判读为无。春化特
异表达的片段 A4T16V 在其它 3个处理中也有表达 , 但春化处理表达较强 , 春化特异表达的条带
A10T9V和 A14T5V在本试验所设计的引物条件下无扩增。
　　春化过程涉及糖、核酸、蛋白质代谢〔3〕及信号转导途径〔4〕, 因此与这些代谢途径相关基因的去
阻遏或阻遏都可能对春化作用产生影响。白菜离体春化后 , 受到正调控的基因 , 如蛋白合成相关基因
(A4T16V) , 光合磷酸化作用相关基因 (A10T9V ) , 以及信号转导途径相关基因 (A14T5V ) 为春化
作用的发生提供了物质基础、动力支持和传递途径。受到负调控的基因 , 如编码蛋白酶体基因
(A6T1721) 的低表达 , 能够保证低温春化过程中新合成的蛋白质不被泛素 —蛋白酶体途径识别而被
降解 ; 去乙酰化酶基因 (A11T19) 的低表达使得一些基因的转录抑制被解除。
参考文献 :
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Tan K H, W ang H W , He X W , L i S Q. Effect of metabolic inhibitors on vernalization p rocess in winter wheat. Acta Botanica Sinica, 1981,
23 (5) : 371～376 ( in Chinese)
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2001, 43 (8) : 871～873
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