全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：lO17—1022
Aeta Honieulturae Sinica
黄瓜促分裂原活化蛋白激酶基因的生物信息学分析
及原核表达
徐慧妮 ，王秀峰 ，孙旭东 ，杨凤娟 ，杜栋良
( 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018； 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018)
摘 要：利用 RT．PCR技术结合 RACE技术 ，从 NO 一胁迫下的黄瓜根中克隆出促分裂原活化蛋白激酶
(mitogen．activated protein kinase，MAPK) 基 因 的 同 源 序 列，命 名 为 CsNMAPK，GenBank注册 号 为
DQ812086。生物信息学分析表明，该基因全长 1 636 bp，开放阅读框 (ORF)1 113 bp，编码 370个氨基
酸；其编码蛋白可能定位于细胞质 ；该基因有一个强的跨膜螺旋结构；PlantCare分析结果显示该基因序列
具有脱落酸诱导、茉莉酸诱导、赤霉素诱导 、水杨酸诱导、伤害诱导等顺式作用元件。成功构建了原核表
达载体，并转化 E coli BL21(DE3)，SDS．PAGE检测结果显示表达了一个约46 kD的蛋白。
关键词：黄瓜；促分裂原活化蛋白激酶；NO 一胁迫；生物信息学分析；原核表达
中图分类号：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)07-1017-06
Bioinformatics Analysis and Prokaryotic Expression of MAPK in Cucumber
XU Hui．ni ，WANG Xiu．feng。·
， SUN Xu dong ，YANG Feng-juan · ，and DU Dong．1iang
(。Colege ofHorticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai~n，Shandong 271018，China； State
Key LaboratoryofCrop Biology，Tai~n，Shandong 271018，China)
Abstract：A cucumber cDNA designated CsNMAPK t GenBank accession No．DQ8 1 2086 was isolated
bv RT—PCR and RACE．Bioinformatics analysis indicated that the ful1．1ength cDNA sequence was 1 636 bp．
which contained an open reading frame of 1 1 1 3 bD and encoded a protein of 370 amino acid residues．The
subcellular localization analysis predicted that the protein was in the cytoplasm and there was one strong inside
to outside transmembrane helix．P1antCare analysis indicated that there were abscisic acid．MeJA．salicylic
acid cis．acting responsive elements and gibberelin and wound．responsive elements in CsNMAP ． The
P was cloned into pET．30a (+)vector to construct recombination prokaryotie expression vector
pET—CsNMAPK． After transformed to E coli BL2 l and induced by isopropyl—B—D—thi0galact0pyran0side
(IPTG)，recombinant protein about 46 kD was expressed in pET—CsNMAPK system and separated by
SDS PAGE electr0Dh0resis．
Key words：cucumber；MAPK；N03一stress；bioinformatics analysis；prokaryotie expression
土壤次生盐渍化是温室蔬菜生长的主要障碍之一 (薛继澄 等，1995)。温室土壤的盐分组成特
点与滨海、内陆盐土不同，阴离子主要是 NO 一，约占阴离子总量的67％ ～76％，阳离子主要是 Ca
(童有为和陈淡飞，1991)。尽管目前在探讨植物抗盐机制方面已取得了很大进展，但多以NaC1处理
作为研究条件，对蔬菜体内NO 。积累造成伤害机理研究较少。
蛋白激酶可逆磷酸化在转导外界信号分子方面发挥重要作用。促分裂原活化蛋白激酶级联
(MAPKs)途径位于信号转导途径网络的中心，在真核生物信号从细胞外传到细胞内的过程中起重要
收稿日期：2007—12—12；修回日期：2008—05—15
基金项目：国家自然科学基金项目 (30471187)
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：xfwang@sdau．edu．cn)
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园 艺 学 报
的作用。目前，已从拟南芥 (Mizoguchi et a1．，1994)、烟草 (Zhang&Klessig，1997)、水稻 (Fu et
a1．，2002)、苹果 (彭立新 等，2003)等植物中克隆了5O余种 MAPK基因。作者分离了NO，一胁迫
下黄瓜 MAPK基因的全长cDNA并对其进行了生物信息学分析，将其克隆入原核表达载体，成功地在
大肠杆菌中表达了该蛋白，为进一步了解黄瓜 NO，一胁迫伤害机理奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
试验材料为 ‘新泰密刺’黄瓜。用 182 mmol·L～NO，一盐溶液 [KNO，和 Ca(NO ) ·4H O各
1／2]处理24 h，取根于液氮中速冻，置于一8O℃超低温冰箱保存备用。
1．2 RNA的提取、eDNA的合成及黄瓜 MAPK基因的克隆
用CTAB法提取 RNA。按照 MBI公司反转录试剂盒说明书合成 cDNA第一链。根据 GenBank中
登录的植物 MAPK的核苷酸保守区序列，设计一对简并引物，上游引物 CP1：5 -GGCGC(T／C)TA
(T／C)GG (A／C／T)AT (T／C)GT(C／T)TG．3 ，下游引物 CP2：5 -GT (T／G／C)AC (T／A)
ACA TATFC (A／T／C／G)GTCAT．3 。以第 1链 cDNA为模板进行中间片段扩增，反应条件为 94℃ 5
min；94 c 45 S；56 c 45 S；72 c 60 S，共30个循环，最后72 c延伸 10 min。反应产物从 1％琼脂糖
凝胶上回收后，克隆入 pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5c~，提取质粒鉴定后由上海英骏公司测序。
根据测序结果设计 3 RACE特异上游引物 TCP1：5 -GA1TrAAGC1TrCTACGCCAr兀TrG-3 ，TCP2：
5 一AAGr兀TI1ATCAGAAGAGCATTGTCA-3 和下游通用引物 B26(上海生工生物工程技术服务有限公司提
供)，扩增得到该基因的3 端序列。反应参数为：第 l轮94℃ 5 min；94 oC 45 s；56 oC 60 s；72 oC
60 S，共25个循环，最后72℃延伸 10 min。第2轮 PCR以第 1轮产物稀释2O倍后取 1 L为模板，
94℃ 5 min；94 oC 45 S；56 oC 60 S；72 oC 60 S，共3O个循环，最后72℃延伸 10 min。扩增产物进
行序列测定。根据所获得该基因的中间片段和 3 端序列，设计 5 RACE引物 Tel：5 ．TFGGAGCGGAT．
TATVFGGTGA-3 ，Te2：5 -CAGAAAGATGCAACCAACAGACC-3 和通用引物 AAP(上海生工生物工程
技术服务有限公司提供)，以TDT试剂盒加尾的cDNA为模板，扩增得到该基因的5 端序列。反应程
序同上。反应产物进行序列测定。然后根据所得的拼接序列在起始密码子和终止密码子附近设计特异
5 端引物 cuTe3：5 -ATGGCTGATGTTGGTCAGAAC-3 和 3 端引物 cuTe4：5 ．TFGAGCATGAACGCTVF．
TAAGG-3 ，进行 PCR扩增，得到黄瓜 MAPK基因编码区序列。测序结果用 Blast软件和 DNAMAN软
件进行序列比较分析。
1．3 生物信息学分析
利用 DNAStar软 件包 的 EditSeq程 序 分 析 克 隆 基 因 的序 列，用 ORF Finder(htp：／／
www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．Htm1)寻找最大的开放阅读框 (open reading frame)；在 NCBI网站
(htp：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast)对核苷酸序列进行 BLASTn和 BLASTp分析，以推断 ORF的
正确性。理化性质分析用 ExPASy的ProtParam Tool软件；保守结构域分析用 ExPASy中的ScanProsite；
亚细胞定位分析用 PSORTII server；顺式作用元件用 PlantCare在线分析；蛋白质序列中信号肽用 s
nalIP预测；亮氨酸拉链分析用 ZIP-Server软件；跨膜结构分析用TMpred Server软件。
1．4 pET-CsNMAPK原核表达载体的构建
提取含有 pMD18T-CsNMAPK阳性克隆的质粒，用 BamH I和 Sal I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳
检测后用试剂盒回收。挑取含 pET-30a(+)空载体的克隆，提取质粒进行双酶切 (步骤同上)，将
回收的目的片段与酶切后 pET-30a(+)空载体用 T4 DNA连接酶连接，得到重组表达质粒 pET．Cs．
NMAPK，转化E．coli BI21感受态细胞，筛选阳性克隆由上海英骏公司测序，鉴定所插入的序列及其
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7 期 徐慧妮 等 ： 黄瓜促分裂原活化蛋 白激酶基 因的生物信息学分析及原核表达
读码框是否 正 确 。
2 结果 与分析
2． 1 黄瓜 M A P K 基 因编码 区 cD N A 的分离
利用简并引物扩增得到 一 条大小约为 4 60 bp 的中间片段 (图 1 )， 通过 B L A S T 比对分析表明 ， 该
片段 与多种植物的 M A P K 基 因有较高的 同源性 。 进 而 通 过 R A C E - P C R 技术分别获得 1 1 18 bp 的 3 ’端
和 4 95 bp 的 5 ’端序列 。 为确保该 3 ’端和 5 ’端为同 一 基 因的两 段 序列 ， 在拼接序列起 始密码 子 和终 止
密码 子 附近设计 一 对特异引物 ， P C R 扩增 获得 1 1 13 bp 的 目的条带 ， 测序结果 与拼接的编码 区 序列
结果完全 吻合 。 将该基 因命名为 C sN M A P K ， G en B ank注册号为 D Q 812086 。
图 1 黄瓜 C sN M A P K 基 因的 P C R 扩增
l： 0 ^ ’川 蹦 中间 片段 ； 2 ： 3 ’端 cD N A 片段 ； 3 ： 5 ’端 cD N A 片段 ；
4 ： 编码 区 (O R F ) cD N A 片段 ； M ： D L 2000 D N A m s~ker。
F ig． 1 A garo se gelelectrophoresis for the clonin g ofC sN M A P K from cucum ber root
l： M iddle fragm ent； 2 ： 3
’ fragm en t； 3 ： 5
’ fragm en t；
4 ： O R F ： M ： D L 2000 D NA m arker．
2． 2 C sN M A P K 基 因的生物信 息学分析
2． 2． 1 理 化 性 质 分 析 分析发现 ， C sN M A P K 全长 1 636 bp， 含有 1 1 13 bp 的完整 开放阅读框 ， 编码
370 个氨基 酸 。 用 E xP A S y 的 P rotP aram T ool软件分析 C sN M A P K 编码 的蛋 白质分子 量为 4 2 74 4 ． 8 道 尔
顿 ， 理论 pI 值为 5 ． 4 6 ， 分子 式为 C ㈨ ：H ：钾 ：N ，：：O ，，。S 舯
2． 2． 2 跨膜 结 构 分析 用 T M pred软件预测 ： 在 N 末端从第 216 到 234 个氨基酸处有 一 个从膜 内向膜
外的跨膜螺旋结构 ， 总分为 702 (大于 500 为有意义 的跨膜 区 ) (图 2 )。
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O 50 100 150 200 250 300 350 4 00
氨基 酸顺序 A m ino acidresidue
图 2 C sN M A P K 跨膜结构预 测
F ig． 2 P rediction oftransm em brane regiO il ofC sN M A P K
O O 0 O O 0∞ ∞ ∞ ∞ ∞
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】020 园 艺 学 报 35 卷
2． 2． 3 顺 式作 用 元 件 分析 用 P lantC are 分析基 因序列 的转录调控元 件 ， 结果显 示 该基 因序列正 链 和
反链上 具有脱落酸诱导 (A B R E )、 茉莉酸诱导 (C G T C A ． m otif， T G A C G — m otif)、 赤霉 素诱导 (G A R E ．
m otif)、 水杨酸诱导 (T C A - elem ent)、 生 长 素诱导 (T G A — elem ent)、 伤害诱 导 (W U N ． m otif) 等顺 式
作用元 件 (图 3 )。
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图 3 C sN M A P K 中含有的转 录 元 件结合位点的部分序 列
顺式作用 元 件 ： 1 ． 脱落酸诱导顺 式作用 元件 ； 2 ． 茉莉酸诱导顺式作用元 件 ； 3 ． 赤霉素诱导顺式作用 元 件 ；
4 ． 水杨酸诱导顺 式作用元 件 ； 5 ． 生 长素诱导顺 式作用元 件 ； 6 ． 茉莉酸诱导顺式作用 元 件 ； 7 ． 伤害诱导顺式作用 元 件 。
F ig． 3 P otentialregulatory m otifs from transcription factor binding sites in the C sN M A P K
C is— acting elem en t： 1 ． A B R E ； 2 ． C G T C A - m otif； 3 ． G A R E — m otif；
4 ． T C A 。 elem ent； 5 ． T G A ． elem en t； 6 ． T G A C G — m otif； 7 ． W U N ． m otif．
2． 2． 4 其 它预 测 结 果 用 E x P A S y 的 S canP rosite 对其氨基 酸序列分析 ， 发现 C sN M A P K 的 39 ～ 324 氨
基 酸片段 具有蛋 白激酶保守结构域 。 亚 细胞定位提示其编码蛋 白可 能定位于 细胞质 。 此 基 因编码 的蛋
白为非分泌 型 蛋 白 ， 无信号肽 ； 无 亮氨酸拉链结构 。
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7 期 徐慧妮 等 ： 黄瓜促分裂原 活化蛋 白激酶基 因的生 物信息学分析及原核表达
2． 3 pE T ． C sN M A P K 表达载体 的构建及 原核表达
将重组 质粒 pE T ． C sN M A P K 用 P C R 及 B am H I 和 S alI 双 酶切验证 (图 4 )， 测 序证 实重组 质粒 的
外源基 因插 入 正 确 。
重组 质粒转 化到大肠 杆菌 B L 21 后 ， 用 1 m m o] ? L — IP T G 37 ℃ 诱导 0 、 2 、 4 、 6 h 后 ， 提取 大
肠杆菌总 蛋 白进 行 S D S — P A G E 分 析 。 结 果 (图 5 ) 显 示 ， 插 入 有 外 源 片 段 的 重 组 质 粒 pE T — C s-
N M A P K 经 IP T G 诱 导后 ， 能够表达 1 条约 4 6 kD 的特异蛋 白带 ， 而 pE T - 30a ( + ) 空 载体未表达此
条带 。
图 4 pE T - C sN M A P K 的 P C R 鉴定 与酶切 鉴定
M ： D L 2000 D NA m arker ：
1 ： P C R 检测 ； 2 ： 酶切检测 。
F ig． 4 P C R and restriction enzym e digestion
analysis ofpE T ? C sN M A P K
M ： D I。 2000 D N A m arker； 1 ： P C R an alysis ：
2 ： R estriction enzym e digestion analysis．
图 5 pE T - C sN M A P K 在 大肠 杆菌 B 12 1 中的 S D S - P A G E
1 ～ 4 ： IP T G 诱导 0 、 2 、 4 、 6 h；
5 ： IP T G 诱导 pE T 一 30a ( + )； M ： 蛋 白质 m arker。
F ig． 5 S D S - P A G E ofexpression of
pE T - C sN M A P K in B 12 1
1 — 4 ： IP T G induced0 ， 2 ， 4 ， 6 h； 5 ： IP T G induced4 h of
pE T 一 30a ( + )； M ： P rotein m arker
3 讨论
生 物信息学是 20 世纪末 随着人 类 基 因组 计 划 的顺 利进 行 而产生 的 ， 它是 以计算机 科学 、 数学 、
生物学 、 物理 学等多学科为理 论 基础形成 的 一 门交叉 性科学 ， 在新基 因的克隆 ， 结构分析以及 功能预
测 中发挥重要作用 。
本研究 中采用 了多种生 物信息学方法对黄瓜 M A P K 基 因 cD N A 序列和编码 的蛋 白进行分析 。 通 过
B last分析发现 ~ N M A P K 与多个物种 的 M A P K 基 因同源性很 高 ， 并且 具有 M A P K 的典型结构 ， 含有 1 1
个保守的蛋 白激酶亚 区 ， 在第Ⅶ 和第Ⅷ 亚 区之 间有 一 个非常保守的 T E Y 基 序 。
转 录 因子 是结合在 目的基 因特定 D N A 序列上 的蛋 白质 ， 它通 过增 强 或抑制 基 因 的转 录 效率来
调控 基 因 的表达 水平 (R iafio — P ach6n et a1． ， 2007 )， 真核生 物 的基 因表达 调 控 主要 是在转 录水平进
行 。
利用 P lantC are 软件分析发现该 基 因序列 正 链 和 反 链 上 具 有脱落酸诱导 (A B R E )、 水杨 酸诱 导
(T C A - elem en t)、 伤害诱导 (W U N — m otif) 等顺 式 作 用 元 件 。 有 研 究 表 明 ， M A P K 基 因 的 表 达 受 高
盐 、 干 旱 、 低温 、 机 械 伤 害 (M izogu chiet a1． ， 1993 ， 1996 ； K iegerlet a1． ， 2000 ； M orris ， 200 1 ；
Z hang & K lessig， 200 l； X iong et a1． ， 2002 )、 水 杨 酸 (Z hang & K lessig， 1997 )、 A B A (Z hang et
a1． ， 2006 )、 活性 氧 (Z hang et a1． ， 2006 ) 等的诱导 。 因此 ， 推测 C sN M A P K 可 能参与黄瓜 逆境 胁
迫 的信号转导 。
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1022 园 艺 学 报 35卷
本研究通过生物信息学分析黄瓜 CsNMAPK基因及其编码蛋白，揭示其具有的重要生物学功能。
构建了原核表达载体并获得目的蛋白，为下一步制备抗体，用免疫学的方法对其功能和分子机制进行
研究，揭示 NO。一胁迫对黄瓜体内伤害机理奠定基础。
References
Fu S F．Chou W C，Huang D D．Huang H J．2002．Transcriptional regulation of a rice mitogen—activated protein kinase gene，OsMAPK4，in re—
sponse to environmental stresses．Plant＆Cell Physiology，43(8)：958—963．
Kiegerl S，Cardinale F，Siligan C，Gross A，Baudouin E，Liwosz A，Ekl f S，Till S，BSgre L，Hirt H，Meskiene I．2000．SIMKK，a mitogen—
activated protein kinase(MAPK)kinase，is a specifc activator of the salt stress—induced MAPK，SIMK．Plant Cel，12：2247—2258．
Mizoguchi T，Gotoh Y，Nishida E，Yamaguchi—Shinozaki K，Hayashida N，1wasaki T，Kamada H，Shinozaki K．1994．Characterization of two
cDNAs that encode MAP kinase homologues in Arabidopsis thaliana and analysis of the possible role of auxin in activating such kinase activi
ties in cultured cels．The Plant Journal，5 (1)：111—122．
Mizoguchi T，Hayashida N，Yamaguchi—Shinozaki K，Kamada H，Shinosaki K．1993．ATMPKs：A gene family of plant MAP kinases inArabidop—
sis tha ／a／／a．FEBS Lett，336：440—444．
Mizoguchi T，Irie K，Hirayanra T，Hayashida N，Yamaguchi—Shinozaki K，Matsumoto K，Shinozaki K．1996．A gene encoding a mitogen—activa—
ted protein kinase and an s6 ribosomal protein kinase by touch．cold and water stress in Arabidopsis thaliana．Proc Natl Acad Sci USA．93：
765—769．
Morris P C．2001．MAP kinase signal transduction pathways in plants．New Phyto1．151：67—89．
Peng Li—xin，Zheng Cheng—chao．Li De—quan，Gu Ling kun，Shu Huai—rui．2003．Cloning and expression characteristics of MaMAPK gene of
Malus micromalus．Jouranl of Plant Physiology and Molecular Biology，29 (5)：431—436．(in Chinese)
彭立新，郑成超，李德全，谷令坤，束怀瑞．2003．西府海棠 (Malus mh：romalus)MaMAPK基因的克隆及表达特性．植物生理与分
子学报，29(5)：431—436．
Riafio—Pach6n D M，Ruzieic S，Dreyer I，Muel|er-Roeber B．2007．PInTFDB：An integrative plant transcription factor database．BMC Bioinforma—
tics，8：42．
Tong You—wei，Chen Dan—fei．1991．Study on form and exploitation way of soil salinization in greenhouse．Acta Horticulturae Sinica，18(2)：
159—162．(in Chinese)
童有为，陈淡飞．1991．温室土壤次生盐渍化的形成和治理途径研究．园艺学报，18(2)：159—162．
Xiong L，Schumaker K S，Zhu J K．2002 Cel signaling during cold，drought and salt stress．Plant Cell，14：165—183．
Xue Ji—cheng，Li Jia-jin，Bi De—yi．1995．Effects of~Jitrate accumulation of soil on growth and manganese concentration ofpepper in protected cul—
tivation．Journal of Nanjing Agriculture University，18(1)：53—57．(in Chinese)
薛继澄，李家金，毕德义．1995．保护地栽培土壤硝酸盐积累对辣椒生长和锰含量的影响．南京农业大学学报，18(1)：53—57．
Zhang A Y，Jiang M Y，Zhang J H，Tan M P，Hu X L．2006．Mitogen—activated protein kinase is involved in abscisic acid—induced antioxidant
defense and acts downstream of reactive oxygen species production in leaves of maize plants．Plant Physiology
， 141，2：475—487．
Zhang S，Klesig D F．1997．Salicylic acid activates a 48．2 kD MAP kinase in tobacco．The Plant Cell，9 (5)：809—824．
Zhang S，Klessig D F．2001．MAPK cascades in plant defense signaling．Trends in Plant Science
， 6：520—527．
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