全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 355 - 360
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 21; 修回日期 : 2007 - 01 - 22
基金项目 : 黑龙江省博士后项目 (LSZH204088) ; 黑龙江省自然科学基金资助项目 (C200526)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qzw303@1261com)
黄瓜抗病基因类似序列 ( RGA) 的同源性分析和
Southern鉴定
丁国华 1, 2 , 池春玉 2 , 周秀艳 1 , 秦智伟 13
(1 东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 150030; 2 哈尔滨师范大学阿城学院 , 哈尔滨 150301)
摘 　要 : 使用 ClustalW和 DNAMAN 310分析了本实验室克隆的 15个黄瓜抗病基因类似序列 (RGA )
之间以及与烟草的 N 基因、亚麻的 L6基因和拟南芥的 RPS2基因之间的同源性 , 并对这些 RGA进行了
PCR和 Southern验证与分析。结果表明 : 15个黄瓜 RGA中 , 核苷酸序列同源性最高的是 CsRGA2、CsR2
GA4和 CsRGA5, 其次是 CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和 CsRGA9, CsRGA1和 CsRGA3也存在较高的同源
性 ; 其余的 RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与 N、L6和 RPS2等抗病基因的产物
之间同源性最高 46% , 最低 22%。根据核苷酸序列设计了 15对特异引物 , 用 PCR方法验证了所有黄瓜
RGA的存在 , 其中 CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物 PCR方法合成了 15个黄瓜 RGA的
地高辛探针 , 与 EcoRⅤ酶解的黄瓜 ‘215’、‘129’和 ‘L18’的基因组 DNA进行 Southern杂交 , 证实了各
个 RGA在基因组上的存在 , 同时发现 , CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝 , CsRGA3是单拷贝 , 其
余为双拷贝。
关键词 : 黄瓜 ; 抗病基因类似序列 ; 同源性 ; Southern杂交
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220355206
Southern Iden tif ica tion and Hom ology Ana lysis of the Resistance Gene
Ana log in C ucum is sa tivus L.
D ING Guo2hua1, 2 , CH I Chun2yu2 , ZHOU Xiu2yan, 1 and Q IN Zhi2wei13
(1 Horticu lture College, N ortheast A gricu ltura l U niversity, Harbin 150030, China; 2A cheng College, Harbin N orm al U niversity,
Harbin 150301, Ch ina)
Abstract: The homology among fifteen RGA s of cucumber cloned in authorspilaboratory and the homology
between the RGA s and N gene from tobacco, and L6 gene from flax, and RPS2 gene from A rabidopsis was ana2
lyzed using ClustalW and DNAMAN 310 p rogram. The fifteen RGA swere identified by PCR and Southern hy2
bridization. The results showed that the highest homology of nucleotide sequence existed between CsRGA2,
CsRGA4 and CsRGA5. H igher homology existed between CsRGA6, CsRGA7, CsRGA8 and CsRGA9, also
existed between CsRGA1 and CsRGA3, Less homology existed in the other RGA s. The am ino acid sequence
homologies of the p roducts translated from the RGA s were also sim ilar to the above. The highest homology,
46% , and the lowest homology, 22% , between the RGA s and three novel disease resistance genes, N , L6
and RPS2, were exhibited. The RGA swere identified using PCR with fifteen pairs of special p rimers based on
the nucleotide sequence of the RGA s. CsRGA3 showed polymorphism in cucumber varieties. The fifteen di2
goxin (D IG) labeling p robe, which p roduced by perform ing special p rimer PCR, hybridized with genom ic
DNA of 215, 129 and L18, digested by EcoRⅤ, using Southern blot method. The existence of the RGA s in
cucumber genome was certified. CsRGA9, CsRGA11 - CsRGA15 had multi cop ies, respectively, CsRGA3
had single copy, the others had two cop ies.
Key words: Cucumber; Cucum is sa tivus L. ; RGA; Homology; Southern hybridization
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
抗病基因类似序列 ( resistance gene analog, RGA ) 是存在于植物基因组中与已分离出来的 30多
个抗病基因某些保守序列存在较高同源性的 DNA片段 (易图永 等 , 2002)。
RGA在植物基因组中大量存在 , 与抗病基因相关的 RGA只是其中一部分。许多研究证明 , 一些
RGA与抗病基因密切连锁 , 甚至就是抗病基因的一部分 (秦跟基 等 , 1999)。不过就现有的 RGA的
研究来看 , NBS类保守域基本只出现在抗病基因当中 , 而 STK ( PK) 类和 LRR类的出现比较复杂。
本实验室利用黄瓜基因组 DNA克隆了 15条 NBS类型的 RGA ( GenBank登录号为 AY555482～
AY555495、AY545993) (丁国华 等 , 2005) , 其中具有 4个完整 NBS亚保守域结构的克隆只有 CsR2
GA5, 具有 3个亚保守域的克隆也仅有 CsRGA2, 其余克隆都只有 kinase1a和 kinase2亚保守域 , 克隆
片段长度为 250 bp左右。15个黄瓜 RGA中 , 有 10个 (CsRGA1～CsRGA9、CsRGA11) 为可翻译序
列 , 另外 5个 RGA内部存在终止密码 , 为不可或不能完全翻译序列。
使用 B lastx在 GenBank上进行同源比对 , CsRGA1～CsRGA11均与甜瓜 (Cucum is m elon L. ) RGA
(B rotman et al. , 2002) 有最高的得分 , 说明在 RGA序列上体现了两者较近的亲缘关系。但全部黄
瓜 RGA与甜瓜 RGA没有出现 100%的相同率 ( identities) , 也说明了两者同科不同属的关系 (丁国华
等 , 2005)。本文报道对该 15条 RGA进一步的同源性分析、PCR验证和 Southern杂交鉴定的结果。
1　材料与方法
111　材料
取本室选育的黄瓜感霜霉病品种 ‘L18’和抗霜霉病品种 ‘129’及其二者的杂交 F1代 ‘215’
为材料 , 取嫩叶用 CTAB法提取基因组 DNA (王关林和方宏筠 , 2002)。
112　PCR反应条件
25μL反应体系包含 10 ×buffer 215μL, 25 mmol·L - 1 MgCl2 210μL, 2 mmol·L - 1 dNTP 215μL,
gDNA模板 (50 ng·μL - 1 ) 1μL, Forward p rimer (5μmol·L - 1 ) 1μL, Reverse p rimer (5μmol·L - 1 )
1μL, Taq DNA 聚合酶 (5 U·μL - 1 ) 012μL, 重蒸水 15μL。dNTP和 Taq DNA聚合酶为 MB I产品 ,
引物由上海生工生物工程公司合成。反应程序 : 95℃预变性 5 m in, 94℃变性 30 s, 退火 30 s (退火
温度见表 1) , 72℃延伸 1 m in, 35次循环 , 72℃延伸 7 m in。根据测序结果 , 使用 Primer Prem ier 510
给每个 RGA设计一对特异引物 (表 1) , 引物设计位置要避开简并引物扩增的序列 , 因此扩增产物的
长度短于原克隆长度。
表 1　用于 PCR和地高辛探针合成的黄瓜 RGA特异引物
Table 1　Spec ia l pr im ers of cucum ber RGA for PCR and D IG2probe syn thesize
引物名称
Name
引物序列 Primer sequence (5′→3′)
正向 Forward 反向 Reverse
退火温度
Ta (℃)
产物长度
Product length ( bp)
CsRP1 GATGCTGCTTTCTACAAGAT GTTAATTCCTCTATCACGAC 4617 131
CsRP2′ GGGTCTGTTATGAGCGAAT GCTTCCATTGCCAAAAGAGTT 4917 287
CsRP3 GCTTTATACAACAAAATCACT GTCCACATTGTCAACCTTC 4512 156
CsRP4 CTAGGGTCTGTTATGAGCGA TCCAGGACGAGAAGTGTCT 4910 223
CsRP5 GGGGAAGACGACAATAGC CTCCCACAACCTTTACAATC 4915 494
CsRP6 GGCCAAGATGGTTTTCAAT CTTTTTTCCTTGCATCTCCTCT 4914 193
CsRP7 CTGTTTGGGTTTGTGTCTCT CTTTGGCCATGCATCTTC 4714 145
CsRP8 GGCAAAAGCAGTTTTCAACC AATACCTTTTCCCTTCCAGC 4913 197
CsRP9 ATCATGAGGAGATCAAAAG TTTTACCTCGCATCACTTT 4517 174
CsRP10 GCATGTCGTATCAATGGAA GATCGGGGAATGATTCAAA 4713 193
CsRP11 TCCCCAACATCAACTCCCT TTTCCTGCATCCGAACGAC 5418 147
CsRP12 GGCGGTGTTGGAAAAACTAC ACGTCGTCGAGTACCAAC 4719 164
CsRP13 CTACTAGACGGCCTCACT CAATGTAGATGGGTTTCC 4812 191
CsRP14 CGAGTTGGATCGGACAGC TGGGACGGAAGGATTTGA 5411 190
CsRP15 GGTAAGACTACGTTTAGCAGT CGAGGACCATAATCAAATAC 4716 148
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　2期 丁国华等 : 黄瓜抗病基因类似序列 (RGA) 的同源性分析和 Southern鉴定 　
113　Southern杂交
使用表 1引物用 PCR反应法制备探针。选用在所有黄瓜 RGA中没有酶切位点的 EcoRⅤ (购自
TaKaRa公司 ) 酶切基因组 DNA。
电泳转膜按分子克隆手册进行。杂交的具体步骤按 D IG DNA Labeling and Detection Kit试剂盒
(购自 Roche公司 ) 的说明进行。
114　同源性比对
使用 DNAMAN 310和 ClustalW进行序列同源性比对分析。
2　结果与分析
211　与抗病基因的同源性分析
　　使用 DNAMAN 310将 10个可读黄瓜 RGA的
氨基酸序列与烟草的 N 基因、拟南芥的 R PS2基
因和亚麻的 L6基因等抗病基因的蛋白质产物进行
比对 , 相似率都比较低 (表 2 )。表现较高的是
CsRGA1、CsRGA3与 N 基因、L6基因之间。从相
似率的平均值来看也是黄瓜 RGA与 N 基因和 L6
基因较与 R PS2基因有更高的相似率。
使用 ClustalW分别建立上述序列的氨基酸同
源性系统树 (图 1)、核苷酸同源性系统树 (图
2) 和氨基酸序列比对图 (图 3)。
比较两个系统树可以看出 , 在氨基酸水平上 ,
所有序列分为 3类 : CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8、
表 2　黄瓜 10个 RGA与 3个已知抗病基因产物的相似率
Table 2　The sim ilar ities between ten cucum ber RGA s
and 3 known genes ( % )
RGA class N L6 R PS2
CsRGA1 46 40 26
CsRGA2 33 29 22
CsRGA3 32 47 25
CsRGA4 33 29 23
CsRGA5 31 26 22
CsRGA6 25 19 32
CsRGA7 29 25 30
CsRGA8 31 29 32
CsRGA9 34 32 32
CsRGA11 33 34 25
平均值 Mean 3217 31 2619
CsRGA9和 R PS2为一类 ; CsRGA1、CsRGA3和 L6为一类 ; CsRGA2、CsRGA4、CsRGA5和 N 为一
类。CsRGA11又可以与后两类归在一大类中 , 与第一类平行存在。
在核苷酸水平上 , 上述分类仍然存在 , 5个不可翻译 RGA另立一类 , 同时也可归入到所在的第
一类中 , 当然 , 相互之间的同源性依然很低。使用 Clustal W 对上述序列的氨基酸序列进行逐个比较
(图 3) , 被归在同一类的序列有较多的相同氨基酸。如 L6与 CsRGA1和 CsRGA3的第 9、10、11、
13、114、15、16、20、23、24、25、30、37、39、41、42、44、45位的 20多个氨基酸完全相同 (不
图 1　使用 C lusta lW 进行氨基酸序列比对的树型图
F ig. 1　The phylogenetic tree of am ino ac id sequence con structed by C lusta lW program
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图 2　使用 C lusta lW 进行核苷酸序列比对的树型图
F ig. 2　The phylogenetic tree of nucleotide sequence con structed by C lusta lW program
图 3　黄瓜 10个 RGA s与 N、RPS2和 L 6基因的氨基酸同源性
‘3 ’为单个完全保守氨基酸位置 ; ‘: ’为强保守集团的位置 ; ‘ - ’为空位。
F ig. 3　Hom ology of am ino ac ids am ong 10 RGA s of cucum ber, N , RPS2 and L 6 genes
‘3 ’indicates positions which have a single, fully conserved residue; ‘: ’indicates positions which belong
to a strong conserved group; ‘ - ’means gap s.
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　2期 丁国华等 : 黄瓜抗病基因类似序列 (RGA) 的同源性分析和 Southern鉴定 　
包括两端保守域 ) , 而在保守域 P2loop中 L6的氨基酸序列是 GGIGKTT而不是 GGVGKTT。R PS2与黄
瓜 RGA之间的相同氨基酸序列较少 , 仅在 6个表注 ‘: ’位置与 CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和 CsR2
GA9有完全相同的氨基酸。N 基因与 CsRGA2、CsRGA4和 CsRGA5之间可以找到较多的相同氨基酸
序列 , 如不在引物扩增范围内的第 8、9、10位都是 I (异亮氨酸 )、A (丙氨酸 ) 和 R (精氨酸 ) 序
列 , 在 kinase 2保守域 , N有一个 LDD ID而不是 LDDVD的单个氨基酸的差异 , 在 kinase 3a保守域 , Cs2
RGA2有一个 IVTTR而不是 IITTR的单氨基酸差异。值得注意的是 , 在 kinase 3a ( IITTR) 和 HD ( GL2
PLAL) 两个保守域之间 , 被比对的所有序列片段基本没有相同的氨基酸序列 , 反映了此区段的高度变
异特征。
使用 ClustalW还进行了黄瓜 RGA和甜瓜 RGA之间的氨基酸序列比对 (图 4) , 多数甜瓜的 RGA
与黄瓜相应类别的 RGA 有同类关系 , 但 AF354504和 AF354513有较大的离散距离 , AF354515和
AF354517也有一定的离散 , 反映出克隆的甜瓜 RGA比较丰富 , 或者被克隆出 RGA比较全面。
图 4　使用 C lusta lW 进行黄瓜和甜瓜 RGA氨基酸同源性比对的树型图
F ig. 4　The phylogenetic tree of RGA am ino ac id of cucum ber and m elon con structed by C lusta lW program
212　黄瓜基因组 D NA中 RGA的 PCR鉴定
用特异引物 (表 1) 在包括克隆供体在内的 11个主要黄瓜品种的基因组 DNA中进行 PCR扩增。
图 5显示 , 15个被克隆的 RGA中 , 只有 CsRGA3在 L18和津春 4号中没有扩增 , 其他品种均出现
特定扩增产物 , 显示多态性 ; 其余 CsRGA在 11个黄瓜品种均有扩增 , 说明其在基因组 DNA中存在。
图 5　C sRGA3 ( A) 和 C sRGA2 ( B) 在 11个黄瓜品种中 PCR扩增
M. DL 2000; 1. 长春密刺 ; 2. D0120; 3. 津绿 5号 ; 4. L18; 5. 651;
6. 津春 3号 ; 7. 津春 4号 ; 8. 中农 208; 9. 649; 10. 129; 11. 1058 。
F ig. 5　PCR am plif ied products w ith C sRGA3 ( A) and C sRGA2 ( B) on 11 cucum ber var ieties
M. DL 2000; 1. Changchunm ici; 2. D0120; 3. J inlü5; 4. L18; 5. 651;
6. J inchun 3; 7. J inchun 4; 8. Zhongnong 208; 9. 649; 10. 129; 11. 1058.
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213　黄瓜 RGA的 Southern杂交鉴定
图 6是黄瓜 RGA的 Southern杂交的其中 6个图谱。根据杂交结果可知 , 黄瓜 15个 RGA在黄瓜基因
组 DNA上以多拷贝存在的分别是 CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15, 以 3个拷贝存在的是 CsRGA8, 以双
拷贝存在的是 CsRGA1、CsRGA2、CsRGA4～CsRGA7和 CsRGA10, 只有 CsRGA3以单拷贝的形式存在
(图中未显示 )。
图 6　部分黄瓜 RGA的 Southern杂交图谱
1、2、3泳道分别是 ‘L18’、‘215’和 ‘129’的 gDNA; A～F分别是 CsRGA12、
CsRGA11、CsRGA14、CsRGA10、CsRGA5和 CsRGA8的探针杂交图。
F ig. 6　Southern hybr id iza tion pa ttern s of the partia l RGA of cucum ber
Lanes of 1, 2 and 3 rep resent DNA of variety‘L18’, ‘215’and‘129’, respectively; A - F p ictures rep resent hybridizing
results of p robes of CsRGA12, CsRGA11, CsRGA14, CsRGA10, CsRGA5 and CsRGA8, respectively.
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