全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1781 - 1786
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 26; 修回日期 : 2008 - 11 - 03
基金项目 : 国家高技术研究发展计划项目 (2006AA100108, 2006AA10Z108, 2008AA10Z150) ; 国家支撑计划项目 (2006BAD13B06,
2006BAD01A725211) ; 江苏省高新技术研究计划项目 (BG2007301)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jfchen@njau1edu1cn)
黄瓜未授粉子房培养获得同源四倍体
刁卫平 , 贾媛媛 , 江　彪 , 鲍生有 , 娄群峰 , 陈劲枫 3
(南京农业大学园艺学院 , 作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 为获得稳定纯合的同源四倍体黄瓜材料 , 采用多种分化培养基对黄瓜 (Cucum is sativus L. )
未授粉子房培养形成的胚进行培养。结果共获得 33个再生植株 , 经染色体计数后发现 7株为同源四倍体植
株 (2n = 4x = 28)。利用 SSR手段对获得的同源四倍体植株进行了同质性鉴定 , 发现均为纯合子。利用形
态学观察和染色体计数法对同源四倍体单株自交后代的遗传稳定性进行了研究 , 结果表明自交后代倍性没
有发生变异。对此类型同源四倍体植株和经秋水仙素诱导获得的同源四倍体植株分别进行了花粉可染率、
花粉萌发率及自交结籽数的观察 , 发现前者具有高的育性 , 自交结籽数为 15～34粒。上述结果表明 , 黄瓜
未授粉子房培养是获得同源四倍体的一条途径 , 获得的稳定纯合且育性好的同源四倍体材料可作为特异资
源用于黄瓜倍性育种。
关键词 : 黄瓜 ; 子房培养 ; 同源四倍体
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221781206
Induction of Autotetraplo id Cucum bers by Unpollina ted O vary Culture and
The ir Character iza tion
D IAO W ei2p ing, J IA Yuan2yuan, J IANG B iao, BAO Sheng2you, LOU Qun2feng, and CHEN J in2feng3
(S tate Key L aboratory of C rop Genetics and Gerplasm Enhancem ent, College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an2
jing 210095, Ch ina)
Abstract: Gynogenic embryos originating from unpollinated ovary culture were cultured on differentiation
medium to induce homozygous autotetrap loid cucumber. In total, thirty2three p lantlets were regenerated, and
seven were observed as autotetrap loid ( 2n = 4x = 28) after chromosome counts. These autotetrap loid p lants
were identified as homozygote after simp le sequence repeat ( SSR) analysis. Genetic stability of the p rogenies
from self2crossing of these autotetrap loid was studied, no p loidy variation occurred among these p rogenies after
morphology and chromosome observation. Comparative studies were carried out between autotetrap loid p lants
from ovary culture and autotetrap loid p lants from colchicines treatment, using parameters, stainability of pollen
grains, viability of pollen grains and number of seeds per fruit. H igher pollen fertility and number of seeds per
fruit were found in the gynogenic induced autotetrap loid p lants. These results indicate that it is a method to in2
duce autotetrap loid through unpollinated ovary culture, and the obtaining of homozygous autotetrap loid with
higher fertility will be quite useful in cucumber breeding p rogram s.
Key words: cucumber; Cucum is sa tivus L. ; ovary culture; autotetrap loid
同源四倍体可以用作亲本来提高远缘物种间的可杂交性 (常金华和罗耀武 , 2002) , 与原二倍体
杂交回交筛选各种非整倍体特异材料 (程祝宽 等 , 1996) , 而且在产量、品质和抗性上可能有优于
二倍体的表现 (李树贤 等 , 2002; Muhammad et al. , 2005)。但目前在黄瓜同源四倍体的诱导和利用
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中存在诱导方式单一 , 获得的四倍体稳定性差、育性低且与二倍体植株正反交后均不能得到饱满种子
等问题 (Mackiewicz & Malep szy, 1996; 韩毅科 等 , 2002; 陈劲枫 等 , 2004)。
已有大量的研究发现 , 在诱导单倍体的组织培养过程中可以得到一定比例的同源四倍体植株
( Geoffriau & Kahane, 1997; Endang et al. , 2006) , 此类四倍体可能是来源于体细胞自发加倍或单倍
体细胞经过两次加倍后的产物 , 而两类产物在遗传学上分别定义为异质型和同质型 ( Eduard &
R ichard, 2000)。Endang等 (2006) 在对葱的未授粉子房培养诱导单倍体过程中获得的四倍体进行核
型分析后认为 , 此四倍体是体细胞简单加倍的产物。目前对单倍体培养过程中所获得的同源四倍体植
株的育性、遗传稳定性和同质性的研究甚少。
黄瓜未授粉子房培养已有少数的成功报道 (杜胜利 等 , 2001; Gemes2Juhasz et al. , 2002) , 但在
再生植株中未发现同源四倍体。作者在对黄瓜未授粉子房培养过程中形成的胚进行再生培养后 , 获得
了一批同源四倍体植株。这些同源四倍体材料具有纯合、稳定和育性好等优点 , 这为今后黄瓜同源四
倍体的获得提供了一条新途径 , 并为黄瓜的多倍体育种奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
以二倍体黄瓜 ‘津绿四号 ’ (J inlü4) 未授粉子房培养过程中获得的胚 (刁卫平 等 , 2008) 为
试验材料进行芽的分化和植株的再生。将获得的经鉴定为同源四倍体且驯化成活的植株分别编号为
Tetra21、Tetra22 、Tetra23 、Tetra24 、Tetra25和 Tetra26, 并将其作为试验材料。育性观察试验中所用
二倍体材料为 ‘津绿四号 ’, 同源四倍体 Tetra2J inlü由本实验室通过秋水仙素诱变二倍体 ‘津绿四
号 ’获得 (陈劲枫 等 , 2004)。
所用试材于 2007年秋种植在南京农业大学蔬菜实验地 , 常规管理。
112　植株再生与倍性鉴定
将黄瓜未授粉子房培养获得的胚分别接种在添加 TDZ、62BA、NAA和 KT的 MS培养基 (琼脂
018% , 蔗糖 3% , pH 518) 中进行分化培养。培养温度 ( 26 ±1) ℃; 光照强度 2 000～2 500 lx, 光
照时间 16 h·d - 1。
每 3周更新一次培养基。将获得的再生苗不定芽接种在 1 /2 MS + 012 mg·L - 1 IBA培养基中进
行生根培养 , 培养基基本成分及培养条件与芽分化培养相同。
2周后将组培苗用自来水洗净后移栽入育苗穴盘 , 置于小拱棚中驯化。相对湿度 80% ～90% , 温
度 20～25 ℃。一周后揭开小拱棚 , 2周后定植。
参照陈劲枫和钱春桃 (2002) 的方法对再生植株进行体细胞染色体计数 , 确定其倍性。
113　再生四倍体植株的同质性分析
基于前人的报道结果 ( Katzir et al. , 1996) , 由上海生工生物工程服务公司合成 16对 SSR引物。
扩增反应体系总体积 25μL (其中 dNTPs 215 mmol·L - 1 ; 上下游引物各 0115μmol·L - 1 ; 模板 DNA
50 ng; Taq酶 1 unit)。扩增反应在 PTC2100 PCR仪中进行 , 反应条件为 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃
30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s, 35个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in, 最后在 4 ℃下保存。PCR产物在 9%聚丙
烯酰胺上电泳 , 采用改良的 Charters银染方法检测。
利用 SSR手段对获得的 7份四倍体材料中的 5份 ( Tetra21～5) 进行了同质性检测。根据再生植
株和子房培养供体二倍体材料 ‘津绿四号 ’在某个基因位点有无扩增条带来进行同质性分析。
114　再生四倍体自交后代遗传稳定性和育性观察
对再生四倍体植株进行单株自交。对每个编号的自交后代分别与二倍体黄瓜 ‘津绿四号 ’进行
种子、子叶、花蕾、花和叶片的形态学比较 , 初步确定其自交后代倍性水平的稳定性 , 同时对自交后
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代植株进行体细胞染色体计数进一步确定其倍性 , 再次验证其倍性的稳定性。
雄花盛开时对四倍体植株进行花粉可染率 (011%醋酸洋红染色 ) 的观察 , 每朵花镜检 5个视
野 , 3次重复 , 每视野至少观察 100个花粉粒。参照刘永庆 ( 1994 ) 的方法进行花粉萌发试验 ,
每朵花镜检 10个视野 , 3次重复 , 每视野至少观察 50个花粉粒。四倍体植株单株自交 2个果实进
行留种 , 统计单果结籽数 , 以饱满种子计数。以二倍体 ‘津绿四号 ’和同源四倍体 Tetra2 J inlü作
为对照。
2　结果与分析
211　植株再生和四倍体的获得
黄瓜未授粉子房培养获得的胚在添加 015 mg·L - 1 TDZ和 115 mg·L - 1 BA的培养基上生长良好 ,
在分化出植株前都能保持绿色 , 而在其他几种培养基上的胚逐渐黄白化并逐步失去了活力。在 4种培
养基上总共获得了 33个再生植株 (图 1, A～C; 表 1)。
图 1　植株再生和四倍体获得
A. 黄瓜未授粉子房培养的胚 ; B. 胚的分化 ; C. 再生植株 ; D. 四倍体染色体 (2n = 4x = 28)。
F ig. 1　Plan t regenera ted and tetraplo id obta ined
A. Embryo from cucumber unpollinated ovary culture; B. Embryo differentiation;
C. Regenerated p lantlet; D. Tetrap loid chromosome (2n = 4x = 28) .
表 1　分化培养基的筛选及再生植株的获得
Table 1　D ifferen tia tion m ed ium selected and regenera tion plan tlets obta ined
MS分化培养基 / (mg·L - 1 )
MS differentiation medium
TDZ 62BA NAA KT 接种胚数Number of inoculationembryos 再生植株数Number of regenerationp lants 四倍体植株数Number of tetrap loidp lants
015 180 7 2
110 90 4 1
210 60 0 0
012 90 0 0
012 0105 120 20 4
115 90 2 0
210 90 0 0
利用根尖和卷须染色体制片技术对黄瓜未授粉子房培养诱导单倍体过程中获得的再生植株进行了
倍性鉴定 , 共鉴定出 7株同源四倍体植株 (2n = 4x = 28) (图 1, D )。
由表 1可知 , 将胚培养在含高浓度细胞分裂素的基本培养基上有利于同源四倍体的获得 , 而同源
四倍体的获得可能是由于单倍体细胞在培养过程中发生了两次自然加倍的结果。
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212　再生四倍体植株的同质性分析
从 16对引物中筛选出了 1对多态性引物 , 其引物序列为 (5′to 3′: TTGGGTGGCAATGAGGAA ,
5′to 3′: ATATGATCTTCCATTTCCA)。
如图 2所示 , 未授粉子房培养供体二倍体材料津绿四号在 300～ 400 bp之间共扩增出 4条带 , 而
再生同源四倍体植株一般只扩增出了 4条带中的某两条带。
由于 SSR是共显性标记 , 因此可以得出所检测的这 5份同源四倍体材料是由单倍体细胞经过两
次加倍后的纯合植株。
图 2　SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳检测再生植株的同质性结果
1～5: 四倍体 ; 6: 子房培养供体 ; M: pBR322 DNA /A lu I分子量标准。
F ig. 2　The SSR PAGE electrophoresis results of hom ozygosity of regenera ted plan tlets
1 - 5: Tetrap loid; 6: Donor p lant of ovary culture; M: pBR322 DNA /A lu Imarker.
213　再生四倍体植株自交后代的稳定性
四倍体单株自交后代的种子、子叶、花蕾及完全开放的雄花都比原二倍体植株大 (图 3, A～
D) ; 同时叶片变厚 , 叶面积增大 , 叶片呈明显皱褶及叶色变深 (图 3, E) , 花色变深 , 整体矮壮。利
用体细胞染色体计数方法观察其染色体数 , 均为 28条 (2n = 4x = 28) (图 3, F) , 说明了所获得的再
生四倍体植株自交后代在细胞遗传水平上的稳定性。
图 3　再生四倍体植株自交后代的形态观察
A. 种子 ; B. 子叶 ; C. 花蕾 ; D. 花 ; E. 叶 ; F. 染色体计数。
F ig. 3　The m orphology observa tion of the progeny from regenera ted tetraplo id self2crossing
A. Seeds; B. Cotyledons; C. Buds; D. Flowers; E. Leaves; F. Chromosome counting.
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214　再生四倍体植株的育性
从表 2可以看出 , 对照二倍体植株不论是花粉可染率还是在花粉萌发率都比所获得的四倍体植株
高。二倍体和四倍体花粉在培养 3～4 h内花粉管生长长度均达到最大值 , 但二倍体明显长于四倍体。
四倍体单果结籽数为 15～34粒 , 而二倍体为 150粒左右。这些结果说明二倍体黄瓜和四倍体黄瓜在
育性上确实存在较大差异。此外 , 由表 2可知 , 在黄瓜未授粉子房培养过程中获得的四倍体植株
( Tetra21～6) 的花粉育性和自交结籽数要远高于由秋水仙素诱变获得的四倍体植株 ( Tetra2J inlü) , 这
可能是由于秋水仙素的毒害作用所致。
表 2　二倍体和四倍体花粉可染率、萌发率及单果结籽数的比较
Table 2　Com par ison of pollen dryra tion, pollen germ ina tion and num ber of seeds per fru it between d iplo id and tetraplo id
倍性
Ploidy
材料
Material
花粉可染率 /% Pollen dryration
平均 Average 最小 M in 最大 Max
花粉萌发率 /% Pollen germ ination
平均 Average 最小 M in 最大 Max
单果结籽数
Number of seeds per fruit
2x J inlü4 9414 a 9311 9515 8016 a 5711 8517 154
4x Tetra21 6610 bc 5617 7811 4819 bc 2510 7718 21
Tetra22 6516 bc 5818 7419 5318 bc 1413 7619 17
Tetra23 6118 bc 5312 7718 4619 c 2816 6617 15
Tetra24 7310 b 6712 8211 5619 bc 3012 7514 20
Tetra25 7017 bc 6615 7410 5612 bc 2010 8011 18
Tetra26 6818 bc 6311 7316 5818 bc 1215 8313 34
Tetra2J inlü 6116 bc 5616 6710 4316 c 1617 7510 10
　　注 : 邓肯氏新复极差测验 , 不同小写字母表示差异达显著水平 ( P = 0105)。
Note: Duncanpis test (SSR ) , the different small letters indicated significance at P = 0105 level.
3　讨论
四倍体因其 “巨大性 ”, 生产上利用它来提高产量和品质、增加抗病抗逆能力 , 而利用同源四倍
体作为亲本获得三倍体材料在生产上也有广泛的应用 , 同时利用同源四倍体获得三倍体并进而进行基
因定位也是作物遗传学研究的一个热点。目前 , 在黄瓜上主要是通过秋水仙素诱变来获得同源四倍体
材料 , 但诱导率和植株育性普遍较低。而在很多作物的单倍体诱导过程中 , 经常可以获得自发加倍的
同源四倍体植株 , 有学者认为这是由于培养过程中核内复制或核融合的结果 (Masanori & Yoshiji,
2004) , 而这也为培育作物同源四倍体提供了一条新的途径。本研究结果表明 , 这一新的诱导途径同
样适用于黄瓜。
至今 , 有关黄瓜同源四倍体的诱导及相关研究较少。Mackiewicz & Malep szy (1996) 对黄瓜同源
四倍体的诱导及四倍体与二倍体的杂交能力做了初步的研究 , 发现其经秋水仙素诱导的四倍体育性
低 , 且和二倍体正反杂交的亲和性差 , 未能获得饱满种子。同样 , 在对本实验室来源于秋水仙素诱导
的同源四倍体进行花粉育性和自交结籽数观察后也发现它们的育性也很低 , 其自交结籽数 ( 10粒 )
要远少于经未授粉子房培养获得的四倍体的 (15～34粒 )。然而 , 为什么本研究在黄瓜单倍体诱导过
程中获得的四倍体植株较秋水仙素诱变获得的四倍体植株具有较好的育性 , 目前还不清楚 , 推测这可
能与所获得的四倍体植株是纯合子有关。由于单倍体的每个基因都是单拷贝的 , 各种隐性基因都可以
表现出来 , 经过两次加倍后形成的四倍体各基因理论上均处于纯合状态 , 突变体很容易表现出来 , 而
这可能是引起在单倍体诱导过程中获得的再生四倍体植株具有较高育性和稳定性的原因 , 但具体机制
还有待于进一步研究。然而 , 本研究中对不同来源途径的四倍体材料的育性观察还仅限于津绿四号这
一种基因型 , 为了更好的了解这两种不同来源途径下的四倍体材料是否真正存在育性的显著差异 , 今
后将利用黄瓜未授粉子房培养来获得更多基因型的同源四倍体材料来进行验证。
总之 , 本研究获得的具有较好育性、并能稳定遗传的纯合同源四倍体材料为今后培育黄瓜三倍体
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材料和创制全套黄瓜三体系奠定了基础。
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